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基于CRISPR/Cas9的一种胞嘧啶碱基编辑器的初步探究

2020-12-02阅读(947)

基于CRISPR/Cas9的一种胞嘧啶碱基编辑器的初步探究

论文摘要

CRISPR/Cas9技术在目标位点引入双链DNA断裂（DSBs）作为修复基因的第一步,很容易导致基因缺失等突变。因此,研究人员开发了一种新的基因组编辑方法-碱基编辑器。它可以直接将一个碱基或碱基对转换成另一个碱基对,从而在细胞中有效地诱导点突变,此外,CRISPR/Cas9衍生的碱基编辑也提高了修复基因组中点突变的效率。本课题通过将人源的胞苷脱氨酶（AID）分别替代CRISPR/Cas9蛋白中的HNH结构域和RuvC-like结构域,重新设计一种新型的碱基编辑器,检测这种新型碱基编辑器的碱基编辑窗口和编辑效率。首先尝试对碱基编辑器进行体外功能实验,通过将spCas9中的HNH结构域和RuvC-like结构域分别替换为AID蛋白,获得8种dCas9重组质粒,然后在蛋白N端连接上UGI序列,获得dCas9-AID蛋白;同时在体外设计出特定的的sgRNA,通过体外转录纯化等步骤获得100bp的sgRNA;根据sgRNA的序列设计底物DNA序列,通过PCR扩增获得大量的DNA片段。使用原核表达系统体外纯化碱基编辑蛋白,将重组蛋白分别进行GST亲和层析、Ni亲和层析、肝素琼脂糖凝胶层析（Heparin柱）和阴离子交换层析（S柱）,对存在紫外吸出的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳,将纯化获得的融合蛋白与预先设计好的sgRNA和底物DNA混合,检测碱基编辑器在体外的活性。实验结果显示蛋白未能正确表达,体外功能实验未达到预期目标。然后以pCMV-BE4max为模板改造获得细胞内表达载体,共得到12种不同的重组载体,并通过查阅文献确定FMN1基因为目的位点,根据目的基因序列设计sgRNA并连接着pU6载体中,将构建出的真核表达载体共转入293T细胞中,检测碱基编辑器在体内的功能,通过WB和基因组测序分析,发现碱基编辑蛋白在细胞中能正常表达,将细胞基因组提取后进行PCR扩增,将目的基因片段进行测序,未能检测出蛋白具有碱基编辑的能力。通过本次实验证实了对CRISPR/Cas9蛋白进行结构域的替换是不可行的,可能原因是由于蛋白结构破坏导致蛋白功能异常,无法识别特定位点并进行碱基编辑。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  •   1.1 课题研究的背景和意义
  •   1.2 基因编辑技术的发展
  •   1.3 单碱基编辑器简介
  •     1.3.1 胞嘧啶碱基编辑器的发展
  •     1.3.2 腺嘌呤碱基编辑器的发展
  •   1.4 单碱基编辑器的应用
  •     1.4.1 诱导点突变
  •     1.4.2 有丝分裂后细胞的碱基编辑
  •     1.4.3 碱基编辑引入终止密码子
  •     1.4.4 制作模型生物
  •     1.4.5 作为信号记录器
  •     1.4.6 植物的碱基编辑
  •   1.5 本课题主要研究内容
  •     1.5.1 构建蛋白表达载体
  •     1.5.2 构建sgRNA载体
  •     1.5.3 体外实验
  •     1.5.4 细胞内实验
  •   1.6 技术路线
  • 第2章 材料与方法
  •   2.1 质粒细胞与菌株
  •   2.2 蛋白表达相关材料
  •   2.3 实验试剂
  •     2.3.1 克隆所需试剂
  •     2.3.2 蛋白表达相关试剂
  •     2.3.3 其他相关试剂
  •   2.4 实验仪器
  •   2.5 获取目的序列
  •   2.6 PCR扩增目的基因与载体
  •     2.6.1 琼脂糖凝胶电泳
  •     2.6.2 胶回收步骤
  •   2.7 酶切与连接
  •   2.8 重组质粒的转化
  •     2.8.1 TB法制备感受态细胞T1 的制备
  •   2.9 阳性克隆筛选
  •   2.10 重组质粒的提取与鉴定
  •     2.10.1 质粒提取步骤
  •   2.11 蛋白纯化
  •   2.12 SgRNA的体外纯化
  •     2.12.1 体外转录操作步骤
  •     2.12.2 体外纯化步骤
  •   2.13 T7 聚合酶的提取
  •   2.14 底物DNA的扩增与回收
  •   2.15 细胞转染
  •   2.16 处理细胞
  •   2.17 蛋白免疫印迹（Western Bloting）
  •   2.18 提取基因组
  • 第3章 碱基编辑器体外功能测定
  •   3.1 体外重组质粒的构建
  •   3.2 体外sgRNA和底物DNA表达载体的构建
  •   3.3 融合蛋白的表达与纯化
  •     3.3.1 DE-HNH-dCas9 融合蛋白肝素琼脂糖凝胶层析
  •     3.3.2 DE-HNH-dCas9 融合蛋白过S柱
  •     3.3.3 DE-REC-dCas9 融合蛋白过Heparin柱
  •     3.3.4 不同处理方法纯化DE-REC-dCas9-S-A融合蛋白
  •     3.3.5 不同感受态细胞表达DE-REC-dCas9-S-A-S融合蛋白
  •   3.4 Wb检测蛋白表达
  •   3.5 本章小结
  • 第4章 碱基编辑器细胞内功能测定
  •   4.1 细胞内表达载体的构建
  •   4.2 检测碱基编辑器的功能
  •     4.2.1 SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白表达
  •     4.2.2 WB检测蛋白表达
  •     4.2.3 检测蛋白的细胞内编辑效率
  •   4.3 本章小结
  •   4.4 讨论
  • 结论
  • 展望
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 徐登辉

    导师: 黄志伟

    关键词: 系统,碱基编辑器,胞嘧啶脱氨酶,编辑效率

    来源: 哈尔滨工业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 哈尔滨工业大学

    分类号: Q78

    DOI: 10.27061/d.cnki.ghgdu.2019.003552

    总页数: 74

    文件大小: 2131K

    下载量: 153

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