论文摘要
微生物是天然产物的重要来源,随着合成生物学的快速发展和基因组测序技术的进步,越来越多的微生物基因组测序工作已完成,人们在这些微生物基因组发现了大量的微生物次级代谢产物生物合成基因簇尚未被开发和研究,但是很多微生物很难进行遗传操作或者在实验室内无法培养。将基因簇转入遗传背景清晰、易操作的宿主菌进行异源表达是开发生物合成资源的一种重要手段。但是微生物次级代谢产物基因簇一般大于20 kb,很难通过PCR的方式获得。获得基因簇的传统方法是构建基因组文库,但是周期长、操作复杂,不能满足高通量克隆基因簇的要求。符军等于2012年根据RecE和RecT蛋白能高效介导线性DNA分子之间发生同源重组的特性,开发了能够将目的DNA片段从基因组直接捕获至载体上的直接克隆技术。目前RecET直接克隆技术已被广泛应用于次级代谢产物基因簇的异源表达研究。次级代谢产物在异源表达时经常需要对表达载体进行修饰以添加基因转移元件、插入正调控基因、敲除负调控基因等。基于酶切和连接的传统DNA重组方法由于受到酶切位点和DNA分子大小的限制,难以完成这些遗传修饰。张友明等于1998年利用大肠杆菌Redαβ蛋白能够高效介导线性DNA分子和环状DNA分子之间发生同源重组的特性,建立了不受DNA分子大小和限制性酶切位点制约的DNA重组工程技术(Recombineering)。该技术能够精确、高效地对质粒、黏粒和细菌人工染色体等DNA分子进行基因插入、基因敲除、点突变和模块替换等操作,尤其适合天然产物基因簇的遗传改造。本研究将RecET DNA直接克隆系统和Redαβ DNA修饰系统整合到一个大肠杆菌宿主中,并通过克隆载体和DNA转移元件的标准化,建立了生物合成途径高通量直接克隆、修饰和异源表达的技术平台。在该技术平台中,我们针对不同大小基因簇和不同DNA序列特点构建了便于操作的直接克隆载体,同时将接合转移和转座元件、位点特异性重组元件、广宿主多拷贝复制子两侧的序列进行了标准化,使其都能通过Redαβ重组快速插入上述所有克隆载体中,使一个载体可以适用于细菌接合转移,转座和位点特异性重组等不同遗传操作手段,便于快速的进行异源表达研究。该技术平台实现了生物合成途径克隆、转移和异源表达的无缝对接,只需要一周就能完成生物合成途径的克隆及基因转移元件的插入,大大简化了DNA克隆、修饰、转移和异源表达的流程。利用该技术平台,我们对波赛链霉菌ATCC 27952、刺糖多孢菌NRRL18395和阿维链霉菌DSM 46492基因组中的次级代谢产物基因簇进行了克隆和异源表达研究。土壤和海洋宏基因组中的次级代谢产物基因簇由于浓度低而很难通过直接克隆获得,从头合成是克隆宏基因组中基因簇的有效方法,但是该方法对DNA组装效率的要求较高。本研究通过结合寡核苷酸体外退火和RecET介导的线性DNA分子间的同源重组建立了头合成基因簇的方法。该方法的策略是:(1)首先将10个两端带有20 nt互补配对序列的60 nt寡核苷酸组装成420 bp的双链DNA片段;(2)把10个两端带有40 bp同源序列的420 bp片段组装成4020 bp的中等长度DNA片段;(3)把两端带有40 bp同源序列的4020 bp片段组装成最终目的基因簇。我们利用该方法从头合成了在海鞘共生蓝细菌中发现的非核糖体多肽patellamide A的12.7 kb基因簇,并在大肠杆菌中进行了异源表达研究。本论文构建的基于Red/ET同源重组的基因簇克隆、修饰和异源表达技术平台为微生物基因组的开发利用提供了便利。
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摘要ABSTRACT缩略词中英文对照表第1章 序论 1.1 天然产物的生物合成 1.1.1 聚酮合酶 1.1.2 非核糖体肽合成酶 1.2 DNA重组 1.2.1 Red/ET同源重组 1.2.2 位点特异性重组系统 1.2.3 转座重组系统 1.2.4 ccdB反向筛选系统 1.3 天然产物生物合成基因簇的挖掘与激活 1.3.1 原位激活生物合成基因簇 1.3.2 异源表达生物合成基因簇 1.3.3 插入启动子激活生物合成基因簇 1.3.4 宏基因中生物合成基因簇的研究进展 1.4 本课题开展思路与研究内容第2章 构建生物合成基因簇克隆、修饰和异源表达的平台 2.1 引言 2.2 实验材料 2.2.1 本研究所用菌株和质粒 2.2.2 分子生物学试剂 2.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序 2.2.4 DNA序列分析软件 2.2.5 仪器设备 2.3 细菌基因组的提取实验方法 2.3.1 Red/ET同源重组标准遗传操作程序 2.4 结果与分析 2.4.1 构建多功能、可控的大肠杆菌宿主 2.4.2 构建了标准化的直接克隆载体 2.4.3 构建标准化的链霉菌结合转移和整合元件 2.4.4 构建标准化的革兰氏阴性菌转移和转座元件 2.4.5 构建了标准化的革兰氏阴性菌广谱型复制子元件 2.5 本章讨论 2.5.1 Red/ET同源重组直接克隆和修饰基因簇的优越性与缺点 2.5.2 直接克隆载体的选择与制备 2.5.3 转座和结合转移元件的选择 2.5.4 直接克隆中遇到的问题及解决方法第3章 波赛链霉菌ATCC 27952中基因簇直接克隆与异源表达 3.1 引言 3.2 实验材料 3.2.1 本研究所用菌株和质粒 3.2.2 分子生物学试剂 3.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序 3.3 实验方法 3.3.1 波赛链霉菌ATCC 27952基因簇信息的分析 3.3.2 波赛链霉菌ATCC 27952基因组的提取与酶切 3.3.3 构建直接克隆载体 3.3.4 用RecET同源重组技术直接克隆Cluster7 3.3.5 利用Redαβ同源重组技术添加结合转移元件 3.3.6 利用Redαβ同源重组技术添加启动子 3.3.7 基因簇的接合转移 3.3.8 链霉菌重组子检测 3.3.9 链霉菌重组子的发酵 3.3.10 化合物的提取与HPLC-MS分析 3.4 结果与分析 3.4.1 基因簇的直接克隆与酶切鉴定 3.4.2 用Redαβ同源重组技术添加结合转移元件 3.4.3 利用Redαβ同源重组技术添加启动子 3.4.4 基因簇接合转移到链霉菌中进行的异源表达 3.4.5 化合物的提取与HPLC-MS分析 3.5 本章讨论 3.5.1 基因簇直接克隆和修饰 3.5.2 Cluster 7基因簇异源表达产物的分离纯化第4章 ExoCET直接克隆技术的原理与应用 4.1 引言 4.2 实验材料 4.2.1 本研究所用菌株和质粒 4.2.2 分子生物学试剂 4.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序 4.3 实验方法 4.3.1 ExoCET直接克隆原理的探索 4.3.2 基因簇的生物信息学分析 4.3.3 基因组的提取与酶切 4.3.4 大片段生物合成基因簇直接克隆载体的构建 4.3.5 大片段生物合成基因簇的直接克隆 4.3.6 生物合成基因簇的修饰、发酵与分析 4.4 结果与分析 4.4.1 联合体外退火和RecET重组促进DNA的重组 4.4.2 基因簇直接克隆载体的构建 4.4.3 细菌基因组的酶切 4.4.4 生物合成基因簇的直接克隆 4.4.5 基因簇添加结合转移元件 4.4.6 基因簇添加启动子 4.4.7 提取转化子的基因组进行PCR检测 4.5 本章讨论 4.5.1 基因簇的直接克隆、修饰与异源表达 4.5.2 ExoCET重组技术第5章 联合体外退火和RecET同源重组系统从头合成基因簇 5.1 引言 5.2 实验材料 5.2.1 本研究所用菌株和质粒及其基因型和相关特征见表5-1 5.2.2 分子生物学试剂 5.2.3 寡核苷酸合成和DNA测序 5.3 实验方法 5.3.1 oligo重组模型的设计 5.3.2 Oligo的体外处理 5.3.3 Oligo重组线性载体的制备 5.3.4 细胞感受态的制备 5.3.5 菌落PCR鉴定oligo重组的片段大小 5.3.6 DNA测序检测oligo重组的片段序列是否正确 5.3.7 利用ExoCET进行DNA多片段的组装 5.4 结果与分析 5.4.1 RecET重组酶诱导多个oligo重组 5.4.2 RecET重组酶的拷贝数影响oligo重组的正确率 5.4.3 两步法合成Hemagglutinin基因（1683 bp） 5.4.4 三步法合成PatellamideA基因簇（12,689 bp） 5.5 本章讨论 5.5.1 RecET同源重组系统用于从头合成基因簇 5.5.2 影响Oligo重组的因素第6章 研究结论与展望 6.1 成功构建了生物合成基因簇的直接克隆、修饰和异源表达的一体化工作平台 6.2 ExoCET重组技术极大提高了直接克隆大片段生物合成基因簇的效率 6.3 联合体外退火与RecET同源重组系统从头合成基因簇 6.4 未来的研究工作及展望参考文献致谢攻读学位期间发表的学术论文和参加科研情况附录学位论文评阅及答辩情况表
文章来源
类型: 博士论文
作者: 李振
导师: 张友明
关键词: 重组,基因簇,基因合成,天然产物,基因工程
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 山东大学
分类号: Q78
总页数: 158
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标签：重组论文; 基因簇论文; 基因合成论文; 天然产物论文; 基因工程论文;
基于Red/ET同源重组的基因簇克隆、修饰和异源表达平台的构建与应用
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