一、日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肿与Th1/Th2细胞因子水平的动态变化（论文文献综述）
卢金[1]（2021）在《小柴胡汤干预日本血吸虫致肝纤维化的实验研究》文中认为目的:通过细胞实验、动物实验以及血吸虫成虫体外干预实验,探究小柴胡汤及其主要成分对血吸虫致肝纤维化的作用机制,为应用小柴胡汤治疗血吸虫肝纤维化奠定理论基础,为筛选并发现用于血吸虫肝纤维化的新药提供技术支撑。方法:1.小柴胡汤及其主要成分对体外培养肝星状细胞的作用体外培养人肝星状细胞系LX-2细胞,在TGF-β1刺激活化后,分别用小柴胡汤、柴胡皂苷A（SSA）、黄芩苷（BC）作用于细胞。通过MTT法和EDU法检测细胞增殖率,采用流式细胞术观察细胞凋亡情况,通过RT-PCR和Western Blot检测纤维化相关分子COL-I、COL-Ⅲ、α-SMA的表达水平。2.小柴胡汤及其主要成分干预日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的作用通过人工感染,建立日本血吸虫感染小鼠肝纤维化动物模型,尾蚴感染小鼠6周后,通过灌胃,分别给予小柴胡汤、SSA、BC,干预4周后,剖杀取材;病理切片HE染色和Masson染色观察小鼠肝脏病变,分析虫卵肉芽肿面积和胶原纤维沉积量;流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg细胞数量;通过ELISA法,检测小鼠血清IL-6、IL-10、TGF-β1和TNF-α等细胞因子的表达量;采用RT-PCR和Western Blot方法,检测小鼠肝脏COL-I、COL-III、α-SMA、TGF-β1的表达量。3.小柴胡汤及其主要成分干预体外培养血吸虫成虫的研究人工感染实验家兔,并于感染6周后收集肠系膜静脉丛成虫,进行体外培养,给予不同浓度小柴胡汤、SSA、BC干预,考察血吸虫成虫的存活率、活动力和产卵数量;通过RT-PCR方法,检测用药后虫体体表水通道蛋白sj AQP m RNA的表达水平,探讨药物作用于虫体体表蛋白进而影响虫体活力的机制。结果:1.小柴胡汤及其主要成分对体外培养肝星状细胞的作用小柴胡汤、SSA、BC可剂量依赖性抑制LX-2细胞的增殖（P<0.05）,其半数抑制浓度分别为0.46%、2.65μg/m L、11.72μg/m L;促进活化的肝星状细胞发生凋亡（P<0.05）;抑制活化的LX-2细胞COL-I、COL-III、α-SMA的表达（P<0.05）。2.小柴胡汤及其主要成分干预日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的作用与血吸虫感染未用药（模型）组相比,经小柴胡汤（0.01 m L/kg·d）、SSA（10mg/kg·d）、BC（250 mg/kg·d）干预4周后,小鼠生存状态较好。剖杀后,取小鼠肝脏和脾脏,肝脏指数分别为8.76±1.42、8.05±1.52、8.37±1.74,与模型组（9.91±2.42）相比,差异无统计学意义（P>0.05）;脾脏指数分别为1.67±0.51、1.59±0.43、1.72±0.53,与模型组（2.30±0.76）相比显着下降,差异有统计学意义（P<0.05）。肝脏病理结果显示,肝脏内单个虫卵肉芽肿面积分别减小68%、50%、44%,胶原纤维沉积面积分别减少42%、25%、12%。脾脏流式细胞结果显示,BC可显着提高小鼠CD4+细胞比例（P<0.05）和CD4/CD8比值（P<0.05）;小柴胡汤、SSA、BC干预均可提高小鼠体内调节性T细胞的比例（P<0.05）。血清细胞因子检测结果表明,小柴胡汤、SSA、BC干预可下调小鼠Th2型免疫相关细胞因子IL-6、IL-10、TGF-β1和炎症因子TNF-α的表达（P<0.05）。RT-PCR和Western Blot结果显示,治疗后小鼠肝脏COL-I、COL-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1表达均降低（P<0.05）。3.小柴胡汤及其主要成分对体外培养血吸虫成虫生存状态的影响复方小柴胡汤随着浓度增加（0.1%、1%、5%）,对体外培养成虫存活率有抑制作用,但无统计学意义（P>0.05）;在5%小柴胡汤作用组,观察到对成虫活动力有显着抑制作用（P<0.05）;在1%与5%小柴胡汤作用组,观察到成虫产卵量受到显着抑制（P<0.05）。而单体成分SSA（1μg/ml）作用1 h即可显着降低成虫的活动力和存活率（P<0.05）,同时还可降低雌虫的产卵能力（P<0.05）。实验未观察到BC对血吸虫成虫的生存状态和产卵能力具有显着影响。RT-PCR结果显示,与对照组相比,成虫经复方小柴胡汤作用后,sj AQP表达未见显着变化。成虫经SSA作用24 h后sj AQP表达上调,作用48 h后sj AQP表达下调（P<0.05）。而在1μg/ml BC作用24 h后,sj AQP表达上调,48 h后恢复至常态化。结论:通过细胞实验和动物实验,本研究证实了小柴胡汤及其主要成分可有效干预血吸虫致肝纤维化的进程,其具体的作用机制为:小柴胡汤及其主要成分可抑制肝星状细胞的活化增殖及纤维化相关分子COL-I、COL-Ⅲ、α-SMA的表达,诱导活化的HSC发生凋亡;上调小鼠Treg细胞,抑制血清中IL-6、IL-10、TGF-β1等Th2型细胞因子的表达,同时抑制小鼠肝脏中COL-I、COL-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1的表达,从而缓解虫卵引起的肉芽肿和纤维化症状。进一步观察药物对体外培养血吸虫成虫的影响,发现小柴胡汤及其单体成分SSA可抑制成虫的活动力和繁殖力,从而间接发挥抗血吸虫肝纤维化的作用。其具体机制可能是SSA通过干预虫体体表蛋白sj AQP的表达,影响成虫的生存和繁殖。综上,小柴胡汤复方及其单体成分,具有抑制血吸虫肝纤维化的作用,可以为抗血吸虫肝纤维化新型药物的研发和筛选奠定基础。
黄文铃[2]（2020）在《日本血吸虫组织蛋白酶L3与甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫功能分析》文中指出血吸虫病是一种流行甚广、危害严重的人畜共患病。抗血吸虫病疫苗的研制对预防血吸虫病发挥重要作用。研究发现,血吸虫肺期童虫是宿主免疫攻击的主要靶标,其抗原分子被视为最佳的疫苗候选因子。本实验室前期研究已经筛选出腺苷酸激酶1（AK1）、组织蛋白酶L3（CL3）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）等105个在宿主因子影响下呈差异表达的日本血吸虫（Schistosoma japonicum,S.j）肺期童虫基因,其中SjAK1基因表达的重组蛋白可诱导50%的减虫率与40%的减卵率,但SjCL3与SjGAPDH基因的功能目前尚不明确。为此,本研究克隆表达了SjCL3与SjGAPDH,观察其在日本血吸虫不同发育时期的表达及其水平以及组织学定位,研究其单独及联合免疫对小鼠抗日本血吸虫感染的能力与可能的机制,探索其在免疫逃避及I型糖尿病治疗中的作用,为探索血吸虫与宿主的相互作用关系、抗虫靶点及血吸虫病疫苗研究增添了新内容,不仅既有理论意义,也具有现实意义。SjCL3与SjGAPDH基因经克隆表达后发现,rSjCL3与rSjGAPDH均为具活性的蛋白,酶活性分别为26822 U/g与3220 U/g;将重组蛋白分别免疫新西兰大白兔后,获得的多克隆抗血清anti-rSjCL3与anti-rSjGAPDH抗体滴度分别为1:160000与1:320000。免疫荧光化学结果显示,SjCL3主要定位于虫卵卵壳、消化道、虫体体被以及部分肌肉层;SjGAPDH主要定位于虫卵卵壳、虫体体被及绝大部分肌肉层。荧光定量PCR结果发现,SjCL3及SjGAPDH在血吸虫的各个发育阶段均有表达,其中SjCL3在虫卵中表达水平最高,在10天童虫中最低;SjGAPDH的表达水平在雄虫中最高,在18天童虫中最低。将rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠后,可诱导小鼠分别产生30.5%、37.8%、65.6%的减虫率与31.7%、38.1%、70.9%的减卵率,其肝脏肉芽肿面积减少率分别为29.5%、41.1%、74.6%,肝纤维化面积减少率分别为35.4%、52.4%、76%;但若无弗氏佐剂的作用,rSjCL3与rSjGAPDH联合免疫仅可诱导小鼠产生12.1%的减虫率与14.2%的减卵率,提示:rSjCL3不能发挥佐剂样作用。流式细胞术结果显示,rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠后,其Tregs百分率分别为3.94%、3.68%、2.61%,与弗氏佐剂对照组比较,联合免疫组Tregs百分率下降显着（P<0.05）;ELISA结果发现,3组小鼠的血清IgG1/IgG2a比值分别为0.8、0.71、0.48,均<1,表明免疫后小鼠均为Th1型偏移的免疫反应;体外研究显示,免疫血清介导的巨噬细胞对童虫的杀虫率分别是12.05%、14.08%、18.86%,与阴性血清组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。体外观察rSjCL3与rSjGAPDH在抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）对童虫的杀伤作用时发现,rSjCL3与rSjGAPDH均可通过减少巨噬细胞对童虫的黏附而破坏ADCC的杀虫作用;而且加入相应的酶抑制剂后,杀虫效果均有恢复,分别由8.17%上升至15.46%与6.1%上升至19.49%,黏附在童虫表面的巨噬细胞数分别由2.45上升至5.75个与1.43上升为6.57个,差异均具统计学意义（P<0.05）。当分别用SjCL3与SjGAPDH的dsRNA单独及联合抑制目的基因后,机械转变童虫的存活率分别为72.7%、62.5%、56.5%,与对照组比较,SjCL3组无差别,其余2组的差别显着（P<0.05）;21天童虫的存活率分别为92.77%、91.83%、90.56%,差异无统计学意义（P>0.05）;42天成虫的存活率分别为100%、96.15%、93.33%,差异也均无统计学意义（P>0.05）。此外,还构建了I型糖尿病小鼠模型,探索了rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫对糖尿病小鼠的治疗作用,结果显示:各组小鼠的血糖水平无差别（P>0.05）,血清IgG1/IgG2a比值分别为0.65、1.06、0.51。综上所述,本研究克隆表达了具有活性的肺期童虫rSjCL3与rSjGAPDH,发现两种蛋白分别定位于卵壳、消化道、体被、部分肌肉层以及与卵壳、体被及绝大部分肌肉层,表达水平最高的部位分别是虫卵与雄虫;它们能在逃避宿主免疫中发挥重要作用;重组蛋白免疫小鼠后,rSjCL3不能发挥佐剂样作用,但在弗氏佐剂的作用下其与rSjGAPDH联合可诱导小鼠产生65.6%的减虫率与70.9%的减卵率,值得进一步研究。
仲梓溶[3]（2020）在《ICOSL/ICOS调控日本血吸虫感染小鼠肝纤维化过程中HSCs凋亡相关信号通路的分子机制》文中进行了进一步梳理血吸虫病是主要由血吸虫尾蚴感染宿主引起的一种重大的传染性寄生虫疾病,而其致病机制主要是虫卵沉积肝脏引起虫卵肉芽肿及继发肝纤维化,导致血吸虫性肝硬化。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）作为肝脏的非实质细胞在肝纤维化形成过程中是主要的效应细胞,控制肝纤维化的方法之一为促进活化的HSCs发生凋亡,而线粒体依赖途径和死亡受体途径（Fas/FasL途径、TNFR途径、TRAIL途径）是目前发现的参与HSCs凋亡的重要途径。已有很多深入的研究涉及肝星状细胞增殖和活化的信号转导通路,而肝纤维化进展过程中HSCs凋亡发生及其相关信号通路的分子尚未阐明。课题组前期实验发现,ICOS转基因（ICOS-Tg）小鼠的肝纤维化水平以及HSCs活化水平显着高于野生型对照FVB-WT,本课题应用该小鼠血吸虫病实验模型,观察血吸虫病进展过程HSCs凋亡的表达动态,并探索共刺激ICOSL/ICOS信号在肝纤维化进展过程介导HSCs凋亡的机制以及对肝纤维化的影响及其分子机制,以深入探讨肝纤维化的病理机制以及寻找利用细胞凋亡逆转肝纤维化的新途径。一、日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中原代HSCs凋亡及其相关信号通路分子表达动态目的:探讨日本血吸虫肝纤维化疾病模型HSCs凋亡及其相关信号通路分子的表达动态。方法:1、显微镜下计数5♂+7-10♀条血吸虫尾蚴贴于剪毛的小鼠腹部,感染15min建立疾病模型,收集固定感染前（0周）、感染急性病变期（6周、9周）、感染慢性期（12周）、感染晚期（16周）的小鼠肝组织,应用HE染色方法观察肝脏切片中虫卵肉芽肿的面积变化。2、通过原位肝脏门静脉胶原酶灌注消化肝脏,研磨后梯度离心提取HSCs。提取周期分别为感染前（0周）、感染急性病变期（6周、9周）、感染慢性期（12周）,应用荧光显微镜及细胞免疫荧光方法鉴定。3、应用TUNEL方法检测肝脏切片中HSCs凋亡情况。小鼠原代HSCs用Annexin V-FITC/PI双染孵育,然后用流式检测凋亡率。应用实时荧光定量PCR（Real time fluorescence quantitative PCR,Real-time PCR）技术检测培养 7 天后原代HSCs中与凋亡相关分子基因的表达,并用分析其在血吸虫尾蚴慢性致病过程中的动态变化。结果:1、HE染色结果显示:感染前（0周）肝小叶结构完整,无纤维化产生,肝细胞形态完好,未有炎性浸润,而感染后可见,小叶结构被破坏,可见虫卵肉芽肿沉积,急性期肉芽肿面积达到最大[6周（7.14±0.74）×104μm2,（P<0.0001）],炎性细胞浸润在肉芽肿周围,胶原纤维沉积,随着感染时间增加,肉芽肿面积缓慢下降[9周（5.58±0.77）×104μm2（P<0.001）,12周（4.78±0.45）×104μm2（P<0.01）,16周（4.31±0.42）×104μm2],胶原沉积逐渐增加。2.、分离原代HSCs,新鲜分离的细胞呈圆形,由于内储存有维生素A脂滴具有折光性,并且脂滴在328nm的紫外激发光下能够观察到蓝绿色荧光,GFAP细胞免疫荧光染色培养3天的细胞,荧光显微镜下细胞浆中可以观察到红色荧光,提取的细胞纯度为90%以上。3、TUNEL结果显示,肝脏虫卵肉芽肿周围凋亡的HSCs自感染后升高,6周后到达峰值（19.5±2.53,P<0.0001）,9周、12周下降但仍处于较高水平[9周（10.7±0.895）,P<0.01,12 周（9.3±0.7895）,16 周（9.2±1.041）]。流式细胞术结果显示,原代HSCs的凋亡率自感染6周[（45.19±0.7463）%,P<0.0001]后到达峰值,随后逐渐下降9周[（31.93±2.292）%,P<0.01],在慢性期（12周）开始下降至较低水平[（13.61±1.407）%,P<0.01]但仍高于正常水平（5.907±0.8856）%。Real-time PCR结果显示,死亡受体信号通路中Dr5及其配体Trail的表达均在6周达到最高,9 周、12 周下调:[Trail6 周（7.7±1.3,gene/GAPDH）,P<0.05,9 周（1.5±0.2,gene/GAPDH）,P<0.05,Dr5 6 周（2.29±0.09,gene/GAPDH）,P<0.01、9 周（2.015±0.065,gene/GAPDH）、12 周（1.055 ± 0.005,gene/GAPDH,P<0.01）],Fas的表达在感染后处于升高趋势,但无统计学差异。FasL表达在感染后持续增加,并且在9周达到最高（2.873±0.5113,gene/GAPDH）然后开始下降[12周（1.04±0.01528,gene/GAPDH）,P<0.05]。线粒体信号通路中促凋亡基因Bax表达量感染后6周最高,然后表达量降低,抗凋亡基因Bcl-2呈现相同的变化趋势:Bax 6 周（2.247±0.3047,gene/GAPDH）,P<0.05]、9 周（1.43±0.1572,gene/GAPDH）、12 周（1.31±0.07371,gene/GAPDH）,Bcl-2 6 周显着升高[（9.023±0.7823,gene/GAPDH）,P<0.0001]、9 周降低[（3.253±0.508,gene/GAPDH）,P<0.01]、12 周持续降低[（1.553±0.1713,gene/GAPDH）,P<0.05]。结论:日本血吸虫慢性致病过程中HSCs的凋亡在感染急性病变期到达峰值,在慢性期（12周）开始下降至较低水平,但仍高于正常水平。与HSCs活化增殖相关分子的表达变化趋势相同。线粒体凋亡信号通路中促凋亡基因Bax与抗凋亡基因Bcl-2表达量感染后6周最高,与HSCs凋亡关系更为密切。二、共刺激信号ICOSL/ICOS对HSCs凋亡及其相关信号通路分子表达动态的影响目的:探讨上调ICOSL/ICOS对于血吸虫肝纤维化疾病模型HSCs凋亡的调控作用。方法:1、收集固定感染前,感染后6周、9周、12周肝组织应用HE染色的方法观察ICOS-Tg小鼠与WT小鼠肝组织病理变化。2、应用TUNEL检测ICOS-Tg小鼠与WT小鼠肝脏切片中HSCs凋亡情况。应用Annexin V-FITC/PI双染法检测分离ICOS-Tg小鼠与WT小鼠的原代HSCs凋亡情况。应用实时荧光定量PCR扩增方法检测ICOS-Tg小鼠与WT小鼠原代HSCs中与凋亡相关信号通路分子基因的表达水平,分析相关基因在血吸虫致病过程中的动态表达。结果:1.、组织切片HE染色可见感染后ICOS-Tg小鼠肝脏虫卵肉芽肿面积较WT 小鼠高[6 周:（10.44±1.30）×104μm2 vs（7.14±0.74）×104μm2,P<0.5]。2.、TUNEL结果分析发现,日本血吸虫感染后小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围凋亡的 HSCs ICOS-Tg 较 WT 型高[6 周 38±3.486 vs 19.5±2.535,P<0.0001;9 周15.6±1.024vs10.7±0.895,P<0.05],并具有统计学差异。流式细胞术检测ICOS-Tg原代HSCs凋亡率较同期 WT高[6周（57.76±3.707）%vs（45.19±0.7463）%,P<0.01、9 周（44.43±2.328）%vs（31.93±2.292）%,P<0.01]。实时荧光定量 PCR 检测表明,ICOS-Tg与WT小鼠在感染日本血吸虫后凋亡相关基因总体变化趋势一致,但 ICOS-Tg 均高于同期 WT 基因表达水平[Trail:6 周,（24.59±0.34）vs（7.7±1.3）,P<0.0001;9 周,（7.775±0.565）vs（1.5±0.2）,P<0.0001];[dr5:0 周,（2.275±0.025）vs（1±0）,P<0.01;6 周,（4.7±0.47）vs（2.29±0.09）,P<0.0001;9 周（4.725±0.165）vs（2.015±0.065）,P<0.0001;12 周,（2.355±0.125）vs（1.055±0.005）,P<0.01];[Fas:12 周,（3.03±0.46）vs（1.735±0.323）,P<0.05];[FasL:6 周,（3.543±0.5368）vs（1.593±0.3185）,P<0.01];[Bax:9 周,（2.463±0.006667）vs（1.43±0.1572）,P<0.01];[Bcl-2:6周,（6.06±0.4499）vs（9.023±0.7823）,P<0.001];[Caspase-3:6 周,（2.923±0.1868）vs（1.627±0.07688）,P<0.0001;12 周,（1.65±0.1501）vs（1.163±0.06333）,P<0.05]。结论:共刺激信号ICOSL/ICOS的上调,使得ICOS-Tg小鼠肝脏虫卵肉芽肿面积较WT增加。上调共刺激信号ICOSL/ICOS,也增加了 HSCs的凋亡,凋亡相关信号通路分子的表达也较同期WT表达水平高。ICOSL/ICOS上调后,HSCs的凋亡与HSCs的激活都较WT增加,而HSCs凋亡是缓解肝纤维化的手段,ICOS-Tg小鼠肝组织纤维化程度表现为加重推测可能机制为HSCs被激活细胞数高于凋亡率的增加,最终表现为纤维化程度加重。感染后期虽然HSCs的凋亡率与HSCs被激活率均下降,但HSCs被激活率依然高于凋亡率使得肝组织纤维化程度加重。三、共刺激信号ICOSL/ICOS调控HSCs凋亡介导日本血吸虫感染小鼠肝纤维化分子机制的初步探讨目的:初步探讨共刺激信号ICOSL/ICOS在日本血吸虫感染小鼠病程中调控HSCs凋亡的分子机制方法:用TGF-β与IL-13重组蛋白刺激HSCs细胞系JS1,收集细胞后用Annexin V-FITC/PI孵育后并用流式刺激前后细胞凋亡情况,应用Giemsa染色细胞爬片观察正常细胞与典型凋亡细胞在镜下的形态并比较不同之处。结果:流式结果显示,TGF-β重组蛋白作用于HSCs细胞系JS1后,细胞凋亡率较对照组增加[5ng/ml:control 组（13.38±0.135）vs TGF-β 组（20.02±1.4）,P<0.5;10ng/ml:control 组（13.38±0.135）vs TGF-β 组（21.65±2.235）,P<0.5],具有统计学意义。IL-13刺激后,凋亡率增加但无统计学意义。Giemsa染色结果显示,正常细胞细胞核呈深蓝色,凋亡细胞核深染,细胞质浓缩,可见凋亡小体。结论:课题组前期研究表明在ICOS-Tg小鼠疾病模型中上调ICOSL/ICOS信号过表达Th2型细胞因子TGF-β,能够促进细胞凋亡,这可能为ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫疾病进程中凋亡率高于WT型小鼠的原因。本研究结果表明,ICOSL/ICOS信号在调控小鼠肝纤维化进展中可影响HSCs凋亡,其分子机制可能为上调共刺激ICOSL/ICOS信号过表达Th2型细胞因子TGF-β。
孙磊[4]（2020）在《γδ T细胞促进日本血吸虫感染小鼠早期肝纤维化作用及其机制研究》文中认为目的血吸虫病（schistosomiasis）是由裂体属吸虫感染而引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病,同时也是被忽视的重要热带病。世界上有70多个国家和地区流行血吸虫病,全球感染人数约2亿,受威胁人口约8亿人。除了影响人的生命健康,畜类血吸虫病也给经济造成了巨大的损失。我国流行的是日本血吸虫病,血吸虫病预防和治疗尚有诸多待解决的问题。感染宿主后,日本血吸虫多个发育阶段均能导致宿主损害。其中成虫在门静脉系统寄生,所产大量虫卵随血流而沉积于肝脏,诱导剧烈的炎症反应。宿主体内的先天免疫系统和适应性免疫系统先后被激活,免疫反应也由Th1型向Th2型过度,逐渐由Th2型免疫反应占优势,此时宿主肝脏组织内开始形成虫卵肉芽肿以及纤维化等免疫病理反应。CD4+T细胞、B细胞等适应性免疫细胞和巨噬细胞、NK细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和γδ T细胞等先天免疫细胞共同参与该病理的形成。γδT细胞作为一种先天免疫细胞,识别抗原无MHC限制,可以迅速对血吸虫抗原作出反应,导师课题组前期研究发现γδ T细胞和血吸虫感染小鼠肝纤维化有紧密的联系,但其确切机制尚不清楚。本研究聚焦在血吸虫感染宿主肝脏纤维化早期病变,初步探讨γδ T细胞在血吸虫感染宿主早期肝纤维化形成的机制。方法实验小鼠分为WT（Wild Type）未感染对照组、WT感染组和TCRδKO（T cell receptor δ chain knock out）感染组,小鼠腹壁贴片法感染日本血吸虫尾蚴建立小鼠感染模型。WT感染组和TCR δ KO感染组各随机取16只监测生存时间;剩余小鼠在感染后不同时间解剖,采集外周血检测肝功能,比较两组小鼠感染后肝功能变化;采用ELISA方法检测小鼠血清中细胞因子表达水平,分析各组小鼠IL-17A的表达水平;解剖分离出完整的小鼠肝脏,取适量肝组织用于提取总RNA,以未感染对照组作为参照,分析两组小鼠的肝纤维化相关指标转录水平变化;取适量肝组织固定于4%多聚甲醛,病理切片及染色,观察两组小鼠肝虫卵肉芽肿大小和纤维化程度,进一步分析TCRδ KO后对肉芽肿和纤维化的影响;取适量肝组织研磨并用裂解液裂解,离心取上清,ELISA方法检测肝细胞因子表达水平;剩余肝脏和脾脏研磨后过滤和离心,分离白细胞,进行胞膜、胞内因子和核内因子流式抗体染色,检测γδT细胞、CD11b+Gr-1+细胞及其分泌细胞因子在不同感染时间的变化,探讨γδ T细胞对相关细胞及其细胞因子分泌的影响。体外试验,经细胞因子IL-17A刺激体外培养的肝星状细胞系（LX-2）,观察IL-17A对肝星状细胞的直接激活作用。结果1.流式细胞术分析显示,血吸虫感染小鼠肝脏γδ T细胞在感染进程（0周、4周和6周）中比例变化不明显,但细胞绝对数量明显上升,分别是3.2X 104、7.3×104和9.8×105个,各组间差异具有统计学意义（P<0.0001）:同时,Vγ2亚型γδT细胞比例增多,在0周、4周和6周分别为（24.72±2.02）%、（30.36±3.47）%和（44.46±3.20）%,组间差异具有统计学意义（P<0.01）,并且该亚群细胞分泌IL-17A的比例逐渐升高,分别为（17.06±1.64）%、（25.32±4.57）%和（48.06±1.03）%,组间差异具有统计学意义（P<0.0001）。2.感染小鼠监测16周观察生存率,与WT感染组小鼠比较,TCRδ KO感染组小鼠生存率提升,且差异具有统计学意义（P<0.05）;与WT感染组小鼠比较,TCRδ KO感染组小鼠在感染4周和6周时,肝功能（ALT和AST）改善（P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.05）;与WT感染组小鼠比较,TCRδ KO感染组小鼠在感染4周和6周时,脾指数下降（P<0.05,P<0.001）,在感染6周时,肝指数下降（P<0.01）。3.HE染色显示,WT组小鼠和TCRδ KO组小鼠感染6周后,肝脏单个虫卵所致肉芽肿面积分别是（1.3±0.095）×105μm2和（0.95± 0.033）×105μm2,TCR δ KO组低于WT组,且差异具有统计学意义（P<0.0001）;Masson染色显示,WT组小鼠和TCR δ KO组小鼠感染6周后,肝脏单个虫卵所致纤维化面积为（6.63±0.40）× 104 μm2 和（3.76±0.18）× 104 μm2,同样的,TCR δ KO组低于WT组,且差异具有统计学意义（P<0.0001）。4.WT组小鼠肝IL-1 7A的mRNA水平是TCR δ KO组小鼠的（3.0±0.45）倍（P<0.05）;小鼠肝组织裂解液上清中,WT组小鼠和TCRδ KO组小鼠IL-17A 的含量分别为（217.2±19.15）pg/ml 和（101.6± 18.95）pg/ml,KO 组低于WT组,差异具有统计学意义（P<0.01）。在小鼠外周血中,WT组小鼠和TCRδ KO组小鼠IL-17A的含量分别为（143.9±33.82）pg/ml和（34.0±22.29）pg/ml,同样的,KO组低于WT组,差异具有统计学意义（P<0.05）。此外,TCR δ KO小鼠肝组织Col 1和TFG-β等mRNA也有所下降,而IL-13 mRNA水平无差异。5.WT感染组小鼠和TCRδKO感染组小鼠在感染进程中,感染后0、4和6周肝脏和脾脏CD11b+Gr-1+细胞比例发生变化:WT组小鼠肝脏CD11b+Gr-1+细胞分别是（1.32±0.15）%、（10.20±1.47）%和（33.64±1.09）%;WT组脾脏分别是（1.00±0.07）%、（3.20±0.02）%和（15.05±0.99）%;TCRδKO 组肝脏分别是（1.46±0.10）%、（9.80±0.81）和（22.22±1.57）%;TCRδ KO 组脾脏分别是（1.10±0.13）%、（1.60±0.07）%和（8.30±0.64）%。0周时,两组小鼠肝脏、两组小鼠脾脏CD11b+Gr-1+细胞均无差异;4周时,TCR δ KO组小鼠脾脏CD11b+Gr-1+细胞低于WT感染组,差异具有统计学意义（P<0.001）,此时两组小鼠肝脏中CD11b+Gr-1+细胞仍没有差异;6周时,TCR δ KO组小鼠肝脏和脾脏CD11b+Gr-1+细胞均低于WT感染组,差异具有统计学意义（P<0.001,P<0.001）。另一组过继试验中,向感染3周的TCR δ KO小鼠注射IL-17A,其肝脏CD11b+Gr-1+细胞比例又恢复到WT感染组水平。6.流式细胞术显示,感染6周时,WT组和TCR δ KO小鼠肝脏CD11b+Gr-1+细胞分泌 TFG-β 的比例分别为（30.20±4.01）%和（20.73±1.13）%,TCRδKO小鼠比例下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。此外,在感染后4周,WT小鼠肝脏和脾脏CD11b+Gr-1+表达IL-17A受体的比例分别约为54.3%和26.0%,在感染后6周时,这一比例分别约为52.9%和20.3%。7.体外试验显示,肝星状细胞LX-2经IL-17A刺激后被激活,α-SMA和Col 1表达分别上调（3.7±0.7）倍（P<0.05）和（3.9±0.1）倍（P<0.0001）。8.流式细胞术显示,WT组小鼠和TCRδ KO组小鼠肝脏B细胞的比例分别为（15.56±0.75）%和（28.18±2.88）%,KO 组肝脏 B 细胞高于 WT组,差异具有统计学意义（P<0.01）;在脾脏中两组小鼠B细胞的比例为（55.48±2.01）%和（62.83±1.46）%,同样的,KO组B细胞比例高于WT组,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论1.γδ T细胞分泌IL-17A参与日本血吸虫感染早期小鼠肝脏病变进程,并加重纤维化。2.IL-17A 通过受体 IL-17RA 招募 CD11b+Gr-1+细胞,CD11b+Gr-1+细胞分泌TGF-β促进肝脏纤维化。3.IL-17A还可能直接激活肝星状细胞促进肝纤维化。
王晓玲[5]（2019）在《日本血吸虫感染小鼠自然杀伤细胞变化特征的研究》文中认为日本血吸虫病是由日本血吸虫感染引起的重要的人兽共患寄生虫病,对人民健康造成严重的威胁。主要病理损害为虫卵部分随身体排泄物排出体外,部分沉积在宿主的肝脏,产生肉芽肿性反应,进一步发展为肝纤维化、肝硬化。日本血吸虫感染后宿主和血吸虫之间存在相互作用,淋巴细胞是这种相互作用的物质基础。肝脏拥有大量的免疫细胞如自然杀伤细胞（Natural killer cell,NK）、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞等。NK细胞是无需预先致敏即可对靶细胞产生杀伤效应。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是肌成纤维细胞（Myo-Fibroblaster,MFB）的主要来源,多种因素致使静息的HSC被激活为MFB,MFB表达大量的α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）并产生大量胶原基质蛋白,当胶原的沉积大于降解时,最终可能发展为肝纤维化、肝硬化。近年来研究发现,肝纤维化的发展与NK细胞活化状态密切相关。NK细胞可通过杀伤HSC来缓解肝纤维化,而NK细胞的功能状态取决于它表面受体的表达及效应分子的分泌。日本血吸虫感染后肝脏中活化的NK细胞可以通过产生干扰素-γ（Interferon gamma,IFN-γ）、穿孔素、颗粒酶等效应分子杀死早期活化的HSC负向调节肝纤维化。NK细胞表面受体主要包括活化型和抑制型受体,通过精确调节NK细胞表面受体表达,最终决定NK细胞的功能活性,缓解血吸虫病肝纤维化的进程。本研究首先建立了日本血吸虫感染的小鼠模型,利用流式细胞术初步探索感染和正常小鼠的肝脏、脾脏中自然杀伤细胞（nature killer cell,NK）比例的动态变化;利用CBA技术检测了感染后小鼠血清中细胞因子的动态变化;利用免疫组化技术（HE染色和Masson染色）检测了感染后小鼠肝脏的病理变化;利用q-PCR技术检测NK细胞表面受体及效应分子表达的动态变化,并在体外对筛选出的受体进行q-PCR验证。通过对小鼠感染血吸虫后体内免疫变化、肝脏病理变化特征及感染小鼠NK细胞比例及表面受体的动态变化及体外的验证,为寻找NK细胞表面抗血吸虫病肝纤维化的潜在靶点奠定基础。一、日本血吸虫感染小鼠免疫特征及肝脏病理变化目的:检测日本血吸虫感染小鼠免疫特征以及观察肝脏的病理变化,初步探索日本血吸虫感染小鼠免疫反应的状态。方法:构建日本血吸虫感染小鼠模型,感染组腹部贴片法感染尾蚴,每鼠20±2条。收集感染第2、4、6、8、10周及未感染组小鼠肝脏、血清。通过q-PCR技术检测感染后不同时间点α-SMA、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的表达变化,运用病理切片染色来了解肝脏的病理变化,利用流式微球捕获蛋白定量技术（Cytometric Beads Array,CBA）检测了小鼠在感染后不同时间点的血清中细胞因子的表达变化。结果:HE染色结果:感染后第6周肝脏出现大量的虫卵肉芽肿,第8周肉芽肿相互融合,第10周开始逐渐进入慢性期,小鼠肝肉芽肿面积逐渐缩小,肝脏出现纤维化;Masson染色结果:从感染后第4周开始可见局部蓝色的胶原纤维,第6周蓝色胶原纤维面积开始扩大,第8-10周胶原纤维面积最大;q-PCR结果显示,日本血吸虫感染小鼠第6、8、10周α-SMA、Collagen Ⅲ显着性升高,Collagen Ⅰ在感染后第6、10周显着升高,小鼠感染日本血吸虫后6周,肝脏α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达显着增高,肝脏开始出现纤维,q-PCR结果与病理切片结果相符合;CBA结果显示促炎性细胞因子如IL-12、IFN-γ、IL-6在感染后第6周有相对升高的趋势,抗炎性细胞因子如IL-21、IL-9、IL-10在感染后第8周有相对升高的趋势。结论:日本血吸虫感染小鼠的肝脏于6周出现大量虫卵肉芽肿,胶原纤维面积扩大,炎性因子分泌达到高峰,提示处于急性炎性期;8周后胶原纤维面积最大,抗炎性因子分泌达到高峰,提示处于炎症修复期、肝纤维化形成期。二、日本血吸虫感染小鼠肝、脾自然杀伤细胞比例的动态变化目的:初步探索日本血吸虫感染和正常小鼠的肝脏、脾脏中NK细胞的比例的动态变化,了解NK细胞在日本血吸虫感染小鼠模型中的变化模式。方法:制备感染第2、4、6、8、10周及未感染组小鼠肝脏、脾脏单细胞悬液,利用流式细胞术检测感染和正常小鼠的肝脏、脾脏中NK细胞的比例,组间比较采用独立样本t检验,组间差异比较采用ANOVA检验。结果:流式细胞术检测结果显示,日本血吸虫感染小鼠肝脏中NK细胞在4～10周（24.53±5.49）%、（64.87±5.36）%、（67.30±10.57）%、（67.00±11.31）%显着高于未感染组（13.80±0.78）%（P<0.05）;脾脏中NK细胞在感染后6～10周（32.5±3.42）%、（58.27±6.03）%、（62.75±8.84）%显着高于未感染组（17.13±2.67）%（P<0.01）。结论:一是感染小鼠肝脏（局部微环境）NK细胞的动态变化要早于脾脏（全身免疫系统）,二是感染小鼠肝脏、脾脏NK细胞分别从感染后第4、6周开始数量显着升高,可能是因为成虫、虫卵抗原诱导的NK细胞功能活化。NK细胞在日本血吸虫感染中发挥着至关重要的作用,具体机制需要进一步探讨。三、日本血吸虫感染模型中NK细胞表面受体及效应分子的表达变化的研究目的:初步探索日本血吸虫感染和正常小鼠的肝脏、脾脏中NK细胞表面受体（活化型、抑制型受体）比例及NK细胞效应分子（穿孔素、颗粒酶、IFN-γ）的动态变化,为进一步研究NK细胞在日本血吸虫感染免疫机制中的作用奠定实验基础。方法:本研究建立日本血吸虫感染的BALB/c小鼠模型,利用流式细胞术、q-PCR技术日本血吸虫感染和正常小鼠的肝脏、脾脏中NK细胞表面受体（活化型、抑制型受体）比例及NK细胞效应分子（穿孔素、颗粒酶、IFN-γ）的动态变化。结果:NK细胞表面受体结果显示:感染后2～4周,抑制型受体PD-L1、Trail、Tim-3有增高的趋势,NK细胞表面活化型受体CD226、NKG2D、2B4在感染后2-4周表达也均有增高的趋势,其中2B4在感染后第4周显着高于未感染组（P<0.05）;感染后6～10周,所有抑制型受体均呈显着降低,活化型受体CD226、NKG2D、NKp46、2B4表达均显着降低,只有肝内CD16在感染后8～10周显着增高。功能试验结果显示:感染后2～4周,NK细胞内IFN-γ、颗粒酶、穿孔素均呈增高趋势,6周达高峰,6～10周均显着性降低。结论:感染后2～4周NK细胞呈活化状态,6～10周以后NK细胞呈失能状态。结合前面受体表达情况,推测NK细胞表面活化型受体CD226、NKG2D、2B4、CD16与抑制型受体PD-L1、Trail、Tim-3在血吸虫感染后2～4周出现高表达,应与NK细胞功能密切相关,具体机制尚需进一步验证。四、SEA刺激NK细胞表面受体表达变化的研究目的:探索在日本血吸虫感染模型中几个重要时期的NK细胞的受体及效应分子的表达变化。方法:本部分主要通过血吸虫成虫抗原（Adult worm antigen,AWA）和可溶性虫卵抗原（Souble egg antigen,SEA）以及细胞因子刺激健康小鼠肝、脾内分离的NK细胞,通过体外培养的过程,利用q-PCR技术探索在日本血吸虫感染模型中几个重要时期的NK细胞的功能变化。结果:显示AWA、SEA刺激24～36 h后,NK细胞表面抑制型受体Trail、PD-L1、Tim-3呈上升趋势,活化型受体CD16、2B4呈上升的趋势,效应分子穿孔素、颗粒酶及IFN-γ也有升高的趋势。SEA刺激作用强于AWA。结论:在SEA刺激后NK细胞通过分泌效应分子发挥杀伤作用。NK细胞表面活化型受体2B4、CD16可能是NK识别SEA的重要受体。
王言言[6]（2017）在《共刺激信号ICOSL/ICOS调控Tfh极化介导日本血吸虫病免疫病理的分子机制》文中指出肝脏虫卵肉芽肿炎症和继发性肝纤维化是血吸虫病致病的中心环节,其本质是由CD4+T淋巴细胞持续性对可溶性虫卵抗原产生免疫应答。CD4辅助性T细胞（Th,包括Th1,Th2,Th17,Tregs）介导的体液和细胞免疫应答在抗日本血吸虫的感染和免疫病理的形成发挥着重要的作用。研究表明,Th2、Th17极化与血吸虫感染宿主的慢性致病过程的发生、发展密切相关。已有报道Tfh在日本血吸虫和曼氏血吸虫病中都发挥着重要作用。然而其免疫调节机制尚未阐明。业已表明,ICOS与Tfh细胞的分化与功能密切相关。ICOS-ICOSL信号在血吸虫虫卵诱导的肉芽肿炎症及纤维化中发挥着重要作用,其血吸虫感染宿主的慢性致病过程中的免疫调节相关分子及其作用机制有待进一步阐明。本课题应用ICOSL-/-、ICOSL+/-及其野生型对照（WT）小鼠建立血吸虫病实验动物模型,探索ICOS-ICOSL共刺激信号在日本血吸虫感染宿主的慢性致病过程中对Tfh分化、极化以及生发中心反应的调控作用及重要信号分子,为深入阐明血吸虫病免疫病理的机制,寻找控制血吸虫性虫病晚期肝纤维化的发生发展的有效途径,提供科学依据。一、日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中Tfh介导的免疫应答特征及其免疫调节机制目的:探讨在日本血吸虫感染宿主慢性致病过程中,Tfh细胞的免疫应答特征及其免疫调节作用。方法:1.应用流式细胞术检测日本血吸虫感染前（0周）和感染早期（4周）、感染急性病变期（7周-9周）、感染慢性期（12周）、感染晚期（16周）的小鼠脾Tfh表面相关共刺激分子ICOS,PD-1,OX40,CD40L;转录因子Bcl-6;效应因子IL-21表达的动态变化,并观察分析Tfh增殖及相关标志分子表达与免疫病理形成的相关性。2.应用免疫荧光方法检测不同病期脾生发中心形成以及Tfh细胞迁移到生发中心的动态变化。分离不同病期Tfh细胞及B细胞共培养,抗IL-21功能阻断试验观察其对B细胞体液免疫应答影响。3.应用HE染色方法观察并分析不同病期感染鼠肝虫卵肉芽肿的病理变化,Masson染色观察并分析肝组织内胶原面积的动态变化;应用免疫组织化学的方法检测不同病期细胞因子IL-21及HSCs活化的标记分子α-SMA在肝虫卵肉芽肿周围表达的动态变化;应用流式细胞术及Real-time PCR的方法检测并比较日本血吸虫感染前后,小鼠HSCs IL-21R的表达水平的变化;并在日本血吸虫感染小鼠的肝脏中分离HSCs,体外培养,IL-21因子刺激,探讨IL-21对HSCs的影响。4.对日本血吸虫感染的小鼠腹腔注射IL-21因子,观察IL-21对肝脏病理形成和CD4+T细胞免疫应答的作用。结果:1.流式细胞术检测结果显示,小鼠脾CD4+T细胞表达Bcl-6从感染4周后显着上调,在感染后7周到达峰值,随后稍缓慢下调,但仍处于较高水平,同时也发现Tfh细胞增殖与日本血吸虫感染小鼠慢性致病的进程呈显着正相关。Tfh表面相关共刺激分子及效应因子IL-21的表达从感染4周后升高,在感染后7周进一步持续上调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,感染后9周稍下调,随后一直处于较高水平。2.免疫荧光结果显示:正常小鼠几乎无正常生发中心结构,在感染后4周有大量生发中心形成（P<0.001）,在感染后7周仍有大量生发中心存在,随后缓慢下降（P<0.01）。日本血吸虫感染小鼠后,随病程的进展,迁移到脾生发中心的Tfh细胞也逐渐增加。3.免疫组化结果显示:日本血吸虫感染小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围IL-21+细胞从感染4周后开始升高（P<0.01）,在感染后12周到达峰值（P<0.001）,随后缓慢下降但仍处于较高水平（P>0.05）。正常小鼠HSCs即表达IL-21R,血吸虫感染小鼠HSCs表达的IL-21R上调（P<0.05）,用IL-21刺激后HSCs分泌HA增加（P<0.05）。4.体内IL-21刺激增加了小鼠肝虫卵肉芽肿的面积（P<0.001）,且上调了肝脏胶原的表达（P<0.001）。体内IL-21刺激对小鼠脾CD4+T细胞上CD69的表达及Tfh和Tregs细胞的增殖无明显作用。体内IL-21刺激促进了脾CD4+T淋巴细胞效应因子IFN-γ、IL-4、IL-17A的分泌（P<0.05或P<0.001）,但对IL-21的表达无明显影响。结论:Tfh增殖及极化与日本血吸虫感染小鼠慢性致病的进程呈显着正相关。Tfh细胞迁移到生发中心通过分泌效应因子IL-21促进B细胞体液免疫应答,而且IL-21因子能促进日本血吸虫感染小鼠的肝虫卵肉芽肿炎症及肝纤维化形成。二、ICOSL/ICOS信号通路在日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中对Tfh免疫调控作用目的:探讨ICOS-ICOSL共刺激信号在日本血吸虫感染小鼠的免疫病理形成中对Tfh分化、极化以及生发中心反应的调控作用。方法:1.应用HE染色方法观察并分析日本血吸虫感染前（0周）和感染早期（4周）、感染急性病变期（7周-9周）、感染慢性期（12周）、感染晚期（16周）的ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠肝虫卵肉芽肿的病理变化,并用Masson染色方法观察并分析日本血吸虫感染ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠不同病期肝组织内胶原表达的动态变化。2.应用流式细胞术检测日本血吸虫感染ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠不同病期脾、淋巴结、肝Tfh增殖、表面相关共刺激分子ICOS,PD-1,OX40,CD40L及转录因子Bcl-6表达的动态变化。3.应用流式细胞术检测日本血吸虫感染ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠不同病期脾、淋巴结、肝Th1/Th2/Th17/Tfh细胞效应因子（IFN-γ/IL-4/IL-17A/IL-21）表达的动态变化。4.应用免疫荧光的方法检测日本血吸虫感染前和感染后ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠脾生发中心形成的情况。5.应用免疫组织化学的方法检测日本血吸虫感染ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠不同病期肝虫卵肉芽肿周围转录因子Bcl-6及细胞因子IL-21表达的动态变化。结果:1.HE染色结果显示:在日本血吸虫感染后7周、9周,ICOSL-/-小鼠肝虫卵肉芽肿的面积较其WT小鼠显着降低（P<0.01）,但在感染后期（感染后12周、16周）并无统计学差异。Masson染色结果显示:日本血吸虫感染ICOSL-/-小鼠肝组织内肝纤维化程度较其WT小鼠有所减轻（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。2.日本血吸虫感染的ICOSL-/-鼠与同期WT小鼠相比脾、淋巴结、肝CD4+T细胞转录因子Bcl-6及CXCR5表达显着下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,Tfh表面相关共刺激分子的表达也明显下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）,并在整个病期都处于较低水平。日本血吸虫感染的ICOSL+/-鼠与同期WT小鼠相比,虽有所下调,但无统计学差异。3.日本血吸虫感染的ICOSL-/-鼠与同期WT小鼠相比CD4+T细胞IL-4/IL-17A/IL-21效应因子的表达也有不同程度的下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。日本血吸虫感染的ICOSL+/-鼠与同期WT小鼠相比,虽有所下调,但无统计学意义。4.日本血吸虫感染前,ICOSL-/-、ICOSL+/-及其WT小鼠脾正常生发中心都少见,但日本血吸虫感染后（7周）,WT及ICOSL+/-小鼠脾脏正常生发中心大量形成,而ICOSL-/-鼠脾脏生发中心显着减少（P<0.001）,几乎无正常生发中心结构,即下调了GC免疫应答。5.免疫组化结果显示:日本血吸虫感染ICOSL-/-小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎症细胞转录因子Bcl-6及细胞因子IL-21的表达与同期WT小鼠相比显着下调（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。结论:阻断ICOS-ICOSL信号通路使得血吸虫性肝纤维化进程得到了一定程度的控制。ICOSL敲除下调了血吸虫感染宿主免疫应答过程中Tfh分化增殖,下调了Th2/Th17/Tfh效应因子的表达,降低了脾脏生发中心反应,即ICOS-ICOSL信号通路可能通过调控Th2、Th17、Tfh免疫应答从而发挥抗血吸虫病肝纤维化的作用。本研究结果表明,Tfh细胞及其效应因子IL-21在日本血吸虫感染鼠慢性致病过程发挥着重要的作用。调控共刺激信号ICOS-ICOSL可介导Tfh分化、极化从而下调或抑制血吸虫虫卵肉芽肿炎症及肝纤维化的发生发展。
曹蕴[7]（2016）在《ICOSL/ICOS信号介导日本血吸虫感染小鼠肝纤维化及HSCs活化的分子机制》文中研究表明血吸虫病的发病机制主要是虫卵引起的肝脏和肠等组织脏器产生肉芽肿病变,并形成继发性的肝纤维化。尽管目前对于血吸虫病的发病机制尚未完全阐明,但是一些研究提示了可能参与血吸虫病的效应细胞和细胞因子。已有大量研究证实,肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）是血吸虫病肝纤维化的主要效应细胞。在血吸虫病炎症过程所分泌的多种细胞因子中,TGF-β1（transforming growth factor-β1）是目前公认的最关键的促纤维化细胞因子之一。Smad蛋白是唯一的TGF-β1受体后信使分子,介导TGF-β1信号从细胞膜传入细胞核,进而促进纤维化相关基因的表达,导致细胞外基质（extracellular matrix,ECM）沉积在肝脏形成肝纤维化。最近研究报道,microRNAs通过靶向作用于一个或多个TGF-β1/Smad信号通路的mRNA,促进或抑制HSCs的活化,从而影响肝纤维化发生、发展。课题组前期研究表明,日本血吸虫感染ICOS-Tg（ICOS transgenic,ICOS-Tg）小鼠后可显着上调ICOSL/ICOS信号发挥免疫效应。共刺激信号ICOSL/ICOS不仅介导Th2细胞极化,使免疫反应向Th2偏移,而且该信号也介导Th17的极化。ICOS信号的上调最终促进肝虫卵肉芽肿的形成及继发性肝纤维化。本研究应用ICOS-Tg小鼠及其野生型FVB/NJ小鼠作为日本血吸虫病实验动物模型,探讨共刺激信号ICOSL/ICOS对日本血吸虫感染小鼠HSCs活化及肝纤维化形成TGF-β1/Smad信号通路的影响,以期找到一个调控HSCs活化及肝纤维化的新靶点,为治疗肝纤维化提供一个新的免疫疗法。本研究共三个部分:一、日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离、鉴定和培养目的:日本血吸虫感染小鼠原代HSCs的分离、鉴定和培养,为后续实验奠定基础。方法:采用在体原位肝脏酶灌注法和密度梯度离心技术,分离感染前（0W）、感染早期（4W）和感染急性病变期（7W、9W）ICOS-Tg小鼠及FVB/NJ小鼠原代HSCs。根据台盼蓝拒染法鉴定原代HSCs的成活率,根据其在328nm波长紫外激发光下自发蓝绿色荧光特性以及其特异性表达神经胶质原纤维酸性蛋白（gfap）鉴定原代hscs的纯度。结果:新鲜分离的小鼠原代hscs的得率为（2.34±0.05）×106个/鼠,存活率在91%以上,其纯度达到90%。倒置荧光显微镜于波长328nm的紫外激发光下观察原代hscs,新鲜分离的hscs能够自发蓝绿色荧光。分离的原代hscs经gfap免疫细胞化学染色,细胞浆中出现红色荧光。原代培养过程中,细胞状态良好。结论:日本血吸虫感染小鼠后,分离培养的原代hscs存活率及纯度达90%以上满足后续实验要求。二、共刺激信号icosl/icos对hscs中促纤维化分子基因表达水平的影响目的:探讨共刺激信号icosl/icos的上调,对感染日本血吸虫icos-tg小鼠及fvb/nj小鼠原代hscs活化程度以及肝纤维化进程的影响。方法:应用trizolreagent抽提培养7d原代hscs的总rna,采用实时荧光定量pcr（realtimefluorescencequantitativepcr,real-timepcr）法检测icos-tg小鼠及fvb/nj小鼠原代hscsα-sma、collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ基因的表达水平,分析比较两者的动态变化。结果:日本血吸虫感染小鼠后,随着病程的进展,原代hscs中α-sma、collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ基因的表达水平逐渐上调（1.4035.207,1.0515.347,1.3133.614,gene/β-actin）。icos-tg小鼠原代hscs中,α-sma、collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ基因的表达水平（1.7605.753,1.2586.262,1.4884.470,gene/β-actin）显着高于同时期fvb/nj小鼠的表达水平。结论:共刺激信号icosl/icos的上调,能够促进hscs的活化以及肝纤维的发展。三、共刺激信号icosl/icos对肝纤维化形成tgf-β1/smad信号通路相关分子基因表达水平的影响目的:探讨共刺激信号icosl/icos的上调,对感染日本血吸虫icos-tg小鼠及fvb/nj小鼠肝纤维化形成tgf-β1/smad信号通路相关分子基因表达水平的影响。方法:应用Trizol Reagent抽提培养7d原代HSCs的总RNA,采用Real-time PCR法检测ICOS-Tg小鼠及FVB/NJ小鼠原代HSCs TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7基因的表达水平;应用RNAiso for Small RNA抽提培养7d原代HSCs的Small RNA,采用Real-time PCR法检测ICOS-Tg小鼠及FVB/NJ小鼠原代HSCs microRNA-21、microRNA-454基因的表达水平,分析比较两者的动态变化结果:日本血吸虫感染小鼠后,原代HSCs中TGF-β1、Smad2、Smad3、miR-21基因表达水平,自感染后4周开始上升,感染后7周达到较高水平,感染后9周有所下降,但是仍维持在较高的水平;ICOS-Tg小鼠原代HSCs中,TGF-β1、Smad2、Smad3、miR-21基因表达水平显着高于同时期FVB/NJ小鼠的表达水平（P<0.05）。此外,随着病程的进展,原代HSCs中Smad4基因的表达水平逐渐上调;ICOS-Tg小鼠原代HSCs中,Smad4基因表达水平显着高于同时期FVB/NJ小鼠的表达水平（P<0.05）。但是,原代HSCs中Smad7及miR-454基因的表达水平总体呈下调趋势,仅在感染后4周时Smad7基因表达水平略有升高;ICOS-Tg小鼠原代HSCs中,Smad7及mi R-454基因的表达水平显着低于同时期FVB/NJ小鼠的表达水平（P<0.05）。结论:共刺激信号ICOSL/ICOS在日本血吸虫感染小鼠肝纤维化形成中发挥重要的作用。共刺激信号ICOSL/ICOS的上调,可通过上调促纤维化因子的表达,下调抑纤维化因子的表达,从而促进肝纤维化的发生、发展。本研究结果表明,共刺激信号ICOSL/ICOS在HSCs的活化以及肝纤维化形成通路中发挥着重要的作用。上调共刺激信号ICOSL/ICOS,能够上调促肝纤维因子的表达,下调抑纤维化因子的表达,从而刺激HSCs的活化,促进肝纤维化的发生、发展。
王瑜,夏超明[8]（2015）在《日本血吸虫感染可诱导共刺激分子配体基因敲除小鼠CD154和CD40动态变化及对Th1/Th2偏移的影响》文中提出目的:探讨可诱导共刺激分子（inducible costimulator,ICOS）-ICOS配体（ICOS ligand,ICOSL）信号通路对感染日本血吸虫小鼠的CD154、CD40表达及Th1/Th2偏移的影响。方法:建立ICOSL基因敲除（ICOSL knockout,ICOSL-KO）小鼠及野生型C57BL/6J小鼠感染日本血吸虫疾病模型,于感染前和感染后4、7、12、16、20周,应用流式细胞术、免疫组织化学法分别检测小鼠脾细胞与肝虫卵肉芽肿周围炎性浸润细胞CD154、CD40的水平;应用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠脾细胞经可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen,SEA）诱导72 h后培养的上清液中γ-干扰素（interferon gamma,IFN-γ）、白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）水平及小鼠血清中SEA特异性抗体Ig G、Ig G1、Ig G2a的水平;应用HE染色观察小鼠肝虫卵肉芽肿病变动态变化。结果:感染后4、7、12、16、20周,ICOSL-KO小鼠脾细胞CD154、CD40水平与野生型小鼠相比,显着降低[CD154为（18.62±4.76）%vs.（27.91±3.94）%、（22.44±4.67）%vs.（40.86±5.21）%、（25.50±6.81）%vs.（43.81±8.41）%、（20.22±5.28）%vs.（40.95±7.34）%、（17.87±4.59）%vs.（33.16±6.31）%,皆P<0.01;CD40为（19.43±3.26）%vs.（24.37±3.59）%、（23.00±4.47）%vs.（31.80±5.86）%、（24.46±5.01）%vs.（35.85±5.32）%、（23.42±4.69）%vs.（33.30±6.14）%、（22.85±3.78）%vs.（30.88±5.94）%,皆P<0.05]。感染后7、12、16、20周,ICOSL-KO小鼠肝虫卵肉芽肿炎性浸润细胞CD154、CD40水平与野生型小鼠相比,亦显着降低[CD154为（0.319±0.066）vs.（0.488±0.086）、（0.389±0.067）vs.（0.596±0.082）、（0.378±0.064）vs.（0.543±0.072）、（0.348±0.069）vs.（0.523±0.076）,皆P<0.01;CD40为（0.398±0.066）vs.（0.546±0.079）、（0.461±0.085）vs.（0.618±0.076）、（0.453±0.087）vs.（0.587±0.074）、（0.449±0.065）vs.（0.565±0.082）,皆P<0.05]。感染后,ICOSL-KO小鼠IFN-γ表达显着高于野生型小鼠（P<0.05）,而IL-4表达水平则显着低于野生型小鼠（P<0.05）,其Th2分化指数亦显着低于野生型小鼠（P<0.01）。ICOSL-KO小鼠血清SEA特异性抗体Ig G、Ig G1、Ig G2a的水平与Ig G1/Ig G2a的比值亦显着低于野生型小鼠（P<0.01）,且ICOSL-KO小鼠的肝虫卵肉芽肿体积显着小于野生型小鼠（P<0.01）。结论:ICOS-ICOSL信号通路在血吸虫病免疫病理中起重要调控作用,其对Th1/Th2偏移的影响可能是通过调控CD154-CD40信号通路来实现的。
梁松[9]（2014）在《共刺激信号ICOSL/ICOS介导Th2极化与HSCs活化效应在血吸虫病肝纤维化形成中的作用》文中研究表明由于血吸虫虫卵沉积导致的肝脏虫卵肉芽肿病变和继发性肝纤维化被认为是日本血吸虫病的重要病理损伤。研究表明，宿主在感染日本血吸虫的慢性致病过程当中，血吸虫可溶性虫卵抗原（Soluble egg antigen,SEA）介导的Th2极化在肝脏虫卵肉芽肿反应中的调节和诱发继发肝纤维化中发挥关键作用。肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）的活化，使大量的细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM）沉积在肝脏组织内是肝纤维化进程当中的关键环节。本研究中日本血吸虫病实验动物模型分别为：在FVB/NJ小鼠遗传背景的基础上构建的ICOS转基因（ICOS transgenic, ICOS-Tg）小鼠；并将FVB/NJ小鼠作为其野生型对照。探讨ICOSL/ICOS信号对感染宿主Th2型免疫应答、免疫病理及HSCs活化的影响，探究共刺激信号ICOSL/ICOS介导的Th2极化与HSCs的活化效应对日本血吸虫病肝纤维化形成的影响，为开辟能有效的控制肝纤维化的新途径提供坚实的理论依据。本论文研究分四个部分：一、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中Th2极化相关共刺激分子表达动态变化目的：探讨共刺激信号ICOSL/ICOS在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后，对与Th2极化有密切联系的ICOS、CD28、CD154等共刺激分子表达的影响。方法：分别在日本血吸虫感染前0周和感染后4周（早期）、7周（急性病变期）、12周（慢性期），运用流式细胞术分析观察ICOS、CD28、CD154等共刺激分子在ICOS-Tg及其野生型小鼠脾CD4+T淋巴细胞上表达水平动态变化。采用免疫组织化学法体内同期观察感染小鼠不同病期肝脏虫卵肉芽肿周围炎症性侵润细胞上相关共刺激分子表达水平动态变化。结果：流式数据表明，感染小鼠脾CD4+T淋巴细胞上共刺激分子CD28表达水平自感染后4周开始升高（46.51%），感染后7周达到峰值（78.70%），感染后12周有所下降，但表达水平仍维持在较高水平（60.01%）；而共刺激分子ICOS（38.77%）和CD154（30.53%）表达水平自感染后4周开始升高，感染后7周（ICOS:48.10%; CD154:50.74%）、12周（ICOS:57.90%; CD154：55.00%）仍处于逐渐升高趋势。免疫组织化学体内同期检测发现，共刺激分子ICOS、CD28、CD154在感染小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎症性侵润细胞上的表达水平在感染后7周即处于较高水平（0.551；0.479；0.516, IOD/AOVI），感染后12周仍呈上升趋势（0.662；0.492；0.576, IOD/AOVI）。并且ICOS、CD28、CD154在ICOS-Tg小鼠脾CD4+T淋巴细胞上的表达水平均要高于同时期野生型小鼠（8.36～57.90vs5.51～41.21;27.33～60.01vs22.36～51.43;5.80～55.0vs4.73～41.21,%）；其在肝脏虫卵肉芽肿周围炎症性侵润细胞上的表达水平在感染后7周（0.551vs0.355;0.479vs0.349;0.516vs0.432, IOD/AOVI）、12周（0.662vs0.418;0.492vs0.431;0.576vs0.447,IOD/AOVI）亦高于同时期野生型小鼠。结论：在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中，与Th2极化密切相关的共刺激分子ICOS、CD28、CD154的表达均呈逐渐上升趋势，特别是ICOS表达更为显着并可能影响相关共刺激分子CD28和CD154的表达。二、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号ICOSL/ICOS对宿主Th2极化的作用目的：探讨ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后，上调ICOSL/ICOS信号对宿主体内Th2极化的影响。方法：分别收集ICOS-Tg及其野生型小鼠感染前0周和感染后4周、7周、12周的脾淋巴细胞，收集经SEA刺激培养72h后的细胞上清，运用ELISA双抗夹心法检测观察上清中Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12和Th2型细胞因子IL-4、IL-13的表达水平动态变化。结果：感染小鼠脾细胞培养上清中Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12表达水平自感染后4周开始升高（38.98pg/ml；73.50pg/ml），感染后7周达到峰值（62.40pg/ml；119.96pg/ml），感染后12周表达下调（33.02pg/ml；93.36pg/ml），表明病程由急性期转为慢性期时，Th1型细胞因子的表达水平下调；而Th2型细胞因子IL-4、IL-13表达水平自感染后4周开始升高（11.49pg/ml；66.94pg/ml），感染后7周（23.04pg/ml；165.82pg/ml）、12周（41.89pg/ml；208.66pg/ml）呈上升表达趋势。Th2型细胞因子IL-4、IL-13在ICOS-Tg小鼠培养上清中的表达水平均要高于同时期野生型小鼠（3.98～41.89vs3.89～28.82；19.56～208.66vs15.49～165.38, pg/ml）。结论：在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中，上调ICOSL/ICOS信号促进宿主的Th2型细胞因子的表达，进而增强Th2极化免疫应答反应。三、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号ICOSL/ICOS对宿主肝脏纤维化的作用目的：探讨ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后，上调ICOSL/ICOS信号对宿主肝脏纤维化的影响。方法：分别收集ICOS-Tg及其野生型小鼠感染前0周和感染后4周、7周、12周的血清，应用ELISA双抗夹心法检测血清中羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）、透明质酸（hyaluronic acid,HA）含量并观察其动态变化规律。采用Masson染色法观察感染小鼠不同病期肝脏纤维化程度的变化。运用免疫组织化学法体内同期检测观察Collagen-Ⅰ、α-SMA和TGF-β1等蛋白在感染小鼠不同病期肝组织中的表达水平动态变化。结果：随着病程的迁移，感染小鼠血清中HYP、HA的表达水平自感染后4周呈逐渐上升趋势（1.61～2.93, μg/ml;211.49～284.50, ng/ml;），肝脏纤维化程度加重，肝脏中Collagen-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1蛋白的表达水平亦逐渐上调（0.013～0.518;0.022～0.587;0.069～0.510, IOD/AOVI）。而HYP（1.61～2.93vs1.54～2.21,μg/ml）、HA（152.74～284.50vs145.97～224.93, ng/ml）在ICOS-Tg小鼠血清中的表达水平均要高于同时期的野生型小鼠；并且Collagen-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1等蛋白在ICOS-Tg小鼠肝组织中的表达水平在感染后7周（0.463vs0.332;0.550vs0.443;0.483vs0.312, IOD/AOVI）、12周（0.518vs0.374;0.587vs0.451;0.510vs0.356,IOD/AOVI）亦高于同时期的野生型小鼠。结论：在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中，上调ICOSL/ICOS信号促进宿主的肝脏纤维化的形成。四、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号ICOSL/ICOS对宿主HSCs活化效应及肝纤维化的作用目的：探究ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后，上调ICOSL/ICOS信号对宿主HSCs活化及肝纤维化形成的影响。方法：采用肝脏酶灌注充盈法和密度梯度离心法分离出感染前（0周）和感染早期阶段（4周、6周）、感染急性病变期（9周）ICOS-Tg及其野生型小鼠原代HSCs，运用台盼蓝拒染法鉴定分离的原代HSCs成活率；采用其在328nm波长紫外激发光下自发荧光特性和其在肝细胞中特异性表达神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）鉴定分离的原代HSCs纯度；原代HSCs培养7d后，用Trizol Reagent试剂抽提总RNA；利用实时荧光定量PCR（Real time fluorescence quantitative PCR）SYBR法检测Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1等基因的表达水平变化，观察HSCs的活化效应及对肝纤维化进程的调节作用。结果：分离的原代HSCs纯度达到90%，其成活率为95%，原代培养过程中细胞状态良好。随着病程的迁移，HSCs的活化程度逐渐增加，HSCs中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1等基因的表达水平逐渐上调（0.621～1.093；0.312～0.576；0.706～1.078；0.760～1.138，gene/β-actin）。ICOS-Tg小鼠与HSCs活化相关基因α-SMA（0.706～1.078vs0.695～0.947, gene/β-actin）的表达均高于同时期野生型小鼠；ICOS-Tg小鼠HSCs中Collagen-Ⅰ（0.621～1.093vs0.583～0.832,gene/β-actin）、 Collagen-Ⅲ（0.312～0.576vs0.309～0.446, gene/β-actin）、TGF-β1（0.760～1.138vs0.732～0.919, gene/β-actin）等基因的表达水平亦高于同时期的野生型小鼠。结论：在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中，上调ICOSL/ICOS信号促进宿主的HSCs的活化和肝纤维化的形成。本研究结果表明，共刺激信号ICOSL/ICOS对日本血吸虫感染后宿主的Th2极化及肝脏内HSCs活化具有重要的调节作用，并促进肝脏纤维化形成。ICOSL/ICOS信号的调控将可能作为下调或抑制血吸虫虫卵肉芽肿病变及肝纤维化进程的靶点。
王瑜,蔡茹,王波,夏超明[10]（2013）在《ICOS转基因小鼠感染日本血吸虫对CD28/CD86表达及Th1/Th2极化的影响》文中进行了进一步梳理目的探讨上调可诱导共刺激分子（ICOS）信号对感染日本血吸虫小鼠CD28/CD86的表达及Th1/Th2极化的影响。方法建立ICOS转基因（ICOS-Tg）小鼠及野生型FVB/NJ小鼠日本血吸虫病模型,应用流式细胞术分析感染前（0周）和感染后（4～20周）小鼠的脾CD4+T淋巴细胞上CD28与脾CD19+B淋巴细胞上CD86的表达水平。应用免疫组化法检测同期小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎性浸润细胞上CD28、CD86表达水平变化。取同期小鼠脾淋巴细胞用SEA进行诱导培养72 h后,采用ELISA法检测培养上清中Th1（IFN-γ、IL-12）及Th2（IL-4、IL-13）细胞因子表达水平。采集同期小鼠的血清,应用ELISA法检测血清中SEA特异性抗体IgG及其亚类IgG1、IgG2a的表达水平。应用HE染色法观察小鼠肝脏虫卵肉芽肿病变动态变化。结果ICOS-Tg小鼠脾CD4+T细胞上CD28和脾CD19+B细胞上CD86的水平与同期野生型FVB/NJ小鼠相比明显升高,且分别在感染4周后（50.57±7.54 vs 40.38±5.43,P<0.05）及在感染12周后（76.46±10.55 vs 65.10±10.17,P<0.05）差异显着。ICOS-Tg小鼠肝脏虫卵肉芽肿的CD28、CD86表达亦高于野生型FVB/NJ小鼠的水平,且分别在感染7周后（0.485±0.094 vs 0.357±0.078,P<0.05）及感染12周后（0.649±0.072 vs 0.537±0.064,P<0.05）差异显着。ICOS-Tg小鼠Th2细胞因子（IL-4、IL-13）水平从感染7周后比野生型FVB/NJ小鼠显着升高（皆P<0.05）;ICOS-Tg小鼠血清SEA特异性抗体IgG及其亚类IgG1、IgG2a的水平显着高于野生型FVB/NJ小鼠的水平（P<0.05、0.01、0.001不等）;ICOS-Tg小鼠Th2分化指数与IgG1/IgG2a的比值亦高于野生型小鼠,分别在感染7、12、16、20周后（P<0.05、0.001）及12、16周后（皆P<0.05）具有显着性差异。在整个病程中,ICOS-Tg小鼠肝脏虫卵肉芽肿体积显着大于野生型FVB/NJ小鼠。结论感染日本血吸虫的ICOS-Tg小鼠CD28、CD86表达及其Th2免疫应答显着上调,并伴随肝虫卵肉芽肿病变增强,表明ICOS信号对CD28-CD86信号通路具有一定的调控作用,且在介导Th2极化及肝虫卵肉芽肿的发生、发展中发挥重要作用。
二、日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肿与Th1/Th2细胞因子水平的动态变化（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肿与Th1/Th2细胞因子水平的动态变化（论文提纲范文）
（1）小柴胡汤干预日本血吸虫致肝纤维化的实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 小柴胡汤及其主要成分对体外培养LX-2细胞的作用 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1.细胞增殖实验结果 |
| 2.细胞凋亡检测结果 |
| 3.RT-PCR和Western blot检测结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 小柴胡汤及其主要成分干预日本血吸虫感染小鼠肝纤维化的作用 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1.小鼠生存状态 |
| 2.肝脏与脾脏指数 |
| 3.单个虫卵肉芽肿面积和胶原纤维沉积量 |
| 4.流式细胞结果 |
| 5.血清ELISA检测结果 |
| 6.RT-PCR和Western Blot结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 小柴胡汤及其主要成分干预体外培养血吸虫成虫的研究 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1.存活率 |
| 2.活动力评分 |
| 3.产卵量 |
| 4.成虫形态学观察 |
| 5.sjAQP表达变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 血吸虫病肝纤维化的发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（2）日本血吸虫组织蛋白酶L3与甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫功能分析（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 主要缩略语 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 SjCL3与SjGAPDH基因的分子生物学信息分析、克隆表达及重组酶的活性测定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 SjCL3与SjGAPDH在日本血吸虫不同发育时期的表达水平及其组织学定位 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠对抗日本血吸虫感染的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四章 rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫小鼠对抗日本血吸虫感染的机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第五章 SjCL3与SjGAPDH在日本血吸虫免疫逃避及生长发育中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第六章 rSjCL3与rSjGAPDH单独及联合免疫在治疗I型糖尿病中的作用及机制 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 现存问题与局限性 |
| 展望 |
| 综述 血吸虫病早期诊断技术的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
（3）ICOSL/ICOS调控日本血吸虫感染小鼠肝纤维化过程中HSCs凋亡相关信号通路的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 一、日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中原代HSCs凋亡及其相关信号通路分子表达动态 |
| (一) 试剂与材料 |
| 1. 主要试剂与耗材 |
| 2. 实验仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 动物模型的建立 |
| 2. 制备肝脏石蜡切片 |
| 3. 组织切片HE染色 |
| 4. 肝星状细胞的分离、鉴定和培养 |
| 5. Annexin V-FITC/PI联合标记检测HSCs凋亡率 |
| 6. TUNEL观察肝脏HSCs凋亡 |
| 7. RNA的抽提、逆转录、实时荧光定量PCR反应 |
| 8. 统计学分析 |
| (三) 实验结果 |
| 1. 血吸虫尾蚴性别鉴定 |
| 2. 日本血吸虫感染小鼠不同病期肝单个虫卵肉芽肿面积的动态变化 |
| 3. 肝星状细胞的分离、鉴定和培养 |
| 4. 日本血吸虫感染慢性致病过程Annexin V-FITC/PI联合标记检测HSCs凋亡率的动态变化 |
| 5. TUNEL观察日本血吸虫不同感染病期肝脏组织中HSCs凋亡 |
| 6. 日本血吸虫感染不同病期HSCs中凋亡相关信号通路分子基因的动态表达 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 二、共刺激信号ICOSL/ICOS对HSCs凋亡及其相关信号通路分子表达动态 |
| (一) 试剂与材料 |
| 1. 主要试剂与耗材 |
| 2. 实验仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. ICOS-Tg小鼠筛选及繁育 |
| 2. ICOS-Tg小鼠基因型鉴定 |
| 3. 动物模型的建立 |
| 4. 小鼠肝脏组织石蜡切片的制备及HE染色 |
| 5. 肝星状细胞的分离、鉴定和培养 |
| 6. Annexin V-FITC/PI联合标记检测HSCs凋亡率 |
| 7. TUNEL观察肝脏HSCs凋亡 |
| 8. RNA的抽提、逆转录、实时荧光定量PCR反应 |
| 9. 统计学分析 |
| (三) 实验结果 |
| 1. ICOS-Tg小鼠基因型鉴定 |
| 2. 日本血吸虫感染ICOS-Tg小鼠疾病模型中肝脏单个虫卵肉芽肿面积高于ICOS-WT小鼠 |
| 3. 日本血吸虫感染ICOS-Tg小鼠疾病模型中原代HSCs凋亡率升高 |
| 4. 日本血吸虫感染ICOS-Tg小鼠疾病模型肝中肉芽肿周围HSCs凋亡率升高 |
| 5. 日本血吸虫感染不同病期原代HSCs中凋亡相关信号通路分子基因的动态表达 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 三、共刺激信号ICOSL/ICOS调控HSCs凋亡介导日本血吸虫感染小鼠肝纤维化分子机制的初步探讨 |
| (一) 试剂与材料 |
| 1. 主要试剂与耗材 |
| 2. 实验仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. JS1小鼠肝星状细胞系培养 |
| 2. 细胞因子作用JS1 |
| 3. Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测 |
| 4. 吉姆萨染色细胞 |
| (三) 实验结果 |
| 1. TGF-β促进了肝星状细胞系JS1凋亡 |
| 2. 吉姆萨染色观察凋亡细胞形态 |
| 3. IL-13对于肝星状细胞系JS1凋亡无影响 |
| (四) 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 英文缩写词表 |
| 综述 肝星状细胞凋亡与自噬相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 硕士学习期间参与发表和待发表的论文 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（4）γδ T细胞促进日本血吸虫感染小鼠早期肝纤维化作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 日本血吸虫感染小鼠早期γδ T细胞的表型 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备和器材 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 日本血吸虫尾蚴 |
| 1.2.2 实验动物及感染 |
| 1.2.3 小鼠肝脏白细胞分离 |
| 1.2.4 细胞胞外染色 |
| 1.2.5 胞内细胞因子染色 |
| 1.2.6 流式染色方案 |
| 1.2.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 日本血吸虫感染小鼠肝脏白细胞分选后鉴定 |
| 2.2 日本血吸虫感染早期小鼠γδT细胞及其亚型的表达 |
| 2.3 日本血吸虫感染早期小鼠γδT细胞细胞因子的表达 |
| 2.3.1 小鼠肝脏Vγ1亚型γδT细胞表达IFN-γ |
| 2.3.2 小鼠肝脏Vγ2亚型γδT细胞表达IFN-γ和IL-17A |
| 2.3.3 小鼠肝脏γδT细胞不表达TNF-α与GM-CSF |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 γδT细胞促日本血吸虫感染小鼠早期肝纤维化 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备和器材 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 日本血吸虫尾蚴 |
| 1.2.2 实验动物及感染 |
| 1.2.3 RNA提取 |
| 1.2.4 RNA反转录 |
| 1.2.5 RT-qPCR |
| 1.2.6 感染小鼠血吸虫成虫和肝脏虫卵计数 |
| 1.2.7 HE染色 |
| 1.2.8 Masson染色 |
| 1.2.9 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 日本血吸虫感染TCR δ KO小鼠生存率比WT小鼠明显提高 |
| 2.2 日本血吸虫感染TCRδ KO小鼠肝脾指数比WT小鼠降低 |
| 2.2.1 脾脏指数变化 |
| 2.2.2 肝脏指数变化 |
| 2.3 日本血吸虫感染TCR δ KO小鼠肝功能比WT小鼠改善 |
| 2.4 日本血吸虫感染TCRδ KO小鼠纤维化比WT小鼠减轻 |
| 2.5 日本血吸虫感染TCR δ KO小鼠纤维化相关基因表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 γδ T细胞促进日本血吸虫感染早期纤维化机制的研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备和器材 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 日本血吸虫尾蚴 |
| 1.2.2 实验动物及感染 |
| 1.2.3 小鼠肝脏和脾脏白细胞分离 |
| 1.2.4 细胞胞外染色 |
| 1.2.5 胞内细胞因子染色 |
| 1.2.6 Treg细胞染色 |
| 1.2.7 RNA提取 |
| 1.2.8 RNA反转录 |
| 1.2.9 RT-qPCR |
| 1.2.10 ELISA 试验 |
| 1.2.11 细胞因子注射实验 |
| 1.2.12 流式染色方案 |
| 1.2.13 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 日本血吸虫感染TCRδKO小鼠中IL-17A表达量下调 |
| 2.2 日本血吸虫感染小鼠γδT细胞对CD11b~+Gr-1~+的影响 |
| 2.2.1 日本血吸虫感染WT和TCRδKO小鼠肝脏中CD11b~+Gr-1~+细胞动态变化 |
| 2.2.2 日本血吸虫感染WT和TCR δ KO小鼠脾脏中CD11b~+Gr-1~+细胞动态变化 |
| 2.2.3 日本血吸虫感染TCR δ KO小鼠过继IL-17A试验 |
| 2.3 日本血吸虫感染小鼠肝脏γδT细胞招募CD11b~+Gr-1~+细胞机制 |
| 2.4 日本血吸虫感染小鼠肝脏CD11b~+Gr-1~+细胞促进纤维化机制 |
| 2.5 日本血吸虫感染小鼠γδT细胞促进纤维化其它可能机制探索 |
| 2.6 日本血吸虫感染WT和TCR δ KO小鼠T细胞和B细胞、Th1、Th2、Th17以及巨噬细胞、DC和Treg细胞比例 |
| 2.6.1 日本血吸虫感染WT和KO小鼠肝脏T细胞和B细胞的比例 |
| 2.6.2 日本血吸虫感染WT和TCR δ KO小鼠脾脏T细胞和B细胞的比例 |
| 2.6.3 日本血吸虫感染WT和TCRδKO小鼠脾脏Th1、Th2和Th17细胞的比例 |
| 2.6.4 日本血吸虫感染WT和TCRδ KO小鼠巨噬细胞、DC细胞和Treg细胞的比例 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读博士期间发表文章 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）日本血吸虫感染小鼠自然杀伤细胞变化特征的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 日本血吸虫感染小鼠免疫特征及肝脏病理变化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 日本血吸虫感染小鼠模型建立 |
| 2.2.2 血清、肝脏样本的制备 |
| 2.2.3 CBA检测细胞因子 |
| 2.2.4 RNA提取 |
| 2.2.5 反转录反应 |
| 2.2.6 q-PCR反应 |
| 2.2.7 组织化学染色 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 流式CBA多因子检测外周血血清中细胞因子的动态变化 |
| 3.2 日本血吸虫感染小鼠后肝纤维化的程度 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 日本血吸虫感染小鼠肝、脾NK细胞比例的动态变化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 日本血吸虫感染小鼠模型建立 |
| 2.2.2 肝脏、脾脏单细胞悬液的制备 |
| 2.2.3 流式细胞术检测小鼠肝脏和脾脏中自然杀伤细胞的比例 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝脏中NK细胞比例的动态变化 |
| 3.2 脾脏中NK细胞比例的动态变化 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 日本血吸虫感染模型中NK细胞表面受体及效应分子的表达变化的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 日本血吸虫感染小鼠模型建立 |
| 2.2.2 单细胞悬液的制备 |
| 2.2.3 NK细胞的分选 |
| 2.2.4 NK细胞的鉴定 |
| 2.2.5 RNA提取 |
| 2.2.6 反转录反应 |
| 2.2.7 q-PCR反应 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 流式细胞术检测肝脏、脾脏磁珠分选后NK细胞的纯度 |
| 3.2 NK细胞表面受体的表达变化 |
| 3.2.1 NK细胞表面活化型受体的表达 |
| 3.2.2 NK细胞表面抑制型受体的表达 |
| 3.3 NK细胞效应分子的检测 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 日本血吸虫虫卵抗原刺激NK细胞表面受体及效应分子的表达变化的研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 日本血吸虫感染模型建立 |
| 2.2.2 SEA和AWA制备 |
| 2.2.3 磁珠分选NK细胞 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 RNA提取 |
| 2.2.6 反转录反应 |
| 2.2.7 q-PCR反应 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 NK细胞表面抑制型受体的表达 |
| 3.1.1 肝脏NK细胞表面抑制型受体的表达 |
| 3.1.2 脾脏NK细胞表面抑制型受体的表达 |
| 3.2 NK细胞表面活化型受体的表达 |
| 3.3 NK细胞效应分子的动态变化 |
| 3.3.1 SEA刺激后肝脏中NK细胞效应分子的表达变化 |
| 3.3.2 SEA刺激后脾脏中NK细胞效应分子动态变化 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表文章 |
| 附件 |
（6）共刺激信号ICOSL/ICOS调控Tfh极化介导日本血吸虫病免疫病理的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 一、日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中Tfh介导的免疫应答特征及其免疫调节机制 |
| （一）主要试剂与材料 |
| （二）实验方法 |
| （三）结果 |
| （四）讨论 |
| 参考文献 |
| 二、ICOSL/ICOS信号通路在日本血吸虫感染小鼠慢性致病过程中对Tfh免疫调控作用 |
| （一）主要试剂与材料 |
| （二）实验方法 |
| （三）结果 |
| （四）讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录一 缩写词表 |
| 附录二 常用试剂的配制 |
| 综述 Tfh介导寄生虫感染免疫应答及免疫病理机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士学习期间已发表和待发表的论文 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
（7）ICOSL/ICOS信号介导日本血吸虫感染小鼠肝纤维化及HSCs活化的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的分离、鉴定和培养 |
| 1.材料与试剂 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 ICOS-Tg小鼠筛选及繁育 |
| 2.2 实验动物模型的建立 |
| 2.3 HSCs的分离、鉴定和培养 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 ICOS-Tg小鼠的筛选及繁育 |
| 3.2 日本血吸虫感染小鼠HSCs分离、鉴定和培养 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 共刺激信号ICOSL/ICOS对HSCs中促纤维化分子基因表达的影响 |
| 1.材料与试剂 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物模型的建立 |
| 2.2 HSCs的分离 |
| 2.3 RNA的抽提 |
| 2.4 RNA逆转录成cDNA |
| 2.5 实时荧光定量PCR反应 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 小鼠原代HSCs RNA完整性鉴定 |
| 3.2 日本血吸虫感染小鼠不同病期原代HSCs中 α-SMA基因的表达 |
| 3.3 日本血吸虫感染小鼠不同病期与肝纤维化相关蛋白基因的表达 |
| 3.3.1 ICOS-Tg小鼠与FVB/NJ小鼠不同病期原代HSCs中Collagen-Ⅰ的表达 |
| 3.3.2 ICOS-Tg小鼠与FVB/NJ小鼠不同病期原代HSCs中Collagen-Ⅲ的表达 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 共刺激信号ICOSL/ICOS对肝纤维化形成TGF-β1/Smad信号通路相关分子基因表达水平的影响 |
| 1.材料与试剂 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物模型的建立 |
| 2.2 HSCs的分离 |
| 2.3 RNA的抽提 |
| 2.4 Small RNA的抽提 |
| 2.5 Small RNA逆转录成cDNA |
| 2.6 实时荧光定量PCR反应 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 日本血吸虫感染小鼠不同病期肝纤维化相关分子TGF-β1 基因的表达 |
| 3.2 日本血吸虫感染小鼠不同病期与肝纤维化形成TGF-β1/Smad通路相关分子Smad2基因的表达 |
| 3.3 日本血吸虫感染小鼠不同病期与肝纤维化形成TGF-β1/Smad通路相关分子Smad3基因的表达 |
| 3.4 日本血吸虫感染小鼠不同病期与肝纤维化形成TGF-β1/Smad通路相关分子Smad4基因的表达 |
| 3.5 日本血吸虫感染小鼠后不同病期与肝纤维化形成TGF-β1/Smads通路相关分子Smad7基因的表达 |
| 3.6 日本血吸虫感染小鼠不同病期与肝纤维化形成TGF-β1/Smad通路相关分子miR-21基因的表达 |
| 3.7 日本血吸虫感染小鼠不同病期与肝纤维化形成TGF-β1/Smad通路相关分子miR-454基因的表达 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 英文缩写词表 |
| 肝星状细胞与肝纤维化研究进展 |
| 参考文献 |
| 硕士学习期间参与发表和待发表的论文 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（8）日本血吸虫感染可诱导共刺激分子配体基因敲除小鼠CD154和CD40动态变化及对Th1/Th2偏移的影响（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1. 1 资料 |
| 1.1.1实验动物 |
| 1.1.2主要仪器与试剂 |
| 1. 2 方法 |
| 1.2.1建立日本血吸虫感染小鼠模型 |
| 1.2.2制备小鼠脾细胞悬液 |
| 1.2.3小鼠脾细胞CD154、CD40的检测 |
| 1.2.4小鼠肝组织内CD154、CD40的检测 |
| 1.2.5小鼠细胞因子诱生及检测 |
| 1.2.6小鼠血清抗体Ig G及其亚类检测 |
| 1.2.7小鼠肝虫卵肉芽肿病变的检测 |
| 1. 3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2. 1 脾细胞CD154、CD40 的变化 |
| 2. 2 小鼠肝内CD154、CD40 表达变化 |
| 2. 3 脾淋巴细胞培养上清液细胞因子水平 |
| 2. 4 血清SEA特异性Ig G及其亚类水平动态变化 |
| 2. 5 肝虫卵肉芽肿病变的变化 |
| 3 讨论 |
（9）共刺激信号ICOSL/ICOS介导Th2极化与HSCs活化效应在血吸虫病肝纤维化形成中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫病变过程中 Th2 极化相关共刺激分子表达动态变化 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物培育 |
| 2.2 实验动物模型的建立 |
| 2.3 脾淋巴细胞悬液制备 |
| 2.4 脾淋巴细胞表面共刺激分子的检测 |
| 2.5 小鼠肝脏组织内共刺激分子检测 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 ICOS-Tg 小鼠筛选及培育 |
| 3.2 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后不同病期 Th2 极化相关共刺激分子的表达 |
| 3.3 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后不同病期肝虫卵肉芽肿细胞与 Th2 极化相关共刺激分子的表达 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ICOS-Tg 小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号 ICOSL/ICOS 对宿主Th2 极化的作用 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物模型的建立 |
| 2.2 脾淋巴细胞悬液的制备 |
| 2.3 脾淋巴细胞培养 |
| 2.4 脾细胞培养上清中细胞因子的检测 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后不同病期脾淋巴细胞培养上清 IFN-γ检测 |
| 3.2 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后不同病期脾淋巴细胞培养上清 IL-12 检测 |
| 3.3 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后不同病期脾淋巴细胞培养上清 IL-4 检测 |
| 3.4 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后不同病期脾淋巴细胞培养上清 IL-13 检测 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ICOS-Tg 小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号 ICOSL/ICOS 对宿主肝脏纤维化的作用 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型的建立 |
| 2.2 血清 HA、HYP 水平的测定 |
| 2.3 肝组织内α-SMA、TGF-β1、Collagen- 免疫组化测定 |
| 2.4 肝组织胶原纤维 Masson 染色观察 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后血清中 HYP 水平检测 |
| 3.2 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后血清中 HA 水平检测 |
| 3.3 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后肝组织α-SMA 蛋白的表达 |
| 3.4 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后肝组织 Collagen- 蛋白的表达 |
| 3.5 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后肝组织 TGF-β1 蛋白的表达 |
| 3.6 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫后肝组织纤维化程度的变化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 ICOS-Tg 小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号 ICOSL/ICOS 对宿主HSCS 活化效应及肝纤维化的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型的建立 |
| 2.2 肝星状细胞（HSCs）的分离方法 |
| 2.3 肝星状细胞纯度鉴定 |
| 2.4 原代 HSCs 的培养 |
| 3 实时荧光定量 PCR 检测 |
| 3.1 小鼠 HSCs 总 RNA 抽提 |
| 3.2 总 RNA 反转录成双链 cDNA |
| 3.3 实时荧光定量 PCR 反应 |
| 3.4 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 小鼠肝星状细胞（HSCs）分离、鉴定及培养 |
| 4.2 日本血吸虫感染小鼠不同病期与 HSCs 活化相关基因α-SMA 的表达 |
| 4.3 ICOS-Tg 小鼠感染日本血吸虫不同病期 HSCs 中与肝纤维化相关基因的表达 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 英文缩写词表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士学习期间参与发表和待发表的论文 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（10）ICOS转基因小鼠感染日本血吸虫对CD28/CD86表达及Th1/Th2极化的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物模型的建立 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 脾淋巴细胞悬液制备 |
| 1.4 脾淋巴细胞CD28、CD86的检测 |
| 1.5 肝脏组织内CD28、CD86的检测 |
| 1.6 细胞因子诱生及检测 |
| 1.7 小鼠血清抗体Ig G及其亚类检测 |
| 1.8 小鼠肝脏虫卵肉芽肿病变的检测 |
| 1.9 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 脾淋巴细胞CD28、CD86的表达变化 |
| 2.2 肝组织CD28、CD86的表达变化 |
| 2.3 脾淋巴细胞培养上清细胞因子水平 |
| 2.4 血清Ig G及其亚类表达水平动态变化 |
| 2.5 Thl/Th2免疫偏移 |
| 2.6 肝虫卵肉芽肿病变动态变化 |
| 3 讨论 |
四、日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肿与Th1/Th2细胞因子水平的动态变化（论文参考文献）
- [1]小柴胡汤干预日本血吸虫致肝纤维化的实验研究[D]. 卢金. 江苏省血吸虫病防治研究所, 2021
- [2]日本血吸虫组织蛋白酶L3与甘油醛-3-磷酸脱氢酶的免疫功能分析[D]. 黄文铃. 武汉大学, 2020
- [3]ICOSL/ICOS调控日本血吸虫感染小鼠肝纤维化过程中HSCs凋亡相关信号通路的分子机制[D]. 仲梓溶. 苏州大学, 2020
- [4]γδ T细胞促进日本血吸虫感染小鼠早期肝纤维化作用及其机制研究[D]. 孙磊. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [5]日本血吸虫感染小鼠自然杀伤细胞变化特征的研究[D]. 王晓玲. 中国疾病预防控制中心, 2019
- [6]共刺激信号ICOSL/ICOS调控Tfh极化介导日本血吸虫病免疫病理的分子机制[D]. 王言言. 苏州大学, 2017(04)
- [7]ICOSL/ICOS信号介导日本血吸虫感染小鼠肝纤维化及HSCs活化的分子机制[D]. 曹蕴. 苏州大学, 2016(02)
- [8]日本血吸虫感染可诱导共刺激分子配体基因敲除小鼠CD154和CD40动态变化及对Th1/Th2偏移的影响[J]. 王瑜,夏超明. 北京大学学报(医学版), 2015(06)
- [9]共刺激信号ICOSL/ICOS介导Th2极化与HSCs活化效应在血吸虫病肝纤维化形成中的作用[D]. 梁松. 苏州大学, 2014(09)
- [10]ICOS转基因小鼠感染日本血吸虫对CD28/CD86表达及Th1/Th2极化的影响[J]. 王瑜,蔡茹,王波,夏超明. 中国医科大学学报, 2013(06)