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巨大芽孢杆菌对次生盐渍化土壤硝酸盐的转化途径及其机理研究

2020-12-02阅读(935)

巨大芽孢杆菌对次生盐渍化土壤硝酸盐的转化途径及其机理研究

论文摘要

设施栽培中土壤硝酸盐型次生盐渍化问题日益突出,不仅直接危害作物的正常生长,而且威胁农产品安全。利用微生物的同化作用降低土壤中的硝酸盐含量,不仅使氮素能被土壤固持且环境友好,在修复土壤次生盐渍化方面有巨大潜力。本研究以前期筛选到的一株巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）NCT-2为研究对象,解析该菌株的硝酸盐转化途径,深入研究其转化硝酸盐的机理,并考查该菌株在植物根际的定殖模式和对根际微生态的改良,研究成果可为硝酸盐型次生盐渍化土壤修复菌剂的开发和实际应用提供科学依据。主要研究结果如下:（1）巨大芽孢杆菌NCT-2可以在硝酸盐为唯一氮源的培养基中生长,好氧培养条件下菌株在对数生长期时,NO3--N被完全降解,并有少量NH4+-N生成,说明在好氧条件下可能存在硝酸盐异化还原成铵途径,但同化途径仍是菌株转化硝酸盐的主要途径。厌氧静止培养菌株,在排除同化作用干扰下,NO2--N含量下降,而NH4+-N含量上升,说明NCT-2菌株能利用NO2-生成NH4+,从而进一步推测了硝酸盐异化还原成铵途径的存在。在厌氧培养条件下,菌株未产生反硝化途径的中间产物N2O,说明NCT-2菌株不存在反硝化途径。（2）克隆了NCT-2菌株的同化型硝酸盐还原酶基因（nasBC）,并使其在大肠杆菌中过表达。该酶的电子还原亚基和催化亚基分别为87.3 kDa和80.5 kDa,最佳共表达条件为选用大肠杆菌BL21（DE3）细胞,在LB培养基中加入0.1 mM IPTG,在20°C和120 rpm条件下诱导10 h。该酶的纯化产物对温度和pH的耐受范围较广,最适温度和最适pH分别为35°C和6.2左右,该条件与设施栽培土壤条件类似。对该酶酶活促进作用和抑制作用最强的金属离子分别为Fe3+和Cu2+,最佳电子供体为MV+Na2S2O4+EDTA。该酶的酶促反应动力学参数Km为670μM,Vmax为58 U mg-1。（3）克隆了NCT-2菌株的同化型亚硝酸盐还原酶基因（nasDE）,并使其在大肠杆菌中过表达。该酶的大亚基和小亚基分别为88 kDa和11.7 kDa。最佳共表达条件为选用大肠杆菌BL21（DE3）细胞,在LB培养基中加入0.1 mM IPTG,在20°C和120rpm条件下诱导10 h。该酶的纯化产物对温度和pH的耐受范围较广,最适温度和最适pH分别为30°C和6.5左右,该条件与设施栽培土壤条件类似。对该酶酶活促进作用最强的金属离子为Fe3+,抑制作用最强的金属离子为Cu2+,最佳电子供体为MV+Na2S2O4。该酶的酶促反应动力学参数Km和Vmax分别为3.1 mM和5.2 U mg-1。（4）构建了绿色荧光蛋白标记重组菌株,该菌株能够成功定殖在玉米根系和根际土壤中。接种荧光标记重组菌菌剂能够显著促进土壤中硝酸盐的降解和植物生长。激光扫描共聚焦结果表明,NCT-2菌株是一株植物内生菌,能够定殖在根尖的分生区和伸长区以及根中段。土壤硝酸盐浓度对菌株的定殖分布无显著影响。在根系和根际土壤中的重组菌株群体数量先增加后下降,实验末期根际土壤中的定殖量稳定在每克土壤约5×104CFU。但在不同的处理中,根系定殖量又再次增加到每克根约1-3×104CFU。菌株在根系的定殖量受硝酸盐浓度影响显著。土壤硝态氮浓度为72 mg kg-1时,菌株在玉米根系的定殖量最高。（5）高通量测序结果表明,玉米根际土壤中的优势菌群为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、泉古菌门和绿弯菌门。接种NCT-2菌剂对根际细菌群落的OTU数量和α多样性无显著影响。硝酸盐的添加对OTU数量影响不显著,但对群落α多样性影响显著。β多样性的结果表明,接种NCT-2菌剂显著影响了玉米根际细菌群落组成,且组分随硝酸盐浓度而变化。丰度位于前十名的门水平物种受NCT-2菌剂影响显著。接种NCT-2菌剂不仅增加了与氮转化和抗生作用相关的种群丰度,还降低了根际土壤中的电导率并且增加了硝酸盐还原酶酶活。变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和浮霉菌门丰度与初始硝酸盐含量、电导率和硝酸盐还原酶密切相关。以上结果表明NCT-2菌剂对根际土壤理化性质和微生物多样性有显著的改善。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明
  • 第一章 绪论
  •   1.1 设施栽培土壤硝酸盐型次生盐渍化的现状与改良措施
  •     1.1.1 设施栽培土壤硝酸盐型次生盐渍化的现状
  •     1.1.2 设施栽培土壤硝酸盐型次生盐渍化的成因
  •     1.1.3 设施栽培土壤硝酸盐型次生盐渍化的改良措施
  •   1.2 微生物转化硝酸盐的途径
  •     1.2.1 硝酸盐同化途径
  •     1.2.2 反硝化途径
  •     1.2.3 硝酸盐异化还原成铵途径
  •   1.3 硝酸盐还原途径中关键酶的研究进展
  •     1.3.1 硝酸盐还原酶研究进展
  •     1.3.2 亚硝酸盐还原酶研究进展
  •   1.4 根际促生菌在农业中的应用前景
  •     1.4.1 根际中植物与微生物的互作
  •     1.4.2 根际微生物的作用机制
  •     1.4.3 PGPR菌株的筛选和鉴定
  •     1.4.4 PGPR的商业化
  •   1.5 根际微生物多样性的重要性及其应用
  •     1.5.1 链霉菌属多样性的重要性和应用
  •     1.5.2 芽孢杆菌属多样性的重要性和应用
  •     1.5.3 假单胞菌属多样性的重要性和应用
  •   1.6 论文的研究意义、内容与技术路线
  •     1.6.1 研究意义
  •     1.6.2 研究内容
  •     1.6.3 技术路线
  • 第二章 巨大芽孢杆菌NCT-2 硝酸盐转化途径解析
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料
  •     2.2.1 供试菌株与培养基
  •     2.2.2 主要材料与试剂
  •     2.2.3 仪器与设备
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 好氧、厌氧和静止培养条件的建立
  •     2.3.2 NCT-2 菌株生长曲线的测定
  •     2.3.3 培养基中无机氮和全氮含量测定
  •     2.3.4 菌体细胞干重和全氮含量测定
  •     2.3.5 氧化亚氮气体浓度测定
  •     2.3.6 统计学方法
  •   2.4 结果与讨论
  •     2.4.1 好氧培养条件下NCT-2 菌株DNRA途径的分析
  •     2.4.2 静止培养条件下菌株DNRA途径的分析
  •     2.4.3 厌氧条件下菌株NCT-2 反硝化途径的分析
  •   2.5 本章小结
  • 第三章 NCT-2 菌株硝酸盐还原酶的异源表达与酶学性质研究
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料
  •     3.2.1 供试菌株与质粒
  •     3.2.2 主要试剂与培养基
  •     3.2.3 仪器与设备
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 硝酸盐还原酶的序列比对分析
  •     3.3.2 硝酸盐还原酶表达菌株的构建
  •     3.3.3 重组硝酸盐还原酶的体外过表达与纯化
  •     3.3.4 硝酸盐还原酶酶活检测方法
  •     3.3.5 硝酸盐还原酶的酶学性质测定
  •     3.3.6 统计学方法
  •   3.4 结果与讨论
  •     3.4.1 硝酸盐还原酶的序列特征
  •     3.4.2 重组硝酸盐还原酶的过表达与纯化
  •     3.4.3 温度和pH对硝酸盐还原酶酶活的影响
  •     3.4.4 不同金属离子对硝酸盐还原酶酶活的影响
  •     3.4.5 不同电子供体对硝酸盐还原酶酶活的影响
  •     3.4.6 硝酸盐还原酶酶活的动力学参数
  •   3.5 本章小结
  • 第四章 NCT-2 菌株亚硝酸盐还原酶的异源表达与酶学性质研究
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料
  •     4.2.1 供试菌株与质粒
  •     4.2.2 主要试剂与培养基
  •     4.2.3 仪器与设备
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 亚硝酸盐还原酶的序列比对分析
  •     4.3.2 亚硝酸盐还原酶表达菌株的构建
  •     4.3.3 重组亚硝酸盐还原酶的体外过表达与纯化
  •     4.3.4 亚硝酸盐还原酶酶活检测方法
  •     4.3.5 亚硝酸盐还原酶的酶学性质测定
  •     4.3.6 统计学方法
  •   4.4 结果与讨论
  •     4.4.1 亚硝酸盐还原酶的序列特征
  •     4.4.2 重组亚硝酸盐还原酶的过表达与纯化
  •     4.4.3 温度和pH对亚硝酸盐还原酶酶活的影响
  •     4.4.4 不同金属离子对亚硝酸盐还原酶酶活的影响
  •     4.4.5 不同电子供体对亚硝酸盐还原酶酶活的影响
  •     4.4.6 亚硝酸盐还原酶酶活的动力学参数
  •   4.5 本章小结
  • 第五章 NCT-2 菌株的根际定殖模式与促生作用
  •   5.1 引言
  •   5.2 实验材料
  •     5.2.1 供试菌株与培养基
  •     5.2.2 主要材料与试剂
  •     5.2.3 仪器与设备
  •   5.3 实验方法
  •     5.3.1 绿色荧光蛋白重组质粒的构建
  •     5.3.2 巨大芽孢杆菌原生质体的制备与转化
  •     5.3.3 荧光标记重组菌的生长曲线测定
  •     5.3.4 荧光标记重组菌的遗传稳定性测定
  •     5.3.5 盆栽实验
  •     5.3.6 荧光标记重组菌在玉米幼苗定殖部位和数量的观测
  •     5.3.7 玉米生长指标测定
  •     5.3.8 统计学方法
  •   5.4 结果与讨论
  •     5.4.1 巨大芽孢杆菌NCT-2 中绿色荧光蛋白基因的表达
  •     5.4.2 荧光标记重组菌株在玉米幼苗根际的定殖量对土壤硝酸盐含量的响应
  •     5.4.3 荧光标记重组菌在玉米幼苗根系的定殖分布
  •     5.4.4 荧光标记菌株对玉米根系的促生作用
  •   5.5 本章小结
  • 第六章 NCT-2 菌株对根际细菌群落多样性的影响
  •   6.1 引言
  •   6.2 实验材料
  •     6.2.1 供试菌株与培养基
  •     6.2.2 主要材料与试剂
  •     6.2.3 仪器与设备
  •   6.3 实验方法
  •     6.3.1 盆栽实验
  •     6.3.2 土壤样本采集与DNA提取
  •     6.3.3 PCR扩增与高通量测序
  •     6.3.4 土壤硝酸盐含量、电导率和硝酸盐还原酶的测定
  •     6.3.5 测序数据分析
  •     6.3.6 统计学方法
  •   6.4 结果与讨论
  •     6.4.1 测序数据上传序列号
  •     6.4.2 根际土壤细菌的测序数据统计
  •     6.4.3 玉米根际土壤的微生物群落组成
  •     6.4.4 玉米根际土壤微生物群落的α多样性和β多样性分析
  •     6.4.5 不同处理间玉米根际土壤细菌群落的差异
  •     6.4.6 土壤理化性质对丰度前十门水平物种的影响
  •     6.4.7 玉米根际土壤细菌群落的互作网络分析
  •     6.4.8 玉米根际细菌群落的功能预测
  •   6.5 本章小结
  • 第七章 结论与展望
  •   7.1 研究结论
  •   7.2 论文创新点
  •   7.3 研究展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读博士学位期间的科研成果

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 初少华

    导师: 周培

    关键词: 设施栽培,巨大芽孢杆菌,硝酸盐,次生盐渍化,根际定殖,微生物多样性

    来源: 上海交通大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 自然地理学和测绘学,农业基础科学,农艺学

    单位: 上海交通大学

    分类号: S156.4

    DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.000135

    总页数: 147

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