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圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

2020-12-10阅读(533)

圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

论文摘要

圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）是一种典型的产油酵母,能在多种营养元素限制下产油脂,另外还可合成类胡萝卜素。但是作为非模式酵母,圆红冬孢酵母的遗传操作平台还很不成熟。本研究主要在R.toruloides NP11（简称Rt NP11）中建立CRISPR/Cas9基因编辑系统,为遗传改造提供技术手段。通过农杆菌介导转化法将内源二酯酰甘油酰基转移酶基因DGAT2（Diacylglycerol acyltransferase）转入Rt NP11菌株中,得到过表达DGAT2的菌株Rt NP11-DGAT2,比较评价细胞油脂含量的变化。在此转化方法基础上,从Rt NP11基因组中克隆RNA聚合酶III启动子U6,从Rt NP11基因组中鉴定tRNAGly基因,U6与tRNAGly基因融合形成人工杂合启动子U6-tRNAGly。合成密码子优化的Cas9基因,Cas9表达元件与gRNA转录元件通过Gibson方法连接到质粒框架,以类胡萝卜素合成途径中的关键基因—八氢番茄红素脱氢酶基因CRT1为CRISPR编辑的验证靶点,20 bp的靶基因序列通过PCR扩增引入载体中,构建表达载体并转入Rt NP11,得到重组菌Rt NP11-U6-tRNAGly Target 1;为了提高基因编辑效率,首先改变gRNA启动子,得到重组菌Rt NP11-SNR52-tRNAGly Target 1、Rt NP11-SCR1-tRNAGly Target 1和Rt NP11-SCR1-tRNALys-tRNAGly Target 1,其次在CRT1基因上设计新的靶序列Target 2、Target 3,得到重组菌Rt NP11-SNR52-tRNAGly Target 2、Rt NP11-SNR52-tRNAGly Target 3、Rt NP11-SCR1-tRNAGly Target 2、Rt NP11-SCR1-tRNAGly Target 3、Rt NP11-U6-tRNAGly Target 2和Rt NP11-U6-tRNAGly Target 3,通过表型观察、DNA测序,分析基因突变情况。结果表明农杆菌介导转化技术能够有效转化Rt NP11,过表达DGAT2基因使细胞油脂含量提高50%。Rt NP11被Cas9切割后在切割位点附近存在碱基缺失和碱基增加两种修复模式。gRNA的启动子影响CRISPR/Cas9基因编辑效率,其中SCR1-tRNAGly的编辑效率最高,为20%,而改变靶序列未能提高基因编辑效率。本研究建立的CRISPR/Cas9基因编辑系统为圆红冬孢酵母的高效基因编辑奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 圆红冬孢酵母概述
  •     1.1.1 圆红冬孢酵母的分类地位和生理特征
  •     1.1.2 圆红冬孢酵母应用研究进展
  •   1.2 微生物油脂概述
  •     1.2.1 微生物油脂的概念和特点
  •     1.2.2 二酰甘油酰基转移酶（DGAT）在油脂合成中的作用
  •     1.2.3 DGAT在油脂合成中的应用
  •   1.3 圆红冬孢酵母遗传工程研究进展
  •     1.3.1 圆红冬孢酵母遗传转化方法
  •     1.3.2 圆红冬孢酵母遗传表达系统研究概况
  •   1.4 CRISPR/Cas9 基因编辑系统在遗传操作中的应用
  •     1.4.1 CRISPR/Cas9 基因编辑系统概述
  •     1.4.2 CRISPR/Cas9 基因编辑系统的应用
  •   1.5 本文研究思路
  • 第二章 圆红冬孢酵母遗传转化方法的建立
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料和方法
  •     2.2.1 菌株和质粒
  •     2.2.2 引物
  •     2.2.3 试剂
  •     2.2.4 仪器和设备
  •     2.2.5 培养基
  •     2.2.6 RNA提取
  •     2.2.7 RNA反转录
  •     2.2.8 聚合酶链式反应（PCR）
  •     2.2.9 PCR产物纯化
  •     2.2.10 重组质粒的构建
  •     2.2.11 重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
  •     2.2.12 重组质粒的提取
  •     2.2.13 重组质粒酶切验证
  •     2.2.14 E.coli菌种的保藏与测序
  •     2.2.15 重组质粒转化农杆菌AGL1 感受态细胞
  •     2.2.16 农杆菌菌落PCR鉴定
  •     2.2.17 农杆菌菌种的保藏
  •     2.2.18 农杆菌与酵母共培养
  •     2.2.19 圆红冬孢酵母基因组提取
  •     2.2.20 酵母转化子的鉴定和保藏
  •     2.2.21 生长曲线的测定
  •     2.2.22 油脂的提取
  •   2.3 结果与讨论
  •     2.3.1 质粒酶切验证结果分析
  •     2.3.2 农杆菌PCR验证结果分析
  •     2.3.3 酵母转化子鉴定结果分析
  •     2.3.4 过表达DGAT2 基因对Rt NP11 油脂合成的影响
  •   2.4 本章小结
  • 第三章 圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9 基因编辑系统的构建
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料和方法
  •     3.2.1 菌株和质粒
  •     3.2.2 引物
  •     3.2.3 聚合酶链式反应（PCR）
  •     3.2.4 重组质粒的构建
  •     3.2.5 免疫印迹（Western Blot）
  •     3.2.6 酵母转化子的测序
  •   3.3 结果与讨论
  •     3.3.1 质粒酶切验证结果分析
  •     3.3.2 农杆菌PCR验证结果分析
  •     3.3.3 酵母转化子Cas9 蛋白表达检测
  •     3.3.4 酵母转化子鉴定结果分析
  •     3.3.5 酵母转化子测序结果
  •   3.4 本章小结
  • 第四章 gRNA启动子对圆红冬孢酵母基因编辑效率的影响
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料和方法
  •     4.2.1 菌株和质粒
  •     4.2.2 引物
  •     4.2.3 聚合酶链式反应（PCR）
  •     4.2.4 重组质粒的构建
  •     4.2.5 酵母转化子的鉴定和测序
  •   4.3 结果与讨论
  •     4.3.1 质粒酶切验证结果分析
  •     4.3.2 农杆菌PCR验证结果分析
  •     4.3.3 酵母转化子表型鉴定
  •     4.3.4 酵母转化子测序结果
  •     4.3.5 四种gRNA启动子的基因编辑效率比较
  •     4.3.6 温度对基因编辑效率的影响
  •   4.4 本章小结
  • 第五章 切割位点对圆红冬孢酵母基因编辑效率的影响
  •   5.1 引言
  •   5.2 材料和方法
  •     5.2.1 菌株和质粒
  •     5.2.2 引物
  •     5.2.3 聚合酶链式反应（PCR）
  •     5.2.4 重组质粒的构建
  •     5.2.5 酵母转化子的鉴定与测序
  •   5.3 结果与分析
  •     5.3.1 质粒酶切验证结果分析
  •     5.3.2 酵母转化子表型鉴定
  •   5.4 本章小结
  • 第六章 结论和展望
  •   6.1 结论
  •   6.2 展望
  • 参考文献
  • 攻读学位期间的研究成果
  • 附录
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 赵晨

    导师: 张培玉

    关键词: 圆红冬孢酵母,启动子,基因编辑

    来源: 青岛大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 青岛大学

    分类号: Q78

    DOI: 10.27262/d.cnki.gqdau.2019.001830

    总页数: 64

    文件大小: 2560K

    下载量: 116

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