吴斌[1]2003年在《海藻糖合成酶基因克隆及其转化草莓的研究》文中指出干旱是影响植物生长发育和限制农作物产量提高的主要环境因子。利用传统的方法至今尚未培养出真正的耐旱、耐盐品种。植物耐旱分子机制的研究和生物技术的日臻完善，为培育高效耐旱植物迎来了曙光。 海藻糖是由两个葡萄糖分子以α、α1→1糖苷键结合的非还原性双糖，对许多生物的抗逆耐受性起着重要作用。酵母细胞中的海藻糖由TPS1、TPS2，TPS3和TSL1四个基因负责合成，其编码的多肽组成一个海藻糖合酶复合体。TPS1基因编码UDP-葡萄糖依赖性的海藻糖-6-磷酸合酶，TPS2基因编码海藻糖-6-磷酸酯酶，TPS3和TSL1两个基因的产物可能对复合体起稳定和调节作用。实验证实TPS1基因就可以使生物体获得产生海藻糖的能力，酵母的海藻糖合成酶复合体中6-磷酸-海藻糖的脱磷酸化作用是非特异性的，它可由生物体内的其它酯酶所代替。 提取酿酒酵母的总DNA，以此为模板，采用PCR的方法从酿酒酵母中克隆出了1.488kb的海藻糖合成酶基因TPS1片段，通过XbaⅠ和SmaⅠ双酶切，与同样经过XbaⅠ和SmaⅠ双酶切的pUC118载体质粒连接，转入大肠杆菌DH5α中，通过蓝白斑筛选重组子。经过酶切和PCR鉴定表明TPS1基因克隆进载体中。将克隆出的序列进行了测序。 通过同样方法将该片段连接到pBI121载体上，转化海藻糖合成酶基因缺失的大肠杆菌(菌株号FF4169，FF4169：MC4100 otsA1：：Tn10，MC4100为otsBA~+基因野生型菌株)。生长曲线表明，带有克隆片段的转化株在0.5mol／L NaCl的高渗透压培养基中生长良好，而作为对照的缺失株则几乎不能生长。这表明克隆所得到的片段具有海藻糖合成酶活性。 将带有TPS1基因的pBI121载体转入根癌农杆菌LBA4404中，构建了双元转化载体，经菌落原位杂交鉴定，证明TPS1基因已经转入农杆菌中。 采用叶盘法利用转化了的农杆菌对草莓进行侵染，用无菌滤纸吸干叶片上多余菌液，在培养基上共培养叁天，共培养后的叶片在附加40mg／L Kan和200mg／L Cef的再生培养基上选择培养，筛选出的不定芽在附加25mg／L Kan的草莓继代培养基上继续筛选培养并增殖，增殖后的草莓植株转入附加25mg／L Kan的生根培养基上生根，提取生根后抗性植株的DNA，经过PCR和点杂交鉴定，证实所获得植株为转化植株。
张宁[2]2004年在《应用甜菜碱醛脱氢酶基因工程提高马铃薯抗逆性的研究》文中认为干旱和盐碱是影响植物生长发育最主要的非生物胁迫因子，许多重要的农作物如水稻、马铃薯、烟草等对干旱和盐碱比较敏感，缺乏有效的耐旱机理，经常因干旱和盐碱造成严重的产量损失。培育抗旱耐盐农作物新品种是利用干旱盐碱地最为经济、有效的措施。随着现代分子生物技术的飞速发展，通过基因工程技术改良农作物抗旱耐盐性工作取得了很大的进展。高等植物适应环境胁迫的重要生理机制之一是渗透调节，甜菜碱是其中最重要的渗透调节物质之一。而且它的合成途径简单，对细胞无毒害，具有稳定酶和细胞膜结构，清除过氧化物等非渗透保护功能，被认为是最有希望的渗透调节物质之一。许多农作物如水稻、马铃薯、烟草、番茄等自身并不能积累甜菜碱，如果利用基因工程技术，把与甜菜碱合成相关的基因转入农作物，使其积累甜菜碱，将有可能达到增强农作物抗旱耐盐性的目的。迄今为止，已有不少植物被成功地导入了与甜菜碱合成相关的基因，并在不同程度上提高了这些植物的抗旱耐盐性。本研究的主要目的是从菠菜中分离合成甜菜碱的关键酶甜菜碱醛脱氢酶（Betaine aldehyde dehydrogenase，BADH）基因，从拟南芥中分离干旱、盐碱、低温及ABA诱导型启动子rd29A，构建CaMV 35S 和rd29A启动子驱动的BADH基因表达载体，然后转入优良马铃薯栽培品种中，提高其抗旱耐盐性。同时，研究不同启动子驱动的外源基因在逆境胁迫下高效表达的分子机理，为丰富植物转基因理论和培育抗逆作物新品种提供理论依据。取得的主要研究结果如下：1．从菠菜叶片中分离了BADH基因的cDNA，序列分析结果表明该基因含有1494 bp长度的开放阅读框，编码497个氨基酸。核酸序列同源性分析表明，该cDNA与已发表的菠菜BADH基因具有99.87%的同源性，与其它植物的BADH 基因也有80%以上的同源性。Northern杂交结果表明，BADH mRNA转录水平随盐浓度的增加而提高，经500 mmol/L NaCl持续处理4 d 时，BADH基因的转录约为对照水平的4倍。随着干旱胁迫天数的增加，菠菜叶片中BADH mRNA含量明显增加。这些实验结果表明菠菜BADH 基因的表达受盐胁迫和干旱胁迫的诱导。2．从拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中用PCR技术分离了rd29A基因上游824 bp的调控序列，序列分析表明该片段与已报道的rd29A启动子有99.39%的同源性，包括缺水诱导表达元件DRE、ABA作用元件ABRE等顺式作用元件。将此片段与GUS基因连接构建了植物表达载体pBIrd，用农杆菌介导法获得了转基因马铃薯植株。对转基因植株进行的GUS基因Northern杂交和GUS活性组织染色的分析结果是一致的，未受诱导处理的转基因植株GUS基因有微弱表达，而逆境4℃低温、100 μmol/L ABA、缺水和250 mmol/L NaCl胁迫处理24 h均可诱导GUS大量表达，且rd29A启动子驱动的GUS基因表达无组织特异性。<WP=8>3．将BADH基因分别与组成型启动子CaMV 35S和逆境诱导表达型启动子rd29A融合，构建了植物表达载体pBIBB和pBIrB，通过冻融法导入根癌农杆菌LBA4404中，经酶切鉴定和PCR检测证明表达载体已导入农杆菌中。4．用组成型启动子CaMV 35S驱动的BADH基因表达载体pBIBB转化烟草，获得了卡那霉素抗性植株。经PCR、Southern、Northern杂交，证明BADH基因已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。对获得的转基因植株叶片中甜菜碱醛脱氢酶活性进行了测定，结果显示未转基因的对照植株没有BADH酶活性，转基因植株的各个株系间甜菜碱醛脱氢酶比活力差异较大，范围在0.1-1.0 U/mg之间，转BADH基因的烟草在盐胁迫和PEG条件下，生长状态良好，生长势强于未转基因的植株。说明本实验克隆的BADH基因能在异源植物中进行正常翻译表达。5．以两个马铃薯栽培品种甘农薯2号和Favorita的试管薯为供体材料，分别用组成型启动子CaMV 35S和逆境诱导表达型启动子rd29A驱动的BADH基因表达载体pBIBB和pBIrB进行遗传转化，获得了转基因马铃薯。通过PCR扩增和Southern杂交表明BADH基因已整合到受体马铃薯的基因组中。Northern杂交分析表明，未转基因的马铃薯对照中检测不到BADH基因的转录产物；转rd29A启动子驱动的BADH基因马铃薯中，BADH基因仅有微弱表达，在受干旱和NaCl胁迫的诱导时BADH基因才会较强地转录；但在转CaMV 35S启动子驱动的BADH基因马铃薯中，BADH基因的表达较强且不受胁迫条件诱导。6．BADH酶活性分析表明，在转CaMV 35S启动子驱动的BADH基因马铃薯中，各转化株系在胁迫前后BADH酶活性近似，但在不同的转基因个体间BADH酶活性差异较大，变化范围在2-11 U之间，而对照检测不到。BADH酶活性与叶片的相对电导率有一定的负相关关系（y=-3.7264x+57.898，r2=0.9202），说明BADH酶活性越强，对植株细胞膜通透性的保护能力越强，证明外源BADH基因的导入，确实提高了转基因马铃薯植株在干旱和盐胁迫条件下的抗性。在转rd29A启动子驱动的BADH基因马铃薯中，植株在未经胁迫时，BADH酶活性很低，但当转化植株分别经NaCl和PEG胁迫后，BADH酶活性显着提高，其活性值在10-12 U之间，而且株系间差异很小，表明转rd29A启动子驱动的BADH基因的不同马铃薯株系抗旱耐盐能力相近。7．对转基因马铃薯植株的形态学观察表明，转基因植?
岳川[3]2015年在《茶树糖类相关基因的挖掘及其在茶树冷驯化中的表达研究》文中进行了进一步梳理糖作为生命有机体的重要能量和物质来源,在植物生长发育及逆境胁迫响应调控中具有重要的作用。逆境胁迫下,植物通过调节体内糖的分配,维持细胞的渗透势、氧化还原水平等的平衡;糖还作为信号分子调控逆境相关基因的转录,从而提高植物对逆境的抵御能力。冷驯化作用诱导茶树中糖的积累,与茶树抗寒能力的提高密切相关。然而,糖的代谢、运输和信号转导受大量酶的调控,从酶学水平上研究糖在茶树抗寒中的作用机制困难较大。前期的研究发现碳水化合物相关基因在茶树冷驯化过程中的表达差异显着。因此,从基因水平上研究糖相关的酶基因的表达调控,有助于进一步揭示糖介导的茶树抗寒响应机理。本研究首先分析了冷驯化作用对茶树中主要糖含量等的影响;其次克隆了茶树中糖代谢、转运及信号转导相关的基因,共72个,对它们的生物信息学进行了详细的分析,并用荧光定量PCR(q RT-PCR)研究了它们在茶树自然冷驯化中的表达模式。为揭示糖介导的茶树抗寒机制研究奠定了基础。主要研究结果如下:1.冷驯化过程中,茶树中的淀粉含量降低,蔗糖、葡萄糖等可溶性糖含量升高,同时脯氨酸和丙二醛等也发生改变,茶树抗寒能力的提高。电镜观察显示,冷驯化对茶树叶绿体结构的影响较明显。淀粉代谢、蔗糖代谢等通路与茶树冷驯化密切相关。2.淀粉代谢与植物抗寒响应密切相关。在淀粉代谢途径中,克隆了茶树中2个淀粉合成酶基因(Cs SS3和Cs SS4)、9个β-淀粉酶家族基因(Cs BAM1-9)、3个α-淀粉酶家族基因(Cs AMY1-3),以及麦芽糖转运蛋白Cs MEX1基因和麦芽糖转葡萄糖基酶Cs DPE2基因。分析了它们的生物信息学特征,荧光定量PCR检测了这些基因在茶树自然冷驯化中的表达模式。冷驯化调控茶树中淀粉代谢相关基因表达,提高β-淀粉酶活性变化。克隆了1 515 bp的Cs BAM3启动子区,分析显示含多种逆境响应元件,并对Cs BAM3进行了原核表达分析。3.逆境胁迫下,可溶性糖,如蔗糖、海藻糖和RFO等含量提高能够保护植物免受胁迫的伤害。在他们的合成通路中,克隆了28个基因。分析了这些基因编码的蛋白质理化性质、蛋白质高级结构和系统发育等生物信息学特征。基因表达显示,糖代谢的基因受低温诱导,特别是Cs INV5等能够被显着上调表达。克隆了茶树Cs INV5启动子区930 bp的序列,分析显示其含有低温等胁迫响应的元件。4.糖的分配受糖转运蛋白的调控,从而影响植物对逆境的响应。我们从茶树中克隆了包括SUTs、ERD6-like、SWEETs、TMTs等7种不同类型的糖转运蛋白基因20个。生物信息学分析显示,它们均含有糖转运蛋白典型的跨膜螺旋结构。冷驯化过程中,大部分转运蛋白基因上调表达,参与糖输出的转运蛋白基因的表达被抑制,它们可能调控了低温驯化中糖的分配。5.己糖激酶(HXK)和蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1(Sn RK1)是植物糖信号转导途径中的重要调控元件,我们在茶树中分别克隆3个HXK基因(Cs HXK1-3)和3个Sn RK1基因(Cs Sn RK1.1-1.3),同时还分离了Cs Sn RK2.6和Cs Sn RK2.8两个逆境胁迫响应基因。在冷驯化过程中,Cs HXK3、Cs Sn RK1.2和Cs Sn RK2.8的表达显着上调,Cs HXK2、Cs Sn RK1.3和Cs Sn RK2.6的表达被抑制,而Cs HXK1和s Sn RK1.1的表达变化不显着。克隆了Cs HXK3上游2 538 bp的启动子序列片段,分析显示含多个低温响应元件以及多种逆境响应相关的元件。
宋红霞[4]2015年在《普通白菜成花转变基因表达谱比较及BrcLFY基因克隆与表达分析》文中指出植物从营养生长向生殖生长转变的成花过程,不仅关系着物种的延续,而且与人类生活紧密相关。普通白菜(Brassica rapa ssp. chinensis; Brassica campestris ssp. chinensis Makino)属于十字花科芸薹属,原产于我国,全国各地均有栽培,近年来在亚洲其它国家,北美和欧洲一些国家引种栽培,已逐渐成为世界性蔬菜。目前大白菜基因组测序完成和基因注释信息的不断丰富为普通白菜和白菜类其它蔬菜开花研究提供了有利条件,尽管芸薹属蔬菜花期分子调控陆续有少量研究报道,但相比模式植物拟南芥开花分子机制的研究结果仍然不够深入,因此,深入研究普通白菜成花机制,对白菜类乃至十字花科蔬菜育种均具有重要意义。本研究以普通白菜为试材,在优化普通白菜开花系统的基础上,采用石蜡切片技术和电镜扫描技术鉴定了普通白菜的花芽分化过程。运用基因表达谱技术分析普通白菜花芽分化1级与两个未分化对照的基因表达情况,从中筛选成花转变过程相关的基因和代谢通路。此外对成花转变过程中蛋白质和可溶性糖含量等进行测定并分析该过程蔗糖和淀粉代谢通路相关的差异表达基因。采用RT-PCR方法对控制花序分生组织向花分生组织转变的BrcLFY基因进行克隆、序列分析和表达研究,以期进一步完善普通白菜成花调控机理。主要研究结果如下：1.比较不同冬性的两个普通白菜自交系‘75#’和‘78#’萌动种子低温处理10 d，20d和30d的开花情况,发现低温处理时间越长,现蕾的时间越早,开花时的叶片数越少。‘75#’开花的最佳低温处理时间为20 d,而‘78#’需要30 d或更长时间。比较‘75#’品系在不同种植密度下的开花表现,发现采用50孔穴盘种植的植株早于72穴盘种植的植株,定植后70 d观察植株的开花表现,50孔种植的植株现蕾率高于72孔36.11%。因此在普通白菜开花研究中,宜选用‘75#’品系低温处理20 d,采用50孔穴盘种植。2.花芽分化是营养生长向生殖生长转变的形态标志,对普通白菜生长点进行组织切片,发现采用番红单染2h的组织结构清晰、染色效果均匀且稳定；而固绿单染时各时间梯度均不清晰；采用番红固绿对染染色稳定性也较差。采用番红单染2h的方法和扫描电镜对普通白菜的花芽分化过程进行观察鉴定,将花芽分化分为6个阶段：营养生长期、花芽分化1级、花芽分化2级、花芽分化3级、花芽分化4级和花芽分化5级。3.采用高通量测序的Illumina HiSeqTM 2500平台对普通白菜叁个发育时期的顶端组织进行表达谱分析,结果表明,花芽分化1级与低温处理未分化对照样品组合1,486个差异表达基因中,上调基因505个,下调基因981个；GO富集分析显示这些基因编码的蛋白主要位于质外体、细胞壁和叶绿体等8个细胞区域,具备转录因子和氧化还原酶活性等8种分子功能,参与茉莉酸和水杨酸代谢、糖代谢和蛋白磷酸激酶合成等72种生物学过程；KEGG代谢通路分析有4条路径显着富集；与大白菜开花基因进行比对发现有18个大白菜同源开花基因。对上下调10倍以上的109个基因进行详尽分析,发现有15个基因涉及生殖发育,其中Bra022565、Bra034674、Bra027530、Bra003998和Bra031255的拟南芥同源基因直接与成花转变相关,说明这些基因在白菜成花转变过程中具有一定的作用。4.比较普通白菜花芽分化1级与未低温处理对照样品的表达谱,鉴定出962个差异表达基因,其中258个表达上调,704个表达下调,倍性变化集中在2-5倍。GO富集分析显示这些基因编码的蛋白主要位于液泡、质外体和植物细胞壁等7个细胞区域。具有铁离子结合和血红素结合等5种分子功能,参与糖代谢、低温响应和氧化还原等56种生物学过程。KEGG代谢通路分析发现内质网中的蛋白质处理和黄酮类代谢途径是主要途径。与大白菜开花基因比对发现有11个大白菜同源开花基因。在表达上下调差异10倍以上的69个基因中7个与生殖发育相关,并且Bra034357和Bra000506的拟南芥同源基因直接与成花转变相关,说明这些基因可能和普通白菜成花转变有关。5.对普通白菜从营养生长到现蕾不同发育时期的蛋白质和可溶性糖含量等进行测定并分析蔗糖和淀粉代谢通路的差异表达基因,结果表明,从萌动种子到花芽分化前蛋白质、可溶性糖和淀粉含量均缓慢增加,花芽分化1级时,其含量均显着增加,持续增加到花芽分化3级,花芽分化3级后蛋白质和糖含量开始下降,直到现蕾期再次升高,但淀粉从花芽分化3级后持续下降,而相应蔗糖和淀粉代谢通路中差异表达基因的表达均有利于蔗糖和淀粉的积累,与试验测定的含量增减规律一致。6.采用逆转录聚合酶链式反应方法克隆获得普通白菜LFY同源基因BrcLFY, BrcLFY的cDNA全长1,353 bp,开放阅读框包含1,260 bp核苷酸,编码419个氨基酸。序列分析表明,与十字花科蔬菜尤其是白菜类蔬菜的同源性较高。荧光定量分析表明,BrcLFY表达量在植株营养生长时期缓慢增加,到花芽分化1级迅速增加,进入分化5级表达量最高。比较各器官的表达,花芽分化3级和初蕾期均为幼叶和成熟叶的表达量高于其它组织。分析萌动种子和5叶幼苗在低温处理0d、10d和20 d的表达,BrcLFY基因随低温处理时间延长表达量大幅增加。这说明BrcLFY的高表达有利于普通白菜花芽分化。
高波[5]2016年在《吉兰泰盐湖土壤中嗜盐碱放线菌的分离鉴定及四氢嘧啶工程菌株的构建》文中认为1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸(1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine carboxylic acid)又称四氢嘧啶(ectoine),是一种渗透压补偿溶质。分子量142.2g/mol,分子式为C6H10N2O2,为环状氨基酸的衍生物。四氢嘧啶能够平衡渗透压的特质与其可以稳定和保护大分子如蛋白质、DNA以及酶等的功能,使其具有较高的开发利用价值。本文以吉兰泰盐湖的土壤为材料,共分离获得29株嗜盐碱放线菌。对分离获得的菌株进行16S rDNA酶切多态性分析,并对代表菌株进行16S rDNA序列测定,其中获得3株拟诺卡氏菌株。80%乙醇法抽提分离获得菌株胞内的四氢嘧啶,然后进行薄层层析定性检测相结合,快速筛选出能够生产相容性溶质四氢嘧啶的放线菌。Streptomyces pactum Act12是1株多功能放线菌株,TLC定性检测可知其能够产生相关耐盐的相容性溶质四氢嘧啶。Streptomyces pactum Act12可在NaCl范围为0~10.0%内生长,而在2.5%的NaCl浓度下,胞内的四氢嘧啶积累量达到最大值,为72.39mg/L。经过生物信息学分析:ectA、ectB和ectC基因位于Streptomyces pactum Act12中的同一个操纵子上,而大小分别为516bp、1272bp、399bp。预测ectA、ectB、ectC分别编码二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、四氢嘧啶合成酶(EctC),其大小依次为18.8kDa(171 amino acid)、46.6kDa(423 amino acid)、14.9kDa(132 amino acid)。利用高保真酶Pfu克隆大小为2408bp的ectABC基因簇到表达载体pET-28a上并转化大肠杆菌BL21(DE3)。含pET28a-ectABC质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中经0.5mmol/L IPTG在37℃诱导6h后,能够合成四氢嘧啶,但其盐耐受度未得到明显提高。四氢嘧啶合成的前体L-天冬氨酸-β-半醛,是由L-天冬氨酸在天冬氨酸激酶(Aspartokinase;Ask)和天冬氨酸半醛脱氢酶(Aspartate-semialdehyde dehydrogenase;Asd)催化下生成,Ask和Asd是四氢嘧啶合成的关键限速酶。在440种含有四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶基因的微生物基因组中,只有约30%(132种微生物)在ectABC/D基因簇附近含有一个天冬氨酸激酶基因。在Act12全基因组中,Ask和Asd都是单拷贝,两者位置紧邻。本文将四氢嘧啶合成中的关键限速酶Ask和Asd在Streptomyces pactum Act12中过表达,以期提高Streptomyces pactum Act12的盐耐受度及四氢嘧啶的产量。
高云慨[6]2014年在《一株对芒果炭疽病菌有拮抗作用的酵母菌的鉴定、生防效果评价及抗逆性改良》文中指出芒果采后炭疽病由胶孢炭疽菌(Colletolrichum gloeosporioides (Penz.) Penz.&Sacc)引起,是全世界芒果产区最主要的芒果采后病害。该病通常以潜伏感染未成熟果实的形式存在,而在采后贮藏和运输期间造成果实的损伤,会加重病害的发生。使用化学杀菌剂是目前减少该病害采后损失最主要的方法。然而,化学杀菌剂的使用不但会严重影响人们的身心健康,而且会使病原菌产生抗病性。因此,人们渴望寻找能够取代杀菌剂的新方法来进行果实采后病害的控制。利用微生物拮抗菌来控制果实采后病害已经被认为是最有潜力能够代替化学杀菌剂的安全方法之一。然而,最近尽管有少量利用拮抗酵母菌防治芒果采后炭疽病的报道,但由于这些拮抗酵母菌多是非热带地区果实上分离,其适应热带气候能力和防治效果都不尽如人意。本研究旨在通过in vitro和in vivo的方法从海南地区果实表面和伤口处筛选出对芒果采后炭疽病具有生防潜力的拮抗酵母菌,同时对其进行鉴定,研究了该酵母拮抗菌对芒果采后炭疽病的抑病机理,并对酵母拮抗菌与外源物质配合使用,以及对该酵母拮抗菌通过抗逆性改良途径来提高其生防能力等进行了初步研究。实验结果如下：1、从海南地区果实表面和伤口处共分离到130株酵母菌,通过平板对峙法和活体筛选法筛选到4株有较好抑菌活性的生防酵母,其中效果最好的1株酵母菌(编号LZ5),通过形态学、生理生化及26S rRNA D1/D2分子鉴定为季也蒙毕赤氏酵母Meyerozyma guilliermondii LZ5,该菌株对芒果采后炭疽病表现出明显的抑制效果,在离体条件下抑菌圈直径可达到13.2mm,而在活体条件下,芒果果实的发病率和病斑直径仅分别为60%和4.27mm。2、浓度为1×108CFU/mL的拮抗菌M.guilliermondii LZ5培养原液和悬浮液在离体条件下,能够显着抑制病原菌C.gloeosporioides孢子萌发和芽管的伸长,而灭菌原‘液和培养滤液则无抑制效果。扫描电镜结果显示,在芒果果实伤口处拮抗菌M.guilliermondii LZ5能够显着抑制病原菌的生长。拮抗菌M.guilliermondii LZ5的接种浓度对生防效果密切相关,其中,使用浓度越高发病率和病斑直径就越小。拮抗菌M.guilliermondii LZS在果实伤口处能够快速繁殖且不受病原菌C.gloeosporioides的影响,其中在接种后第48h后拮抗菌数量达到最大值,之后数量能够保持在较高的水平。相比于对照果实,拮抗菌M.guilliermondii LZ5能够显着诱导芒果果实苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性的升高。3、氯化钙(CaCl2,4%)通过直接抑制炭疽病原菌的生长和促进拮抗菌的增殖以及提高芒果果实苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的活性以及几丁质酶(CHI)和过氧化物酶(POD)基因的表达。从而显着提高拮抗菌M.guilliermondii LZ5对芒果采后炭疽病的防治效果。4、构建pFL61-neo-tpsl表达载体,并将该表达载体利用醋酸锂转化法转化M.guilliermondii LZ5。结果发现,带有pFL61-neo-tpsl表达载体的转化子能够在250g/mL G418培养基中正常生长,酵母转化子在非选择性培养条件下连续生长50代后,仍有65.5%的细胞保留该质粒。以上结果表明pFL61穿梭质粒适合于野生型拮抗酵母的转化,G418抗性可作为转化子的阳性筛选标记,带有pFL61-neo-tpsl表达载体的M.guilliermondii LZ5转化子中,海藻糖-6-磷酸合成酶的过表达能够提高转化子对热休克(48℃)、高渗胁迫(8%NaCl)和致死乙醇浓度(15%)的耐受性,从而增强酵母的存活率。
杜栋良[7]2013年在《梅花脱水素基因家族的克隆与功能分析》文中指出梅花(Prunus mume)属于蔷薇科李属植物,在东亚地区深受人们喜爱。梅花原产于长江流域,如何提高其抗逆能力,尤其是抗寒能力,对扩大梅花的应用范围十分重要。脱水素(又称第二类胚胎发育晚期丰富蛋白)在植物抵抗非生物胁迫中起重要作用。但目前对梅花脱水素家族基因的研究还很少。本研究首先在‘藏梅’全基因组测序的基础上,对梅花胚胎发育晚期丰富蛋白基因家族进行了生物信息分析；然后利用RT-PCR法对其中脱水素基因家族进行了克隆和表达分析；最后分别在大肠杆菌和烟草中超表达了梅花脱水素基因,并进行了初步的功能分析。主要结果如下：1.首次预测了梅花胚胎发育晚期丰富蛋白基因家族成员：梅花中共有30个胚胎发育晚期丰富蛋白基因,分布于7个连锁群上。5个梅花胚胎发育晚期丰富蛋白基因属于片段重复,12个属于串联重复。根据序列相似性,可以将这些基因分为8组(LEA_1, LEA_2, LEA_3, LEA_4, LEA_5, PvLEA18,脱水素和SMP),其中脱水素家族含有6个成员(PmLEA8,PmLEA9, PmLEA10, PmLEA19,PmLEA20和PmLEA29)。在梅花胚胎发育晚期丰富蛋白基因中总共发现10次基因转换,其中7次发生在脱水素基因之间。2.梅花脱水素基因表达受胁迫诱导,并具有明显的组织特异性：从‘北京玉蝶’梅花中克隆了5个脱水素基因(PmLEA8, PmLEA10, PmLEA19, PmLEA20, PmLEA29),并利用TA克隆的方法构建其GATEWAY克隆载体。测序结果表明,除PmLEA8外,其余基因序列与‘藏梅’全基因组数据库中的序列基本一致。表达分析证明：除PmLEA29在五种器官中(根、茎、叶、花、果实)均有高水平表达外,其余4个梅花脱水素基因表达均表现一定的组织特异性。6种胁迫处理下(低温、高温、干旱、盐、ABA和SA处理)梅花脱水素基因表达水平均有所升高,但PmLEA29在ABA处理下表达水平略有降低。3.原核表达梅花脱水素可以提高大肠杆菌的抗逆能力：通过LR反应将克隆载体上的梅花脱水素基因重组到原核表达载体pDEST15上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经1mM的IPTG诱导,表达了带GST标签的梅花脱水素蛋白。对转化大肠杆菌进行抗逆性分析证明,原核表达梅花脱水素可以提高大肠杆菌抗渗透胁迫和抗反复冻融能力。但不同梅花脱水素的改善效果不同,其中表达PmLEA8的改善效果稍差。4.超表达梅花脱水素可以提高转基因烟草的抗寒能力：通过LR反应构建梅花脱水素基因的植物表达载体pEG203-PmLEA,转化农杆菌EHA105.采用农杆菌介导的叶圆盘法转化烟草NC89,经抗生素筛选和PCR验证获得转梅花脱水素基因烟草。其中,对转PmLEA20基因的烟草株系进行抗寒性分析证明：超表达梅花脱水素基因PmLEA20可以提高烟草种子在低温胁迫下的相对发芽率；低温下转PmLEA20基因烟草叶片电解质渗透率也明显低于对照。本研究首次对梅花脱水素基因家族进行了克隆和功能分析,为利用梅花脱水素基因进行植物抗性改良、培育抗逆新品种,积累了新的分子材料,奠定了理论基础。
胡冬南[8]2006年在《甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因转化美丽胡枝子的研究》文中认为美丽胡枝子(Lespedeza formosa)是优良的水土保持和饲料型豆科灌木,提高美丽胡枝子的抗盐性,扩大其栽培区域是开发利用盐渍地的有效途径,具有重要的生产意义。本论文通过对美丽胡枝子子叶节再生条件、选择剂筛选条件和遗传转化条件等众多因素的优化,建立了美丽胡枝子高频再生系统和遗传转化体系,并将BADH基因导入到美丽胡枝子中,获得了耐盐性增强的转基因植株。主要研究内容及结果如下:1.利用L16(45)和L9(34)正交设计,研究了6-BA、2,4-D、NAA、IBA、蔗糖和苗龄等因素对美丽胡枝子子叶节再生、节段扩繁和试管苗生根的影响,建立了子叶节外植体高效再生体系。通过试验确定了美丽胡枝子子叶节再生的最佳培养基为MS+0.5mg.L-16-BA+1.0mg.L-12,4-D+0.5mg.L-1NAA;试管苗增殖的最佳培养基为:MS+ 1.0mg.L-16-BA + 0.05mg.L-1NAA ;最佳生根培养基为1/2MS+0.4mg.L-1IBA +0.2mg.L-1NAA+30g.L-1蔗糖;不同苗龄的子叶节再生能力差别不大。2.采用PCR的方法,分别从pMD18-T载体上和pBI121-bar中克隆目的基因BADH和带有标记基因bar的35S-bar-nos片断,将它们插入到pBI121中,构建了植物表达载体pBIBADHbar,并将其分别转化了根癌农杆菌LBA4404、EHA105和C58。3.通过浓度梯度试验,研究了头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Carb)两种脱菌剂对叁种农杆菌的抑菌效果,发现Carb的抑菌效果较差,Cef浓度在200～300mg.L-1之间能有效控制LBA4404和EHA105的生长,而对C58的抑制效果稍差。在此基础上进一步研究了美丽胡枝子对Cef和选择剂草丁膦(Glu)的敏感性,确定了Cef浓度≤300mg.L-1为可耐受浓度;Glu1.0mg.L-1为子叶节再生的临界浓度,Glu0.3mg.L-1为试管苗生长和增殖的临界浓度,Glu0.2mg.L-1为试管苗生根的临界浓度。4.通过L9(34)正交试验和时间、浓度梯度试验,对影响农杆菌转化效率的主要因素进行了研究。试验结果表明,LBA4404是侵染美丽胡枝子子叶节效果最佳的根癌农杆菌类型,菌液浓度以OD600=0.6～0.8较为合适;子叶节在农杆菌侵染前预培养1d,侵染时间为20～30min,感染后共培养3d可获得较好的转化效果,在共培养基中附加100umol.L-1的AS、延迟4d选择和选择压由低到高进行梯度选择均可使转化率明显提高,转化率最高可达28%。
贾海锋[9]2013年在《蔗糖及茉莉酸信号在草莓果实发育中的作用及其机理分析》文中提出果实发育和成熟调控机理研究一直是果树学科的一个重点问题和热点问题。多年来,有关果树果实发育和成熟调控机理的研究大部分都集中在对果实发育过程中某些生理生化代谢过程的研究。这些研究奠定了果实发育和成熟调控的基本理论基础。比如,根据果实发育和成熟过程中呼吸变化的特点,可将果实分为呼吸跃变和非跃变两类。跃变型果实认为是由植物激素乙烯调控的,而非跃变型果实的成熟机理一直不很清楚。草莓不仅是重要的果树品种之一,而且日益成为研究果树果实发育分子基础的重要材料。草莓属于非呼吸跃变型果实,最近的研究表明,植物激素脱落酸(Abscisic acid, ABA)可能在草莓果实成熟调控中起着重要的作用。但基于草莓RNA转录水平和生物信息学分析发现,蔗糖代谢和茉莉酸(Jasmonic acid, JA)代谢可能与草莓果实发育和成熟调控有着更为密切的关系。为此,本研究以草莓为试材,对蔗糖和茉莉酸在草莓果实发育和成熟调控中的作用及其机理进行了研究,主要结果和结论如下：1.随着草莓果实发育,葡萄糖、果糖和蔗糖含量都显着上升,但蔗糖含量变化和果实发育及成熟进程的关系尤为密切。外源蔗糖处理可急剧加速草莓果实的成熟,同时,蔗糖结构类似物松二糖处理也显着促进草莓果实的上色。进一步克隆了草莓基因库中7个蔗糖转运蛋白编码基因,即FaSUT1、FaSUT2、FaSUT3、FaSUT4、FaSUT5、FaSUT6和FaSUT7。研究表明,随着果实发育和成熟,FaSUT1、FaSUT2和FaSUT3表达量上升,但FaSUT1表达上升的趋势尤为剧烈,且与果实发育进程密切相关；FaSUT4、FaSUT6和FaSUT7在熟后前期表达量上升,但完全成熟时表达量又开始下降。酵母装载蔗糖速率试验表明,在所有7个蔗糖转运蛋白编码基因中,FaSUT1的蔗糖吸收转载速率最快,其次是FaSUT2。利用农杆菌介导的基因瞬时沉默和过量表达体系研究表明,FaSUT1基因过量表达可促进草莓果实的成熟；相反,FaSUT1基因沉默可延缓果实的成熟进程。与此一致,操纵FaSUT1基因的表达可操纵一系列果实成熟相关基因的表达。比如FaBG1、 FaSPS、FαAT、FaPG1、PaAI、FaQR、FaPAL和FaPT1等。重要的是,操纵FaSUT1基因的表达,可操纵ABA合成关键酶FaNCED1基因的表达,并调控果实发育过程中ABA含量的变化。这些结果表明,在草莓果实中,蔗糖不仅是重要的品质构成因素之一,而且还可以作为信号,通过操纵ABA的信号起源,在草莓果实发育和成熟调控中起着重要作用。2.在草莓果实发育初期,即从坐果到绿果中期,内源JA含量有所下降。然而从绿果中期到绿白转化期,内源JA含量急剧上升,但到果实成熟后JA含量义开始下降。因此在草莓果实发育过程中,JA含量变化趋势表明,JA可能在草莓果实成熟启动中起着重要的作用。外源MeJA处理可促进草莓果实发育和成熟进程,进一步说明JA在草莓果实发育和成熟调控中的重要作用。为深入揭示JA调控草莓果实发育和成熟的机理,在草莓果实发育中期,对JA应答基因的表达进行了RNA转录水平分析。结果发现,茉莉酸甲酯(MeJA)处理可诱导6806个基因表达量上调,其中94个基因表达量上调超过6倍,108个基因表达量上调5倍,87个基因表达量上调4倍,167个基因表达量上调3倍；共有6531个基因表达量出现了下调,89个基因表达量下调6倍以上,106个基因表达量下调5倍,86个基因表达量下调4倍,192个基因表达量下调3倍。在上调基因中,参与细胞壁代谢和色素代谢的基因数量及其变化显着,这说明JA可能主要是通过果实软化和着色操纵果实的成熟。进一步研究发现,参与JA合成的相关基因FaLOX、FaAOS、FaAOC随着草莓果实的发育其表达水平都没有发生明显的变化,而JA合成基因JFaOPDA1表达量随着果实发育和成熟,发生剧烈的变化,且这种变化与JA含量变化密切相关,说明在草莓果实中FaOPDA1可能是JA合成的关键基因。利用农杆菌介导的瞬时表达体系研究表明,FaOPDA1的过量表达可促进草莓果实上色成熟；相反,FaOPDA1的RNAi沉默可延迟草莓果实上色成熟。与此一致,基因FaOPDA1的过量表达可诱导色素代谢基因的表达,比如Chalcone Synthase (CHS)等,和果实软化基因,比如Polygalacturonase (PG)、Expansion (EXP)等。以上结果表明,JA在草莓果实发育和成熟过程中起着重要的作用。蔗糖一直被认为是结构和能源物质,而JA也一直被认为是参与抗病和抗逆的信号物质。本研究首次证实了蔗糖和JA都可作为信号物质在草莓果实发育和成熟调控中起着重要作用,揭示了草莓果实发育和成熟并非由单一信号调控,而是由多个信号系统共同操纵,信号系统间不仅存在着交义对话,还在果实发育的不同阶段可能起着不同的作用。该研究不仅加深了对非跃变型果实(至少对草莓果实)发育调控机理的认识,同时为今后果实发育和品质改良的分子调控奠定了重要的基础。
邢利博[10]2016年在《‘长富2号’苹果花芽孕育基因表达模式分析与拉枝调控成花的分子机制》文中认为富士是中国苹果主栽品种,占总栽培面积的65%以上。但富士存在幼树始果期长、花芽难形成、大小年结果等问题,严重制约苹果生产。目前,拉枝作为促进富士花芽形成的重要措施,在生产上已经广泛应用。但是,拉枝调控富士花芽孕育的基因表达网络和调控分子机制尚不清楚。因此,明确富士苹果花芽孕育与拉枝调控的生理分子机制,有利于丰富果树花芽分化基础理论,对苹果成花特性的遗传改良,开发苹果花芽分化调控技术均具有重要理论和实践意义。本文以难成花品种‘长富2号’和易成花品种‘秦冠’为材料,利用RNA-seq技术,全面解析苹果花芽孕育基因表达模式;并结合重测序技术,比较两个品种成花相关基因DNA多态性变异差异;比较系统阐明拉枝调控苹果花芽形成的基因表达模式,以及miRNAs在响应拉枝促进花芽形成和调控果树童期转变的作用机制;结合苹果花芽孕育表达模式及生物信息学,筛选并研究了苹果MdIDD转录因子家族基因功能。取得的主要结果如下:1、构建了‘长富2号’花芽孕育芽RNA-seq文库,分析了差异基因表达模式,测定了芽和叶片碳水化合物含量及其代谢相关酶活性和激素水平。(1)在花芽孕育早期,芽蔗糖含量较高,而淀粉的快速积累,是花芽孕育的必要条件;而蔗糖、淀粉相关基因呈现类似趋势;(2)在花芽孕育前,芽生长素、赤霉素含量越早达到峰值,越有利于成花;在花芽孕育开始期,细胞分裂素越早达到峰值,越有利于启动成花,相关基因表达趋势与之基本一致;(3)芽脱落酸含量及其生物合成和信号转导相关基因的表达呈现逐渐上调的变化,并与淀粉水平及其合成关键基因的表达同步上调。综合上述结果,形成了糖和激素调控苹果花芽孕育的基因网络假设模型。2、利用重测序技术,对难成花品种‘长富2号’和易成花品种‘秦冠’进行全基因组重测序,分析比较了两者全基因组DNA多态性变异差异。(1)在苹果‘长富2号’和‘秦冠’品种中鉴定的SNPs分别为2,771,129和2,262,888个;SVs分别为82,663和63,764个;INDELs分别为1,572,803和1,294,060个。(2)‘长富2号’和‘秦冠’品种23,111和21,400个基因存在171,520和147,090 SNPs;3,431和2,815个基因存在3,963和3,196 SVs;1681和1345个基因存在1834和1451 INDELs。(3)构建了苹果190个成花相关基因的遗传连锁图谱,并分析比较‘长富2号’、‘秦冠’和‘金冠’3个品种在这些成花基因中存在的DNA多态性差异,其与品种成花特异性密切相关。3、构建了拉枝和对照处理‘长富2号’芽RNA-seq文库,筛选并鉴定了响应拉枝处理与糖代谢、激素、逆境响应及成花相关的差异表达基因。(1)拉枝显着提高树体萌芽率、成花率及短枝比例;(2)拉枝改变了树体碳代谢平衡,显着上调糖代谢相关基因表达,加速糖分子信号的传递,诱导花芽形成;(3)拉枝处理显着上调与逆境响应相关激素ABA、ET、SA及JA的合成及信号转导相关基因表达,且WRKY类转录因子及R基因的表达呈现上调变化;(4)拉枝处理显着上调成花相关基因的表达。4、构建了拉枝处理和对照‘长富2号’花芽孕育miRNA文库,筛选并鉴定了差异表达的miRNAs。(1)获得39个已知miRNAs家族的188个miRNAs和137个novel miRNAs;有68和27个已知miRNAs分别下调和上调表达,37个novel miRNAs差异表达。(2)与激素相关的miR396、160、159、319和164,以及靶基因GRFs、ARFs、MYBs、TCP4和NAC1显着差异表达。(3)一些成花关键基因(SPLs、SOC1、FT、AFL1和AP1)显着上调表达。综合分析,提出了与激素相关的miRNAs介导拉枝促进花芽形成的分子调控模型。5、构建了平邑甜茶成年期和童期叶片miRNA和降解组文库,鉴定两者差异表达的已知miRNAs和novel miRNAs,并分析其靶基因的生物学功能和表达模式。(1)获得了42个已知miRNAs家族和172个novel miRNAs;(2)鉴定了25个已知miRNAs的127个靶基因和35个novel miRNAs的168个靶基因;(3)明确了miR156-SPLs、miR172-AP2和生长素相关的miR160和miR393及其靶基因协同调控果树童期阶段转变的网络模式。6、鉴定获得了20个苹果MdIDD基因家族成员,发现均含有4个高度保守的锌指类结构域,分别为ZF1(CCHH)、ZF1(CCHH)、ZF1(CCHC)和ZF1(CCHC)。(1)采用qRT-PCR,检测了‘长富2号’及其蔗糖处理和‘烟富6号’品种芽在花芽孕育过程中,10个关键MdIDD基因的表达模式。‘烟富6号’芽10个关键MdIDD家族基因表达水平均显着高于‘长富2号’,而‘长富2号’芽有8个MdIDD家族基因响应蔗糖处理上调表达。(2)克隆获得7个MdIDD基因cDNA全长序列;(3)在拟南芥野生型过量表达了苹果MdIDD2基因。
参考文献：
[1]. 海藻糖合成酶基因克隆及其转化草莓的研究[D]. 吴斌. 安徽农业大学. 2003
[2]. 应用甜菜碱醛脱氢酶基因工程提高马铃薯抗逆性的研究[D]. 张宁. 甘肃农业大学. 2004
[3]. 茶树糖类相关基因的挖掘及其在茶树冷驯化中的表达研究[D]. 岳川. 中国农业科学院. 2015
[4]. 普通白菜成花转变基因表达谱比较及BrcLFY基因克隆与表达分析[D]. 宋红霞. 山西农业大学. 2015
[5]. 吉兰泰盐湖土壤中嗜盐碱放线菌的分离鉴定及四氢嘧啶工程菌株的构建[D]. 高波. 西北农林科技大学. 2016
[6]. 一株对芒果炭疽病菌有拮抗作用的酵母菌的鉴定、生防效果评价及抗逆性改良[D]. 高云慨. 海南大学. 2014
[7]. 梅花脱水素基因家族的克隆与功能分析[D]. 杜栋良. 北京林业大学. 2013
[8]. 甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因转化美丽胡枝子的研究[D]. 胡冬南. 北京林业大学. 2006
[9]. 蔗糖及茉莉酸信号在草莓果实发育中的作用及其机理分析[D]. 贾海锋. 中国农业大学. 2013
[10]. ‘长富2号’苹果花芽孕育基因表达模式分析与拉枝调控成花的分子机制[D]. 邢利博. 西北农林科技大学. 2016