冯尔玲, 廖翔, 王恒梁, 史兆兴, 苏国富[1]2003年在《驱除痢疾杆菌侵袭大质粒的新方法》文中研究说明用质粒不相容性原理驱除痢疾杆菌福氏 2a 2 4 5 7T和宋内S7的侵袭大质粒 ,先从福氏2a侵袭大质粒分别扩增ori和inc基因 ,将它们克隆至 pMD18 T载体 ,得重组质粒pMDori和 pMDinc ,然后转化 2 4 5 7T和S7,不管是pMDori还是 pMDinc都能竞争驱除痢疾杆菌福氏 2a 2 4 5 7T和宋内S7的侵袭大质粒
李娜[2]2009年在《痢疾杆菌小RNA功能的研究》文中研究说明志贺菌属(shigella)细菌通称痢疾杆菌,是一类具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性肠道致病菌,能够通过侵袭肠上皮细胞引起患者典型的菌痢症状(发热、腹痛、腹泻)。志贺菌分4群37种血清型,在我国主要的流行菌群为福氏(86%),福氏志贺菌最主要的血清型为2a(80%)。临床感染痢疾杆菌可以导致痢疾,其症状以发热、脱水和便血为特征。痢疾是世界上,尤其是发展中国家重要的传染病之一。据世界卫生组织公告报道,全球每年菌痢患者达1.647亿,有1.632亿分布于发展中国家,并导致150万人死亡。在我国,菌痢发病率也很高,其中福氏2a型占到50-70%。目前治疗痢疾的主要方式是抗生素,但高达95%的临床分离株对多种抗生素产生了耐药性;最佳治疗手段是疫苗,但对其致病机理和宿主的免疫保护机制还不很清楚。菌痢严重危害我国人们的健康,对痢疾杆菌进行研究具有重要的意义。因此,福氏2a志贺氏菌的基础研究对于我国卫生防疫工作尤为重要。在原核生物基因组中除了tRNA、rRNA和mRNA这叁种我们很熟悉的RNA以外,目前已经知道还含有许多编码非常规调控的RNA。这些RNAs的长度为50-400nt,通常由原核生物的基因间区编码但是并不翻译成蛋白质,因此被称为非编码小RNA,简称小RNA(sRNA)或非编码RNA(ncRNA)。近年来,随着生物信息学和分子生物学技术的不断发展,在原核生物体内陆续发现了上百种sRNA分子,这些sRNA分子具有多样的生物学功能。小RNAs作为一类新发现的基因表达调控子已经引起了高度的重视。它们在细菌中发挥着多种调控功能,有助于细菌对生理系统进行精细调控以便适应迅速变化的环境。因而深入认识这些sRNAs可能开辟一个新的研究领域,它们可能代表着一个新层次上的基因表达调控方式。人们现在已认识到sRNAs参与许多有机体的基因调节,在细菌中行使诸如翻译激活、翻译抑制、持家sRNAs、密度感应系统、蛋白的降解、离子动态平衡、糖代谢和生长依赖性外膜蛋白表达调控等多种功能,有人把这些sRNAs称为“凌驾于”基因组之上的调控成分。虽然现在细菌中发现的sRNAs在迅速增加,但是它们中的大部分功能都还未知,从目前积累的知识分析,细菌可能借助于这些sRNAs对它们的生理系统进行精细调控以便适应迅速变化的环境。因而深入认识这些sRNAs可能开辟一个新的研究领域,因为它们可能代表着一个新层次上的基因表达调控方式。功能分析表明sRNAs是进行细菌调控研究中一直被忽略的一环。最新认识到的sRNAs的生理功能已经填补了我们对细菌离子动态平衡、糖代谢和生长依赖性外膜蛋白表达调控知识的空白。对痢疾杆菌全基因组sRNAs的功能进行研究,必将促进对该菌生理学、系统进化以及致病机理等方面的研究,为痢疾的药物开发提供新的作用靶标,为痢疾杆菌疫苗研制提供一个新的思路。首先,本研究根据目前发现的大肠杆菌的sRNAs的本身的特点,利用生物信息学,根据基因组之间的序列对比、RNA的二级结构分析以及对非依赖性终止子分析等方法对福氏2a志贺氏菌301毒力大质粒(pCP301)上的sRNAs进行预测,采用Northern blot对预测出的sRNAs进行验证。本研究成功预测了301毒力大质粒上的6个sRNA;综合文献报道和网络信息初步预测sf301基因组5个功能未知的sRNA:IS061 sRNA、IS102 sRNA、C0719 sRNA、tke1 sRNA和ryfA sRNA(http://www.sanger.ac.uk)。研究证明sRNA在细菌的物质代谢、环境适应、群体感应和细菌毒力发挥了重要的调节作用。本研究采用改进的λ-Red重组系统成功构建了sf301的8个sRNAs的缺失突变体(简称sf301ΔsRNAs),分别是预测的3个质粒编码sRNAs和sf301基因组5个功能未知的sRNAs,并对突变株进行了生理生化特征研究。结果表明:这8个sRNA的缺失对菌体的物质代谢和生长影响不大。接下来本文对sf301ΔsRNAs对sf301毒力的影响进行了评价。本研究通过sf301ΔsRNAs与野生株的HeLa细胞竞争性侵袭力、小鼠肺部竞争性侵袭感染能力和豚鼠角膜侵染实验进行毒力评价研究,验证预测的sRNA和基因组上已报道但是功能未知的sRNA是否对细菌毒力的发挥起到了重要的调控作用。结果表明:基因组上的C0719 sRNA和IS061 sRNA的缺失造成了sf301的HeLa细胞侵袭力及小鼠肺部侵袭力的增强;毒力大质粒预测的ln3 sRNA的缺失使得sf301的HeLa细胞侵袭力及小鼠肺部侵袭力的减弱。对细菌不同状态下的蛋白质组进行比较是蛋白质学研究中很重要的一个方面,这包括同一株菌在不同培养条件下的蛋白质组的变化的研究、同一细菌的不同菌株的蛋白质组比较以及同一菌株的突变菌株和野生菌株的蛋白质组的比较。本研究采用蛋白质组学技术对sf301ΔsRNAs与sf301的蛋白质组进行比较,应用双向凝胶电泳建立了不同生长时期野生株和sRNAs突变株的双向电泳图谱,并对差异点进行了胶内酶切和质谱鉴定。结果表明:通过比较8株突变株37℃晚期的和sf301ΔIS061中期的蛋白质组,发现了31种蛋白质在突变株与野生株中存在差异,我们对这些蛋白进行了功能分析。发现sRNAs的缺失并没有对痢疾杆菌的蛋白表达量造成明显的影响,但是我们发现了可能对痢疾杆菌毒力造成影响的蛋白质OspC3和可能与sRNA调控机制有关系的蛋白质OmpA,为下一步研究sRNA的调控功能提供了条件。综上所述,本研究预测出pCP301的6个sRNAs,并进行验证;成功地构建了8株sf301ΔsRNAs突变体并根据生化特性变化、细胞和动物侵袭实验揭示出sRNAs与痢疾杆菌致病性之间的关系;通过与蛋白质组技术相结合分析sRNAs的调控功能。本研究构建的8株sf301ΔsRNAs为进一步研究sRNA的功能奠定了基础。
张笑冰[3]2002年在《痢疾杆菌福氏2a 301株基因组学研究》文中进行了进一步梳理细菌性痢疾是威胁我国人民健康的主要传染病。目前针对细菌性痢疾缺乏有效的防治手段，主要因为疫苗的保护效果不尽理想(保护率大约为50％左右)，且临床上分离的痢疾杆菌中多数具有不同程度的耐药性。大量的流行病学统计资料表明，在我国流行的痢疾杆菌优势株为痢疾杆菌福氏2a301株。本论文在国际上率先开展痢疾杆菌福氏2a 301株的基因组学研究无疑将为其致病机制、毒力进化、及疫苗研制和开发新药等方面的研究提供极其有用的线索和遗传背景资料。 本论文所进行的有关痢疾杆菌福氏2a 301株基因组学研究的内容主要从叁个部分进行：第一部分：利用改进的“鸟枪法”建立痢疾杆菌福氏2a 301株的全基因组文库，并完成其全基因组序列测定；第二部分：以与痢疾杆菌福氏2a 301株亲缘关系较近的非致病性大肠杆菌K-12 MG1655株基因组序列为参照，对福氏2a痢疾杆菌基因组进行比较，重点集中在痢疾杆菌福氏2a301株基因组所缺失的片段，及片段所含ORF的功能进行分类和分析；第叁部分：痢疾杆菌福氏2a 301株编码的具有膜样结构的未知蛋白的预测与其表达情况的生物芯片分析。 通过痢疾杆菌福氏2a基因组结构相关研究，能够使我们从细菌完整基因组出发认识该菌，最终达到预防和治疗细菌性痢疾的目地。
胡堃[4]2003年在《福氏2a痢疾杆菌毒力相关基因的研究》文中认为全面鉴定痢疾杆菌毒力基因将有助于人们对该病原菌的分子致病机制有更加深入的认识，为控制和预防该病的发生提供更多手段和途径。本文用体内表达技术获得了痢疾杆菌福氏2a可能与其毒力相关的基因，包括yphF、wcaJ、dam、alkA、cysG、yaiC、IS600，citC、aroD、CPO198等，通过构建相应基因的突变体，研究二者之间的关系。首先，我们用λ噬菌体的Red重组系统初步建立了一套快速敲除痢疾杆菌基因的技术平台，通过一系列的实验成功地敲除了痢疾杆菌alkA基因。但此方法首次在痢疾杆菌中的应用，技术还不够完善。为了加快实验进度，顺利结束本工作，我们用本实验室十分成熟的利用宿主本身的RecA重组系统构建突变体的方法，对相应基因进行了研究。构建了yphF、wcaJ、dam、alkA、cysG、yaiC、IS600、citC、aroD、cpo198基因的插入突变体。进而进行Hela细胞侵袭实验和小鼠肺感染实验分析细菌竞争性指数。获得数据显示多数基因失活后，其竞争性指数较低，侵袭能力下降，毒性减弱。这些基因可能与福氏2a痢疾杆菌的毒力相关。
赵丽娜, 李巍伟, 贺宝玲, 胡芬, 王洋[5]2016年在《基于多维液相色谱质谱组合分析的痢疾杆菌蛋白质基因组学》文中研究指明目的应用多维液相色谱质谱组合体系为基础的蛋白质组学方法对福氏痢疾杆菌基因组注释进行完善。方法痢疾杆菌福氏2a型301株(Sf2a301)的全菌蛋白经胰酶消化,二维液相色谱分离后进行MALDI-TOF/TOF和ESI-MS/MS组合鉴定,质谱数据分别应用MASCOT和SEQUEST软件检索基于Sf2a301全基因组构建的6个读码框数据库,完成对原基因组注释的验证和补充。结果研究表明多维液相色谱质谱组合体系能够增加鉴定蛋白的覆盖率,共鉴定Sf2a301的1231个蛋白编码基因产物,涵盖了COGs数据库22个功能分类组中的20个,包含306个功能未知的假定蛋白。发现了9个未注释的基因,得到RT-PCR和Northern blot的进一步验证。新基因大多数是重迭基因,包含3个嵌套基因。结论多维液相色谱质谱组合体系相对于单一的串联质谱技术能够更加有效验证、补充痢疾杆菌的基因组注释,更新后的基因组注释库为今后开展痢疾杆菌功能研究提供更多的靶点。
卜歆[6]2008年在《福氏2a痢疾杆菌htpG基因功能的研究》文中研究说明志贺氏菌属(Shigella spp.)细菌是一类不形成芽孢的革兰氏阴性致病菌,能够通过侵袭大肠引起患者典型菌痢症状(发热、腹痛、腹泻)。根据生化反应和O-抗原结构的不同,志贺氏菌可以分为四个群。其中,福氏志贺氏菌(S. flexneri)是发展中国家卫生条件较差地区痢疾流行的主要病原菌,感染者多为5岁以下儿童。近叁年来我国每年大约有2000万人次感染痢疾,年累计发病数一直位于第3位,仅次于肺结核和乙肝。由于志贺氏菌感染剂量极低(10-100个细菌),加之多重耐药菌株的不断出现,常规的抗生素治疗方式遇到了巨大的挑战。由于人们对痢疾杆菌的致病机理和宿主的免疫保护机制还不十分清楚,所以迄今为止仍未研究出能有效控制痢疾的理想疫苗。志贺氏菌的HtpG蛋白是真核生物中Hsp90蛋白家族的同源蛋白。研究表明,细菌中的HtpG蛋白在热休克和酸休克时被诱导;在缓和的热休克条件下,HtpG参与新合成蛋白的折迭;而在氮源饥饿时HtpG蛋白的表达被抑制。此外,Mason CA等人发现一个有趣的现象,大肠杆菌HtpG蛋白的表达受到生长环境的影响:在LB复合培养基中培养时,可以观察到HtpG蛋白在菌体热休克时被诱导表达;而在含葡萄糖的基础培养基中培养时,HtpG蛋白的表达与温度无关。这种现象暗示HtpG蛋白的表达除受温度调控外,还受到其他信号分子的调控;其功能不仅仅与热休克相关,还可能具有未知的功能。为了探索福氏2a志贺氏菌2457T中htpG基因的功能,本研究将由Datsenko和Wanner建立的λ噬菌体Red重组系统稍加改进,成功地敲除了福氏2a志贺氏菌2457T株的htpG基因,并利用低拷贝质粒构建了回复体加以验证,对HtpG进行了初步的功能研究。对野生株、突变株和回复株的生长曲线、生化反应、豚鼠角膜试验进行了比较分析,结果表明,野生株、突变株和回复株的生长曲线基本一致;突变株与野生株的生化反应没有明显差异;野生株、突变株与回复株均能够引起豚鼠角膜强烈炎症反应。这些结果表明HtpG蛋白功能与福氏志贺氏菌的基本生化代谢无关,也不影响侵袭蛋白的毒力。同时考察了野生株、突变株和回复株腹腔注射引起小鼠炎症反应的强弱,结果表明,HtpG蛋白能够引起小鼠强烈的炎症反应,可能与细菌的免疫致病性相关。利用双向电泳和质谱技术对野生株、突变株和回复株进行了全菌体蛋白的比较蛋白组学研究。在蛋白质组的比较分析中我们发现,htpG基因敲除后表达上调的蛋白为16个,表达下调的有13个。结果表明HptG作为热休克蛋白家族的一员,参与了多种体内代谢活动,尤其是氧化防御机制和嘌呤合成途径。缺失HtpG后,双功能过氧化物酶KatG表达上调,而超氧化物歧化酶SodA表达下调;嘌呤合成相关蛋白PurH、PurB、PurC的表达减少。这些结果加深了我们对痢疾杆菌中HtpG蛋白的认识,有助于痢疾杆菌致病机理的研究。
杨筱凤, 周乐, 郑瑾, 司履生, 王一理[7]2005年在《痢疾杆菌福氏2a sf301 DsbA/virG双突变减毒活候选疫苗构建和初步鉴定》文中认为为预防细菌性痢疾的爆发和流行,构建志贺氏福氏2a减毒活疫苗。选用中国痢疾杆菌主要流行株sf301为受体菌,通过基因重组交换技术,突变细菌DsbA和virG基因,并以Serney试验和HeLa细胞侵袭实验鉴定突变菌株sf301:△virG:DsbA33G毒力和侵袭力,采用豚鼠结膜囊接种免疫动物,检测突变菌株免疫原性,了解候选疫苗对免疫动物的保护能力。与野生亲本比较sf301:△virG:DsbA33G已完全丧失毒力,但保留了一定的侵袭力。与未接受免疫的对照组相比,通过粘膜途径免疫的豚鼠,无论是单次免疫,还是双次免疫策略都可以诱发血清和胃肠道粘膜部位产生特异性抗sf301LPSIgG和IgA;面部、胃肠道引流淋巴结和脾脏中IgG和IgA抗体分泌细胞(Antibody secretcells ASCs)数目显着性增高;两种免疫方案都可给免疫动物提供100%抵抗野生亲本毒株攻击的能力。初步动物实验结果提示构建的福氏2a活疫苗sf301:△virG:DsbA33G是一种潜在的候选痢疾疫苗。
葛堂栋[8]2005年在《福氏2a痢疾杆菌hns基因功能的研究》文中研究指明痢疾杆菌在30℃时不具有侵袭力,37℃时毒力明显增强,已有的研究表明这种依赖于温度的毒力基因的表达受H-NS蛋白的调控。H-NS是一种重要的类核相关蛋白,在革兰氏阴性菌中普遍存在,能够调控大量基因的表达。对其研究有助于加深人们对痢疾杆菌致病机理的认识,为预防和控制该病的发生提供更多的手段和途径。 为了更深入的了解hns基因在细菌生命活动中所起的作用,我们首先利用RecA重组系统构建了痢疾杆菌2457T hns基因的插入突变体;随后,对基于Red重组系统的痢疾杆菌2457T缺失突变体的构建方法进行了摸索并成功地敲除了hns、hdeA、hdeB、yhiE和yhiF 5个基因,研究表明延长同源臂的长度可以明显提高同源重组的效率,缩短构建缺失突变体所需的时间。对野生株和2457T△hns的生长曲线和侵袭能力进行的研究表明:与野生株相比,突变体的生长速度变缓,侵袭Hela细胞能力减弱。 利用双向电泳技术对2457T和2457T△hns在不同的培养基和生长阶段的蛋白表达谱进行了比较,发现了113个表达差异的蛋白点,经质谱鉴定出的有84个,对应89个基因。其中47个基因表达上调,42个基因表达下调。这些表达差异的基因不但与氨基酸合成、中间产物及能量代谢有关,而且还与痢疾杆菌对环境变化的适应紧密相连,表明H-NS对基因的表达具有全局性的调控作用。比较特别的是,6个参与组氨酸合成与代谢的基因hisJ、hisG、hisF、hisH、hisB以及hisD在突变体表达下调,而与铁代谢有关的5个基因fur、ftn、dps、yecI和bcp的表达明显上调。另外,在hns基因突变体中,发现它的另外一个共生同源基因sfh表达明显上调,而不是通常认为的stpA。这些结果加深了我们对痢疾杆菌中H-NS蛋白的认识,有助于痢疾杆菌致病机理的研究。
曹晓玉[9]2008年在《福氏2a志贺氏菌2457T argT基因功能的研究》文中指出志贺氏菌属(Shigella spp.)细菌俗称痢疾杆菌,是一类不形成芽孢的革兰氏阴性杆菌,能够通过侵袭肠上皮细胞,引起以发热、腹痛、腹泻为特征的典型痢疾症状。据WHO统计,每年约有1.647亿人感染痢疾,110万人死亡,大多数为5岁以下的儿童。福氏志贺氏菌是发展中国家主要的感染菌株,2a血清是主要的血清型。在我国,每年大约有2000万人次感染痢疾,感染或大流行的痢疾杆菌中50-70%是由福氏2a志贺氏菌引起,因此,志贺氏菌的基础研究对我国卫生防疫工作尤为重要。有研究表明,福氏2a志贺氏菌在37℃时发挥完整的细胞侵袭力,而在30℃时却不能侵袭上皮细胞。本实验室对福氏2a志贺氏菌2457T不同培养温度下全菌蛋白的比较蛋白质组研究发现:在37℃培养至稳定期时,ArgT蛋白丰度很低,而在30℃时却明显提高。ArgT蛋白又称赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸转运蛋白,定位于细胞周质间隙内,行使着将细胞外氨基酸转运到细胞内的功能。为进一步研究ArgT蛋白在志贺氏菌毒力发挥中的作用,本研究采用改进的λ-Red重组系统成功构建了argT缺失突变株,利用定点突变的方法成功构建了ArgT过表达突变株,并对所得突变株进行了一系列的研究。结果表明:ArgT对菌体的生长及代谢影响不大;对野生株和突变株进行竞争性侵袭HeLa细胞的毒力评价模型及小鼠肺部侵袭发现,argT缺失对毒力无影响,而过表达却使毒力明显下降,这些实验推测argT是福氏志贺氏菌中一个新的抗毒力基因;利用双向电泳和质谱技术对野生株和突变株进行37℃全菌蛋白的比较蛋白组学研究,检测到10个蛋白差异点,代表9种蛋白,其中ArgT过表达突变体中外膜蛋白OmpA表达下调,说明ArgT影响细菌的通透性;热休克蛋白HtrA在ArgT不同的表达体中的差异表达引起了我们的注意。利用GST-pulldown技术筛选与ArgT相互作用的蛋白,经质谱分析发现外膜蛋白调节子OmpR蛋白与之发生相互作用,并进行了WestemBlotting体外验证,结果表明两者存在相互作用。OmpR是双组分渗透压感知调节系统(OmpR/EnvZ)的一部分,是一个毒力相关因子,可以调节vir基因和OmpF/C的表达。所以本研究得出:ArgT对福氏志贺氏菌的代谢影响不大,但过表达会造成毒力的下降,并使膜的通透性改变,影响物质的转运。
赵江丽[10]2011年在《福氏志贺氏菌2a 301株效应蛋白IpaH9.8功能研究》文中研究指明志贺氏菌属(Shigella spp.)又称为痢疾杆菌,是一类不形成芽孢的革兰氏阴性致病菌,临床上可引起细菌性痢疾。志贺氏菌属共有四个种48个血清型,包括痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)和鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)。世界各地都有菌痢流行,全球每年的发病人数达到1.6亿,其中95%以上的死亡病例发生在发展中国家,我国每年菌痢的发病人数在40万以上,仅次于肝炎和结核。其中,福氏志贺氏菌是发展中国家尤其是我国引起细菌性痢疾的主要志贺氏菌种。细菌性痢疾在卫生条件较好的发达国家也时有爆发,在战时和有自然灾害的情况下发病率更高,严重影响作战部队的战斗力,也会对灾难救援工作产生极大不利影响。痢疾虽有药物治疗,但易转为慢性或长期带菌,且抗药性日趋严重。目前痢疾的治疗主要是依靠抗生素,然而耐药和多重耐药菌株的不断出现,增加了痢疾防治的难度,因此开展对志贺氏菌的遗传机制和致病机理研究,对开发研制有效的疫苗和新药具有重要价值。志贺氏菌感染人的肠道引起细菌性痢疾,其致病性依赖于Ⅲ型分泌系统(T3SS)。志贺氏菌与宿主上皮细胞接触后,激活Ⅲ型分泌系统,将毒力蛋白直接注入宿主细胞内,这些蛋白可影响细胞的功能,如使细胞皱膜、改变肌动蛋白骨架、激活宿主细胞信号通路、诱导巨噬细胞凋亡等。Ⅲ型分泌系统分泌的蛋白往往可使细菌在宿主细胞内存活又不过分伤及宿主,由此可见细菌与宿主在进化的过程中,细菌致病机制和宿主细胞存活之间具有一定的协调性。目前对志贺氏菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)及效应子蛋白功能的研究已成为其致病性研究的热点。志贺氏菌的IpaH家族蛋白作为Ⅲ型分泌系统的效应子,其基因存在于染色体和毒力大质粒上。在福氏2a301株的毒力大质粒上存在5个ipaH基因的拷贝,分别是ipaH1.4、ipaH2.5、ipaH4.5、ipaH7.8、ipaH9.8。研究发现,IpaH9.8能下调宿主细胞内前炎性因子的表达,在志贺氏菌感染时明显抑制炎症反应,但目前其详细的功能及在志贺氏菌中的作用还不清楚。基因敲除是功能基因组学研究中的一个重要技术平台,也是病原微生物致病机理研究中必不可少的手段之一。在本研究中,我们利用λ-Red重组技术将福氏2a301株ipaH9.8基因敲除,然后分析突变株与野生株之间的表型与功能差异,获得与该基因功能相关的一些信息,从而达到阐述该蛋白功能的目的。首先将九噬菌体Red重组系统稍加改进,成功地敲除了志贺氏菌福氏2a301株的ipaH9.8基因,并利用低拷贝质粒构建了回复株,并分别用PCR和RT-PCR进行了验证；然后进一步测定野生株、缺失突变株和回复株生长曲线、生化反应,细胞侵袭实验、豚鼠角膜结膜感染实验、细胞因子检测和小鼠肺感染实验对野生株、缺失突变株和回复株的毒力表型进行比较分析。结果表明：野生株、缺失突变株和回复株的生长曲线基本一致,缺失突变株与野生株的生理生化反应没有明显差异,说明IpaH9.8对志贺氏菌的生长和基本生化代谢无影响。野生株、缺失突变株和回复株均能够侵袭进入Hela细胞和鼠巨噬细胞J774.A.1,使细胞核破裂,造成细胞死亡：细菌侵袭细胞后涂板计数,野生株、缺失突变株与回复株侵袭进入Hela细胞和J774.A.1细胞内的细菌数量无显着性差异,表明野生株、缺失突变株和回复株对Hela细胞和巨噬细胞的侵袭性没有明显区别,说明缺失ipaH9.8基因对志贺氏菌的侵袭能力影响不大。野生株、缺失突变株与回复株均能够引起豚鼠角膜结膜炎症反应,但缺失突变株的炎症反应更加强烈,推测IpaH9.8可能抑制宿主的炎症应答；因此,我们利用ELISA方法检测细菌侵袭细胞后的培养上清中细胞因子TNF-a和IL-1β的分泌情况,结果表明,与缺失突变株相比,野生株和回复株感染鼠巨噬细胞J774.A.1后明显抑制细胞产生TNF-a和IL-1β的能力；通过小鼠肺感染模型进一步证实了IpaH9.8能够抑制宿主的炎症反应。我们利用双向电泳和质谱技术对野生株、缺失突变株和回复株进行了全菌体蛋白的比较蛋白组学研究。在蛋白质组的比较分析中我们发现,共鉴定出43个蛋白点,对应23种蛋白质,与野生株和回复株相比,缺失突变株表达上调的蛋白为10个,表达下调的有15个,并且有1个蛋白对发生了位置的迁移。其中应激蛋白DnaK和GroEL表达下调,蛋白解聚分子伴侣的表达增加。最显着的差异是ipaH9.8基因的缺失引起了很多外膜蛋白的表达变化,包括NmpC、OmpF、OmpA、OmpA前体、OmpMxiD等,这些蛋白的变化都表明了IpaH9.8在一定程度上影响着志贺氏菌的侵袭能力和宿主的免疫反应。此外,还发现IpaH9.8诱导了长链脂肪酸外膜蛋白转运亍磷酸化与非磷酸化形式之问的转变。这些结果加深了我们对志贺氏菌效直至白IpaH9.8的认识,有助于志贺氏菌致病机理的进一步研究：上述研究中,生长曲线的测定和生化反应实验,深化了对褐氏志贺氏菌生理学特性的了解：细胞侵袭实验,为全面深入分析志贺氏菌的侵袭机制提供了掀其重要的线索；豚鼠角膜结膜感染实验的结果,为志贺氏菌免疫逃逸的研究奠定了基础。此外,比较蛋白质组学的研究设计,也拓展了筛选毒力相关蛋白的研究思路。研究中采用的技术改进以及获得的宝贵经验也为深入开展志贺氏菌致病机理的研究奠定了坚实的基础。
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