多不饱和脂肪酸在家蝇幼虫体内的富集及Fat1转基因家蝇的制备

论文摘要

目的:阐明家蝇（Musca domestica）幼虫对食物中各种多不饱和脂肪酸的富集能力以及代谢转化情况,并探究各种多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长的影响。在此基础上,建立适宜家蝇的转基因方法和技术体系,为实现在家蝇体内进行多不饱和脂肪酸的内源性合成奠定基础。方法:在基础饲料中添加不同浓度（3%,6%和12%）的多不饱和脂肪酸（亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸）饲养经过脱脂传代培养的家蝇幼虫,提取家蝇幼虫的总脂肪酸,利用气相色谱仪进行检测和分析,测定幼虫体重进行统计以分析多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长的影响。利用piggyBac转座子载体系统,构建Fat1基因的表达载体,然后通过显微注射法以及电穿孔法将目的基因导入家蝇卵,待发育为成蝇之后通过检测绿色荧光蛋白的表达,初步筛选出阳性个体,再提取组织DNA,通过PCR法在分子水平鉴定Fat1基因是否转入家蝇体内,从而建立转基因家蝇的技术体系。结果:亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸在家蝇幼虫体内均能富集,且它们的富集程度随着食物中多不饱和脂肪酸的添加浓度的升高而增加,其中亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸在幼虫体内富集的最高占比（指占体内总脂肪酸的百分比）分别为21.93%,16.13%和9.68%,而二十二碳六烯酸不能在家蝇幼虫体内富集。家蝇幼虫食物中添加的各种多不饱和脂肪酸经过代谢后并没有在其体内产生新的脂肪酸,而二十二碳六烯酸等食物来源的多不饱和脂肪酸在家蝇幼虫体内被分解代谢后消除。在多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长影响方面,饲喂α-亚麻酸及花生四烯酸后家蝇幼虫体重增长较为明显,其中浓度6%的α-亚麻酸添加组的幼虫体重显著高于其他3个组别,浓度3%和6%的花生四烯酸添加组的幼虫体重显著高于其他2个组别。利用重组DNA技术,构建了可用于家蝇转基因的质粒pBac[3×P3]-EGFP-PromA4-Fat1-SV40polyA。通过显微注射法制备转基因家蝇实验中,最终获得表达绿色荧光蛋白G0代阳性个体1只,在其复眼位置发出较为明显的增强型绿色荧光,腹部等部位也可以观察到较轻微的荧光,PCR检测结果显示在其头、胸、腹、翅、足五个部位可检测目的基因Fat1的存在,说明目的基因Fat1已经成功导入该家蝇体内。通过电穿孔法导入转基因载体后,最终也获得3只能够观察到绿色荧光蛋白表达的家蝇,但与显微注射法获得的转基因家蝇相比,这些家蝇的绿色荧光表达较弱,经提取组织DNA,利用PCR检测,结果发现扩增条带较为暗淡,尚不能确定目的基因是否成功导入。结论:家蝇幼虫体内能够从食物中富集部分多不饱和脂肪酸,多不饱和脂肪酸碳链越长其富集程度越低,直至不能富集,富集的多不饱和脂肪酸对家蝇幼虫生长有不同程度的影响。家蝇能够从食物中富集多不饱和脂肪酸的事实,为利用转基因家蝇进行内源性合成多不饱和脂肪酸奠定了部分理论基础。利用piggyBac转座子载体系统,多不饱和脂肪酸去饱和酶编码基因Fat1可以通过显微注射的方法导入家蝇卵并发育为成蝇,但成功率很低,需要不断提高显微注射操作技术;而经电穿孔法导入的Fat1基因尚不能确定是否成功,需要进一步摸索电穿孔参数和方法。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨阳

导师: 吴建伟,朱贵明

关键词: 家蝇,多不饱和脂肪酸,富集,生长发育,气相色谱,转基因

来源: 贵州医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 贵州医科大学

基金: 国家自然科学基金

分类号: R384.2

总页数: 57

文件大小: 1979K

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