冯永嘉[1]2003年在《空肠弯曲菌粘附蛋白基因工程疫苗的实验研究》文中提出第一部分 peb1A基因表达载体的构建及相应蛋白的表达目的 ：以基因工程技术构建编码空肠弯曲菌（CJ）粘附蛋白（periplasmic solute-binding protein，PEB1）编码基因peb1A的原核重组表达质粒，并获取目的蛋白，为进一步研究其生物学特性和制备CJ亚单位疫苗奠定基础。方法：（1）表达质粒的构建及鉴定：以含有BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的同一对引物行PCR反应以获取七个血清株空肠弯曲菌的peb1A基因片段，测序比较其同源性。小量提取质粒pET32a（+）和pQE30，选择与GBS最为相关的Pen19 CJ 标准株PCR产物为目的片段，同时对目的片段和pET32a（+）、pQE30行双酶切反应；酶切产物纯化后连接，转染入大肠杆菌JM109，兰白斑和氨苄青霉素抗性平板筛选阳性菌落，重组质粒经双酶切和PCR反应鉴定后测序，分别命名为pET32a(+)-peb1A和pQE30-peb1A;（2）原核表达重组质粒在大肠杆菌中的表达及纯化:将重组质粒pET32a(+)-peb1A转化入大肠杆菌BL21（DE3），pQE30-peb1A转化入SG13009(pREP4),IPTG诱导表达目的蛋白，超声破碎菌体，取上清用 Ni-NTA 树脂亲合层析纯化，SDS-PAGE<WP=5>鉴定；（3）融合蛋白鉴定：用CJ Pen19全菌抗原全身免疫雄性新西兰白兔，初次免疫后2、4、6、8、10周分别取血清观察特异性抗体滴度变化，用CJ Pen19粗提蛋白及纯化目的蛋白分别包被酶标板，ELISA法检测特异性抗体滴度，免疫印迹法鉴定抗体特异性。结果： （1）成功构建peb1A的表达质粒pET32a(+)-peb1A和pQE30-peb1A：PCR反应显示七种不同血清株CJ均在约780bp位置出现单一条带，测序表明多株间具高度同源性。双酶切和以重组质粒为模板的PCR反应鉴定，证明peb1A片段插入原核表达质粒pET32a(+)和pQE30中，测序表明插入位置正确；（2）重组质粒pET32a(+)-peb1A在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出TrxA/PEB1融合蛋白，并通过亲和层析获取高纯度蛋白；而pQE30-peb1A却未表达相应的蛋白。（3）证实TrxA/PEB1融合蛋白有高度特异的免疫原活性： CJ Pen19全菌抗原免疫后4周在雄性新西兰兔诱发高滴度特异性抗体，可同时与Pen19菌体粗提蛋白和TrxA/PEB1蛋白发生特异性结合。免疫印迹法检测表明该抗体能与PEB1融合蛋白，但不与空质粒表达蛋白结合。结论 ：（1）运用基因工程技术,成功构建空肠弯曲菌peb1A的融合表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白TrxA/PEB1；（2）所用表达质粒pET32a(+)，获取的目的蛋白表达量大，有望用于今后基因工程技术中获取大量CJ粘附蛋白；（3）TrxA/PEB1基因表达蛋白具有与野生菌株相同抗原活性;(4)常见的7个CJ血清株均有大小相同的peb1A基因片段，测序证实不同血清型CJ peb1A基因间序列同源性高达94%- 96%，充分显示该基因序列的保守性；（4）PEB1融合蛋白作为CJ的亚单位侯选基因工程疫苗不仅可行，而且有良好应用前景。【关键词】 空肠弯曲菌,PEB1,原核表达,疫苗
郑惠[2]2006年在《空肠弯曲菌多价DNA疫苗的实验研究》文中指出目前,空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni , C. jejuni)感染已成为全球范围内急性胃肠炎最常见的病因之一。更具严重后果的是该菌与格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome, GBS)有非常密切的关系,是导致GBS发生的重要前驱感染原。但是,由于目前对C. jejuni的遗传学特性、毒力因子、致病作用和C. jejuni诱发GBS的机制尚不完全明了,至今仍缺少有效而可行措施来预防C. jejuni腹泻和GBS的发生。为此,本研究针对C. jejuni是一种多变、易变的肠道感染细菌,利用DNA疫苗诱导特异性体液免疫、细胞免疫的优势和壳聚糖增强粘膜吸收、缓释等特性,设计制备了具有高效粘膜免疫应答的C. jejuni多价DNA疫苗。并探讨其在小鼠体内诱导特异性免疫应答的效应和在小鼠C. jejuni攻击模型中的免疫保护力,以及其在应用中的周围神经安全性问题。为深入开发新型C. jejuni疫苗奠定理论基础。课题拟按以下四部分进行:第一部分空肠弯曲菌多价DNA疫苗的构建及其表达目的:利用基因工程技术分别构建C. jejuni cadF和peblA基因的真核表达重组质粒,并以此重组质粒DNA为核心,通过壳聚糖包裹DNA,构建C. jejuni多价DNA疫苗。并评价壳聚糖作为DNA疫苗递
王婷[3]2008年在《空肠弯曲菌flaA、peb1A基因的克隆表达及单克隆抗体的制备》文中认为空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)是近十几年受到国内外学者广泛重视的一种重要的人畜共患的病原菌。该菌除引起人发热、急性肠炎、Reiter和Guillain-Barri综合征等疾病外,还可引起牛和绵羊流产,火鸡的肝炎和蓝冠病,童子鸡和雏鸡坏死性肝炎,雏鸡、犊牛、仔猪的腹泻等多种疾病,已成为全球范围内急性胃肠炎最常见的病因之一。本试验对空肠弯曲菌分离鉴定和保存的条件进行了优化,针对C.jejui可能的毒力因子鞭毛蛋白(FLA)和外膜蛋白(PEB1)基因进行了克隆测序、人工改造合成,高效地表达了FLA、PEB1,并利用表达的FLA蛋白筛选了针对空肠弯曲菌鞭毛的单抗;建立了flaA、peb1A基因常规PCR和套式PCR检测方法。分5组对空肠弯曲菌的培养气体条件,培养基、温度、时间、保存等条件进行了优化;参考GB、SN、FDA标准对样品进行人工布菌及分离鉴定,探讨其分离灵敏度;对南京市场的鸡肉、牛奶等食品的污染情况进行调查。结果显示将空肠弯曲菌以分区划线方式接种在Skirrow血平板,在5%O_2、10%CO_2和85%N_2的混合气体叁气培养箱中,37-42℃培养36-48h,生长最佳;加脱脂乳冻干后置于-80℃有利于该菌的长期保存;增菌前先分别将样品进行细菌富集处理,在增菌液中加入血、头孢哌酮,用双平板进行分离能有效地提高分离率,灵敏度可达到100CFU/mL或100CFU/g;南京市场部分样品随机抽取80份/种,其空肠弯曲菌的平均检出率分别为:生鲜鸡肉23.75%,冷冻鸡肉11.25%,牛奶16.50%,市场污水6.25%。由于空肠弯曲菌的传统检测方法耗时费力,易出现假阴性结果,本试验针对空肠弯曲菌flaA、peb1A基因的建立了常规PCR及套式PCR法对该菌进行检测。结果表明传统检测方法的灵敏度为45-100CFU/mL;常规PCR灵敏度10-20CFU/mL;套式PCR法灵敏度为2-6 CFU/mL。所建立的套式PCR方法在灵敏度等指标上均优于空肠弯曲菌的传统检测和常规PCR检测方法。根据已经发表的空肠弯曲菌NCTC11168(Pen2血清型)的flaA、peb1A基因序列,分别设计和合成2对引物,并以ATCC29428株的基因组为模板,通过PCR技术,扩增出flaA、peb1A基因片段,定向克隆至pMD18-T载体中并测序,利用DNAstar软件,将所测序列与不同来源弯曲菌的flaA,peb1A序列进行同源性比较;结果表明所克隆的基因与报道的NCTC11168flaA,peb1A基因序列核苷酸序列同源性分别为88.3%,98.1%。测序可知flaA、peb1A基因序列(G+C)%含量低,与E.coliBL21(DE3)的密码子兼并性较差,用软件改造合成了flaA(1-588bp)、peb1A(72-780bp)的区间序列,构建pET-28a(+)-flaAg、pET-28a(+)-peb1Ag表达载体;转化E.coli BL21(DE3)后诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,最高表达量占全菌总蛋白的70%左右;Ni~(2+)-NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白FLA、PEB1,用空肠弯曲菌全菌小鼠抗体的Westernblot鉴定FLA、PEB1免疫原性,间接ELASA试验鉴定FLA、PEB1免疫小鼠的抗血清,效价分别为1:12800,1:25600,结果表明FLA、PEB1具有良好的免疫原性,为亚单位疫苗的研制和单克隆抗体的筛选奠定了基础。用0.8%甲醛灭活的空肠弯曲菌ATCC29428株全菌作为抗原,常规免疫Balb/c小鼠,待ELISA抗体水平达到1:51200时,取脾细胞与对数期生长良好的Sp2/0进行融合;以粗提及表达纯化的鞭毛蛋白FLA包被的间接ELISA方法反复筛选和多次克隆化培养,筛选出能特异分泌抗FLA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Westernblot对单抗进行生物学特性进行鉴定,获得3株持续、稳定分泌小鼠抗鞭毛单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1G8、1G9和3F2,为建立夹心ELISA、免疫磁捕获等检测方法和进一步筛选保护性抗原奠定了基础。
参考文献：
[1]. 空肠弯曲菌粘附蛋白基因工程疫苗的实验研究[D]. 冯永嘉. 重庆医科大学. 2003
[2]. 空肠弯曲菌多价DNA疫苗的实验研究[D]. 郑惠. 重庆医科大学. 2006
[3]. 空肠弯曲菌flaA、peb1A基因的克隆表达及单克隆抗体的制备[D]. 王婷. 南京农业大学. 2008
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