郑惠珍[1]2004年在《Rho激酶在烧伤诱导的内皮屏障功能损害中的作用》文中研究指明本文应用显微外科技术、荧光比例技术、共聚焦显微镜技术和细胞生物学等方法，从组织、细胞两个层次研究了小G蛋白亚家族RhoA的下游效应器Rho激酶在烧伤诱导的微血管通透性增高中的作用与机理。重点查明：1、烧伤后皮肤微血管通透性增高是否伴随内皮肌动蛋白细胞骨架重组；2、Rho激酶是否参与烧伤后皮肤微血管通透性增高和内皮肌动蛋白细胞骨架重组。 在组织水平的研究中，用游离灌注的烧伤后大鼠皮肤微静脉测定了微静脉对荧光标记白蛋白的通透性，荧光标记白蛋白通过血管壁的扩散通量以通透系数Pa表示。用F-actin特异的荧光探针罗丹明-鬼笔毒环肽对微静脉染色和激光共聚焦显微镜技术观察微静脉内皮肌动蛋白细胞骨架的改变。用Rho激酶特异抑制剂Y-27632药理学干预的方法以评估Rho激酶在烧伤诱导的内皮屏障功能损害中的作用。主要结果： 1、烫伤后皮肤微静脉通透性增高，Pa值为对照组的3倍，P＜0.01。 2、Y-27632对正常皮肤微静脉Pa值无明显影响，但使经烫伤后增高的皮肤微静脉通透性降低，呈现剂量和时间效应。血管浸浴液中加入Y-27632(30 μmol／L)，10～15min后Pa值开始逐渐下降，50min后，Pa降低值与基础值比较有统计学意义，(P＜0.05)。这种作用是可逆的，Y-27632撤离后，Pa值逐渐恢复，约30min后恢复至基础值。Y-27632浓度增加至60μmol／L，Pa值降低的幅度明显大于30μmol／L组。孵育20min后，Pa值明显地低于孵育前，并持续至90min；撤离Y-27632后，Pa值没有明显恢复。 3、正常大鼠皮肤微静脉内皮细胞F-actin位于细胞周边，细胞-细胞连接的附近，形成致密的纤维束，称之周边肌动蛋白纤维环(peripheral actin rim，PAR)，PAR沿细胞-细胞连接处规则而连续排列，相互交错成网。单个PAR的宽度约6～15μm，长度约10～40μm，细胞内有少量短的肌动蛋白丝。偶见肌动蛋白纤维环断裂，少量绿色荧光蛋白漏出。Rh口麟酶与烤份欢营通透趁 4、烫伤后皮肤微静脉内皮肌动蛋白细胞骨架发生重组。PARs解聚、断裂，规则的网状结构消失，部分肌动蛋白纤维向附近散开，血管内残留断裂的F一actin结节，大量荧光蛋白漏出。 5、烫伤后皮肤微静脉用丫27632(60卜mo比)37oe孵育40n五n后，内皮细胞PARs清晰可见，偶见断裂的PARs，仅少量荧光蛋白漏出，其结果与正常对照组相似。 在细胞水平的研究中，原代培养的大鼠皮肤微血管内皮细胞 (DMEC)和人类脐静脉内皮细胞ECV304细胞株按实验分组分别用大鼠对照血清、大鼠烧伤血清、RhoA激动剂溶血磷脂酸(LRA)、助。激酶抑制剂Y-27632单独处理或联合处理。用扫描电镜观察细胞表面超微结构，荧光染色观察(罗丹明一鬼笔毒环肤、俄勒冈绿一DNA酶DF一actin和G一actin，流式细胞仪检测actin含量，检测内皮单层通透性(荧光标记白蛋白透过融合的内皮单层的扩散通量)，以通透系数Pa表示。结果: 1、扫描电镜下，正常内皮细胞生长良好，表面有许多凹陷和微绒毛，细胞侧面的突起细而长，与相邻细胞侧面的小突起相互融合，紧密连接。烧伤血清刺激6h，细胞表面微绒毛被波浪状皱纹取代，细胞侧面突起变短，细胞间出现缝隙。烧伤血清刺激6h后，加丫27632(30卜mo讥)孵育45而n，细胞表面微绒毛与波浪状皱纹并存，细胞侧面突起细长，与相邻细胞相互融合，连接紧密。这些表现在DMEC与ECv-304细胞之间比较无明显差异。 2、正常大鼠DMECF一actin主要分布在细胞周边，形成周边肌动蛋白丝带，在细胞与细胞接触处呈束状相互连接，细胞生长融合为单层后呈网状结构。胞浆内有少量短而细的应力纤维。烧伤血清刺激6h，F-actin重组，丝状和板状伪足形成，出现粗而长的应力纤维，周边肌动蛋白丝带模糊甚至消失。延长烧伤血清刺激时间为sh，应力纤维进一步增加，周边肌动蛋白丝带消失。细胞与Y-27632(30卜m。比)单独孵育，周边肌动蛋白丝带变薄，但连续、光滑、清晰。在烧伤血清刺激6h或sh后，加入30卜伽比的丫27632孵育45而n，周边肌动蛋白丝带变细、断断续续、但清晰可见，应力纤维消失，出现丝状和板状伪足。其表现6h组与sh组比较无明显差异。细胞与丫27632(30林mo比)预孵育lh后再加烧伤血清刺激6h或sh后，可改善烧伤血清刺激诱导的F-actin改变，应力纤维形成明显减少，周边肌动蛋白丝带变细，但光滑、连续，出现丝足，一些细胞出现板状伪足。ECV-304细胞的反应与DMEC基本相似，但不及DMEC敏感。 3、正常DMEC单体肌动蛋白(G一actin)主要分布在胞核及核周处，烧伤血清和丫27632单独处理或联合处理均未能引起明显改变。ECV304细胞G一actin集聚在细胞中央，呈球形或梭形，棉絮状，中央部染色较淡，周边部着色稍深。烧伤血清刺激后，G一actin结构松散，向细胞周边扩散，分布面积增大，胞浆中可见散在分布的絮状G一actin。丫27632前处理或后处理均能改善烧伤血清诱导的G一actin形态改变，G一actin分布面积缩小，结构紧密，胞浆中散在分布的絮状G一actin明显减少。 4、DMECs，溶血磷脂酸(LPA，13林mo比)，)刺激引起F一aetin的改变主要表现为周边肌动蛋白丝带模糊，应力纤维增加，
褚志刚[2]2007年在《p38激酶/Caldesmon途径介导烧伤血清诱导的血管通透性增加及其机制研究》文中研究表明血管通透性增高是烧伤早期体液丢失,引发休克和早期全身缺氧性损害的根本原因,其本质是血管内皮通透性的增高。由于其机制一直没有充分阐明,临床上针对烧伤的治疗,尚未找到能降低通透性和减少烧伤输液的有效措施。相对于穿细胞途径,内皮细胞旁途径是烧伤后血管内皮通透性增高的主要途径。研究表明,血管通透性变化与调节涉及细胞骨架重组、粘附连接、紧密连接结构与功能改变等不同的机制。内皮细胞收缩性改变是不同原因引起通透性增加的共同通路,主要受骨架蛋白中肌球蛋白和肌动蛋白的影响。p38激酶可能在细胞因子和炎症介质所致的内皮通透性增高中起着重要的信号转导作用,p38 MAPK通过磷酸化下游靶蛋白来调节细胞的功能。目前已发现p38MAPK有5个异构体,激酶分析显示p38α是最主要的活性形式,在炎症反应中起关键作用。钙调素结合蛋白(Caldesmon)分为高分子量Caldesmon(h-Caldesmon)和低分子量Caldesmon(l-Caldesmon)。两者是同一基因的不同拼接型,结构相似。l-Caldesmon可以和维状肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、钙调素相结合。l-Caldesmon在调节细胞骨架的动态平衡中起着重要作用,l-Caldesmon的功能变化在内皮细胞高通透性中扮演了重要角色。一、研究目的探讨p38激酶和Caldesmon在烧伤早期血管通透性变化中的调控作用和机制。二、材料方法1.以体外培养的ECV304细胞和双层培养系统制成单层血管内皮细胞模型。2.实验分组:将细胞分为正常血清组( A组)、正常血清+ SB203580组(B组)、烧伤血清组( C组)、烧伤血清+ SB203580组( D组)、正常血清+重组腺病毒组(E组)、烧伤血清+重组腺病毒组(F组)组、空病毒组(G组)和重组腺病毒组(H组)。3.构建Caldesmon重组腺病毒载体,包装293细胞,制备重组腺病毒。4.采用绿色荧光标记的白蛋白,观察A组、B组、C组、D组、E组和F组单层内皮细胞0.5h、1h、2h、4h时的通透性变化。5. Western blot法检测A组、B组、C组、D组p38、p-p38和p-Caldesmon表达变化以及G组和H组Caldesmon表达变化,利用免疫细胞化学染色观察A组、B组、C组、D组细胞F-actin的形态。叁、主要结果1.烧伤血清刺激后,单层内皮细胞的白蛋白滤过明显增加,SB203580预处理明显减少了单层内皮细胞白蛋白滤过。2.正常内皮细胞p38激酶磷酸化水平较低,烧伤血清刺激后,p38激酶磷酸化水平明显增高,SB203580预处理可以明显抑制p38激酶磷酸化水平增高,而p38激酶蛋白表达水平无明显变化。3.正常内皮细胞F-actin排列成束状,与细胞纵轴大致平行,细胞中央和周边无显着差异。烧伤血清刺激后,细胞F-actin明显重排,细胞收缩变圆,SB203580预处理可以抑制F-actin的重排。4.成功构建了Caldesmon重组腺病毒载体,重组腺病毒滴度可达1×109U/ml,重组腺病毒感染内皮细胞后Caldesmon蛋白的表达明显增高。5.重组腺病毒感染内皮细胞明显减少了烧伤血清刺激后单层内皮细胞白蛋白滤过。6.正常内皮细胞磷酸化Caldesmon蛋白水平较低,烧伤血清刺激后,磷酸化Caldesmon蛋白水平明显增高,SB203580预处理可以明显抑制磷酸化Caldesmon蛋白水平增高。四、讨论与结论1.烧伤血清可导致内皮细胞通透性增高,p38激酶活性与烧伤血清导致的血管通透性增加密切相关。2.细胞F-actin重排是烧伤血清刺激后单层血管内皮细胞通透性增高的重要机制,而内皮细胞F-actin重排受p38激酶调控。3.成功构建了Caldesmon重组腺病毒载体,且染效率高,能够有效表达目的基因,具有较高的感染力。Caldesmon蛋白在烧伤血清所引起的单层内皮细胞通透性增高中起重要作用。4.烧伤血清可明显增高内皮细胞磷酸化Caldesmon蛋白水平,而烧伤血清引起的磷酸化Caldesmon蛋白水平增高是由p38激酶活化所致。5. p38激酶/Caldesmon途径是烧伤血清导致血管通透性增加的重要机制,该途径可能通过调节细胞骨架F-actin重排而发挥作用。这为临床防治烧伤早期低容量性休克和全身缺氧性损害提供了新的思路和实验依据。
郑惠珍, 黄巧冰, 赵克森[3]2004年在《Rho激酶抑制剂Y - 2 76 32部分预防烧伤血清诱导的内皮屏障功能损害》文中研究指明目的 :观察大鼠烧伤血清对内皮屏障功能的影响及Rho激酶特异抑制剂Y - 2 76 32的作用。方法 :原代培养的大鼠皮肤微血管内皮细胞按实验分组分别用大鼠对照血清、烧伤血清、Y - 2 76 32单独处理或联合处理。用扫描电镜观察细胞表面超微结构 ,罗丹明 -鬼笔毒环肽荧光染色观察肌动蛋白细胞骨架的改变。通过检测荧光标记白蛋白透过内皮单层的通量分析内皮单层通透性 ,以通透系数Pa表示。结果 :正常内皮细胞生长良好 ,表面有许多凹陷和微绒毛 ,细胞侧面的突起细而长 ,与相邻细胞侧面的小突起相互融合 ,紧密连接。烧伤血清刺激 6h ,细胞表面微绒毛被波浪状皱纹取代 ,细胞侧面突起变短 ,细胞间出现缝隙。正常内皮细胞F -actin主要分布在细胞周边 ,形成周边肌动蛋白丝带 ,在融合的内皮细胞单层 ,周边肌动蛋白丝带相互连接成网状。烧伤血清刺激后 ,肌动蛋白细胞骨架重组 ,出现应力纤维 ,同时周边肌动蛋白丝带模糊 ,内皮单层对白蛋白通透性增高。烧伤血清刺激 6h后 ,加Y - 2 76 32孵育 4 5min ,细胞表面微绒毛与波浪状皱纹并存 ,细胞侧面突起细长 ,与相邻细胞相互融合 ,连接紧密。周边肌动蛋白丝带清晰 ,应力纤维消失。内皮单层Pa值虽较单纯烧伤组低 14 16 % ,但P >0 0 5。细胞用Y - 2 76 32预处理 1h后再用烧伤
刘琛[4]2010年在《缺氧诱导因子-1α介导的ROCK通路活化在缺氧后血管内皮高通透性发生中的作用》文中研究指明一、背景与目的烧伤早期因多种因素引起血管内皮细胞损伤,导致细胞骨架肌动蛋白及细胞间连接等发生改变,细胞间隙增大,通透性增加,大量血浆样液体从血管渗出,血容量锐减及发生休克。血管通透性增加是烧伤休克的关键原因,而休克所导致的组织缺血缺氧又加重血管通透性的增加,形成恶性循环。迄今为止,烧伤早期血管通透性增加的发生机制仍不完全清楚,临床上则更无有效的治疗措施来降低烧伤早期血管通透性的增加。内皮细胞收缩性改变是不同原因引起血管通透性增加的主要共同通路,而内皮细胞收缩性的调控主要受细胞骨架蛋白中肌球蛋白和肌动蛋白的影响,并依赖于肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)的磷酸化。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)和肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)在MLC磷酸化的调控中起着极其重要的作用。MLCK受Ca2+-钙调蛋白激活后,直接催化MLC从非磷酸化型向磷酸化型转变,使磷酸化型MLC增加;MLCP则催化MLC从磷酸化型向非磷酸化型转变,导致磷酸化型MLC减少,而MLCP活性又受Rho激酶(ROCK)的负性调控,故ROCK被激活也引起MLC磷酸化增加。磷酸化的MLC活化肌球蛋白重链头部的ATP酶,产生的能量使细胞骨架肌动蛋白微丝滑动,细胞发生收缩,细胞间隙形成,通透性增加。缺血缺氧是严重烧伤早期重要的病理生理变化,也是严重烧伤早期多种因素造成组织细胞损害的主要途径,但缺血缺氧引起严重烧伤早期血管通透性增加的机制仍未完全阐明。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)被认为是介导机体缺氧反应的重要转录因子之一,在缺血缺氧的病理生理变化调控中具有重要作用。目前的一些零星研究表明,HIF-1α参与了血管通透性的调控,但报道的分子机制不完全相同。因此,本课题建立体外单层内皮细胞的缺氧模型,研究HIF-1α是否通过ROCK-MLC磷酸化通路参与缺氧内皮细胞通透性增加发生机制,以进一步阐明烧伤早期缺血缺氧时血管通透性增加的分子机制。一、材料与方法1.以体外培养的单层血管内皮细胞为模型,研究缺氧(1%O2)条件下单层内皮细胞通透性的变化,同时研究HIF-1α蛋白表达、紧密连接蛋白occludin蛋白表达、ROCK通路主要相关蛋白如RhoA、ROCKΙ、ROCKⅡ蛋白表达、MLCP亚基MYPT1磷酸化以及MLC磷酸化的变化。2.研究应用ROCK特异性抑制剂ROCKOUT抑制ROCK通路对缺氧单层内皮细胞通透性及MLC磷酸化的影响。3.研究常养条件下应用DMOG诱导HIF-1α蛋白表达对内皮细胞occludin蛋白表达及ROCK-MLC磷酸化通路的影响。4.研究应用HIF-1α抑制剂YC-1和寡霉素抑制HIF-1α蛋白表达后,缺氧内皮细胞ROCK-MLC磷酸化通路活化及单层内皮细胞通透性的变化。5.构建人HIF-1α的RNA干扰表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-siHIF-1α,转染内皮细胞,建立HIF-1α低表达内皮细胞系,研究抑制HIF-1α基因表达后缺氧内皮细胞ROCK-MLC磷酸化通路活化以及通透性的变化。1.缺氧后单层内皮细胞的通透性明显增加,同时伴随有ROCK通路的相关变化,如RhoA、ROCKΙ、ROCKⅡ蛋白表达增加,MLCP亚基MYPT1磷酸化增加,以及MLC磷酸化增加。2.缺氧后内皮细胞HIF-1α蛋白表达明显增加。3.缺氧前后内皮细胞紧密连接蛋白occludin的蛋白表达无明显变化。4. ROCK特异性抑制剂ROCKOUT在明显抑制缺氧内皮细胞MLC磷酸化的同时,还能部分抑制缺氧引起的单层内皮细胞通透性增加。5.常氧条件下HIF-1α诱导剂DMOG不仅明显诱导内皮细胞HIF-1α蛋白表达增加,还引起ROCKII蛋白表达、MLCP亚基MYPT1磷酸化以及MLC磷酸化的明显增加,但对内皮细胞紧密连接蛋白occludin的蛋白表达无明显影响。6.HIF-1α抑制剂YC-1和寡霉素明显抑制缺氧内皮细胞HIF-1α蛋白表达,同时能抑制缺氧引起的RhoA、ROCK1、ROCKII蛋白表达增加,MLCP亚基MYPT1磷酸化增加以及MLC磷酸化增加,还对缺氧后单层内皮细胞通透性增加也有部分抑制作用;但对缺氧内皮细胞TJ蛋白occludin的蛋白表达无明显影响。7.成功构建了HIF-1αRNA干扰表达载体并稳定表达于内皮细胞;抑制HIF-1α基因表达后,缺氧所引起的内皮细胞RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表达、ROCK激酶活性增加受到抑制,MLCP亚基MYPT1磷酸化以及MLC磷酸化也受到抑制;缺氧单层内皮细胞通透性的增加也被明显抑制。叁、结论1.缺氧引起的内皮细胞通透性增加伴有ROCK-MLC磷酸化通路的活化,特异性抑制ROCK活性能明显抑制MLC磷酸化及通透性增加。ROCK通路活化所引起的MLC磷酸化参与了缺氧时血管内皮通透性增加的发生。2. ROCK-MLC磷酸化通路活化所引起缺氧内皮细胞通透性增加伴有HIF-1α蛋白表达增加,而常氧下诱导HIF-1α蛋白表达能引起ROCK-MLC磷酸化通路活化,HIF-1α可能在缺氧内皮细胞ROCK-MLC磷酸化通路活化中具有一定作用。3. HIF-1α的化学性抑制剂能明显抑制缺氧引起的内皮细胞ROCK-MLC磷酸化通路活化并部分抑制缺氧引起的内皮细胞通透性增加,HIF-1α可能通过调控ROCK-MLC磷酸化通路参与了缺氧内皮细胞通透性增加的发生。4. HIF-1αRNA干扰既能抑制缺氧所引起的ROCK-MLC通路活化,也能明显抑制缺氧引起的内皮细胞通透性增加。HIF-1α介导的ROCK-MLC磷酸化通路活化是缺氧内皮细胞通透性增加的重要分子机制。
郑惠珍, 赵克森, 黄巧冰[5]2005年在《Rho激酶在烧伤大鼠血清诱导的血管内皮细胞骨架变化中的作用》文中研究指明目的 观察烧伤血清刺激下血管内皮细胞骨架的变化及Rho信号转导通路所起的作用。 方法 常规培养人脐静脉血管内皮细胞系ECV304,随机分为空白对照组、实验对照组、烧伤组、Y -27632组、烧伤+Y -27632组、Y- 27632+烧伤组、溶血磷脂酸(LPA)组和LPA+Y- 27632组,分别用正常大鼠血清、烧伤大鼠血清、30μmol/LRho激酶抑制剂Y -27632、13μmol/LRhoA激动剂LPA单独刺激或联合刺激。采用HE染色于光镜下观察各组内皮细胞形态。于荧光倒置相差显微镜下观察内皮细胞骨架变化,除Y -27632组外,各组均在刺激后6、7、8h3个时相点进行观察。用流式细胞仪检测实验对照组、烧伤组、Y -27632组、烧伤+Y- 27632组、LPA组和LPA+Y 27632组刺激6h的肌动蛋白含量。 结果 空白对照组、实验对照组细胞呈梭形或多边形,生长良好;丝状肌动蛋白主要分布在细胞周边,形成周边肌动蛋白丝带,细胞生长融合为单层后呈网状结构;球状肌动蛋白集中在细胞中央。烧伤组烧伤血清刺激6h,细胞贴壁差,丝状肌动蛋白重组,应力纤维形成,周边肌动蛋白丝带模糊;球状肌动蛋白松散,胞浆中可见散在分布的絮状球状肌动蛋白,且这些反应随着刺激时间延长而增强。烧伤+Y- 27632组或Y -27632+烧伤组细胞生长、贴壁良好,丝状肌动蛋白的分布与空白对照组、实验对
戚华兵[6]2006年在《缺氧诱导因子1在严重烧伤早期血管通透性调控中的作用》文中研究说明血管内皮的损伤是严重烧伤早期重要的病理变化之一,在烧伤早期损害中起重要作用。血管通透性改变是严重烧伤早期血管内皮损害的主要表现之一,也是严重烧伤早期组织水肿、体液外渗的重要病理基础。血管通透性的变化及其调控机制的研究,对烧伤休克期的处理以及预防烧伤早期损害均有重要意义。但是,严重烧伤后血管内皮细胞通透性变化的机制及调控途径目前尚不清楚。研究表明,血管通透性变化与调节涉及细胞骨架重组、粘附连接、紧密连接结构与功能改变等不同的机制。内皮细胞收缩性改变是不同原因引起通透性增加的共同通路,主要受骨架蛋白中肌球蛋白和肌动蛋白的影响,依赖于肌球蛋白轻链(myosinlight chain,MLC)的磷酸化。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)和肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)在MLC磷酸化的调控中起着极重要的作用。MLCK的激活可引起MLC的磷酸化;ROCK信号通路活化后,MLCP的磷酸化水平增加,降低MLC的去磷酸化水平,细胞中磷酸化MLC的水平升高。磷酸化的MLC活化肌球蛋白头部的ATP酶,产生的能量使细胞骨架肌动蛋白微丝(F-actin)滑动,细胞发生收缩。热力或某些化学物可直接损伤烧伤局部的血管内皮细胞,但远隔烧伤部位的血管内皮细胞的损害则为间接因素所致。烧伤血清是烧伤导致机体病理生理改变的综合性体液因素,含有大量氧自由基、炎症介质和多种细胞因子。缺血缺氧是严重烧伤早期重要的病理生理变化,也是严重烧伤后多种因素造成组织细胞损害的共同途径,缺血缺氧性损害是严重烧伤早期血管通透性增加的重要机制。大量的转录因子参与缺氧条件下细胞及机体的各种反应,而缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)被认为是介导机体缺氧反应的重要转录因子。目前认为,不仅HIF-1α蛋白的降解是一个氧浓度依赖的过程,通过缺氧诱导因子1抑制因子(factor inhibiting HIF-1,FIH)的作用,HIF-1α的反式激活功能也受分子氧的调节。常氧条件下,FIH通过不同的机制抑制HIF-1α的转录活性,FIH与HIF-1脯氨酰羟化酶1-3(HIF-1 prolyl hydroxylase 1-3,HPH1-3)共同构成了机体对氧浓度变化的感受器,参与缺氧条件下机体反应的调控。但是,HIF-1α以及FIH在缺氧条件下血管通透性变化中的作用目前尚不清楚。为了探讨严重烧伤后血管内皮细胞通透性变化及调控的机制,尤其是探究HIF-1α及FIH在缺氧条件下血管通透性变化中的作用,本研究在观察严重烧伤早期大鼠血管通透性变化的基础上,以体外培养的单层血管内皮细胞为实验模型,探究MLC磷酸化的升高及其介导的通透性变化在烧伤血清刺激和缺氧(1%O_2)诱导后血管通透性变化中的作用和相关机制;通过建立HIF-1α高表达(Forced expression)和HIF-1α低表达(Knock down)、FIH高表达血管内皮细胞系,探讨HIF-1α、FIH在缺氧条件下MLC磷酸化水平变化及血管通透性变化调控中的作用和机制。一、材料与方法1.采用大鼠30%TBSAⅢ度烧伤模型,检测正常及伤后2h、4h、6h、12h、24h不同时相点心、肝、肺、肾、空肠、回肠组织血管通透性及组织含水量;以体外培养的单层血管内皮细胞为模型,观察烧伤大鼠血清刺激后细胞单层细胞完整性与通透性变化,检测p-MLC蛋白的表达与变化、细胞骨架的重排,应用ML-9、Y-27632等阻断剂观察MLCK以及ROCK通路在烧伤血清刺激后血管通透性变化中的作用。检测烧伤血清刺激后MLCK、ROCK-Ⅱ以及ZO-1等细胞连接相关蛋白的表达与变化。2.以体外培养的单层血管内皮细胞为模型,观察缺氧(1%O_2)条件下单层细胞完整性与通透性的变化,检测p-MLC蛋白的表达与变化、细胞骨架重排,应用阻断剂ML-9观察MLCK通路在缺氧条件下血管通透性变化中的作用。检测缺氧诱导后MLCK及ZO-1等细胞连接相关蛋白的表达与变化,分别应用放线菌素D和放线菌酮,观察转录与翻译过程在缺氧诱导的MLCK表达中的作用。3.观察缺氧(1%O_2)条件下,人血管内皮细胞中HIF-1α蛋白水平的表达变化、核转位以及DNA结合能力、转录诱导能力的变化;应用缺氧模拟剂DMOG刺激细胞,观察常氧条件下MLCK以及p-MLC蛋白水平的表达以及变化;通过转染含有人HIF-1α全长cDNA序列的质粒(pcDNA3.1-V5-HisA-HIF-1α)构建的HIF-1α高表达细胞系和通过转染针对HIF-1α的siRNA质粒(pSUPER-si-HIF-1α)构建的HIF-1α低表达细胞系,研究HIF-1α在缺氧条件下MLC磷酸化所介导的血管内皮通透性改变中的作用。4.观察缺氧(1%O_2)以及DMOG诱导下,人血管内皮细胞中FIH蛋白水平的表达变化,通过转染含有人FIH全长cDNA序列的质粒(pcDNA3-FIH)构建FIH高表达(Forcedexpression)的人血管内皮细胞系,研究FIH在缺氧条件下MLC磷酸化所介导的血管内皮通透性改变中的作用。二、主要结果1.严重烧伤后2h,大鼠心、肺、肾脏的血管通透性明显增加,烧伤后4h观察到肝脏血管通透性的增加。随后,随着时间的延续,各脏器的通透性有一个降低的过程,在伤后12h,各脏器的通透性再次升高,并在我们的观察期间(24h),维持在一个相对较高的水平。严重烧伤后2h,大鼠肾脏含水量即有明显增加,心脏含水量伤后4h开始增加,12h、24h明显高于正常水平;12h、24h肝脏组织含水量明显高于正常。伤后12h空肠组织含水量明显高于正常。2.烧伤血清刺激后,单层细胞的TER明显降低,通透系数增加,细胞中p-MLC水平升高,细胞骨架明显重排,应力纤维形成。ML-9、Y-27632预处理后TER降低幅度明显减小,细胞骨架重排减轻,应力纤维明显减少。ML-9预处理可明显降低烧伤血清诱导p-MLC的升高。烧伤血清明显诱导了MLCK、ZO-1蛋白的表达,而ROCK-Ⅱ、Occludin、Claudin 1等蛋白表达无明显变化。3.缺氧诱导后,单层细胞完整性被破坏,TER明显降低,通透系数明显增加,细胞p-MLC水平升高,细胞骨架明显重排,应力纤维形成。ML-9预处理后TER降低明显减弱,细胞骨架重排减轻,应力纤维明显减少。ML-9预处理可明显抑制缺氧诱导后p-MLC的升高。缺氧明显诱导了MLCK、ZO-1蛋白的表达,而Occludin、Claudin 1等蛋白表达无明显变化。放线菌素D和放线菌酮预处理降低缺氧诱导的MLCK、p-MLC蛋白水平的升高。4.缺氧条件下HIF-1α、HIF-2α蛋白水平明显升高。缺氧6h,HIF-1α核转位、与DNA结合的能力、转录活性均明显增强。常氧条件下DMOG刺激不仅HIF-1α、HIF-2α蛋白水平明显增加,MLCK、p-MLC、ZO-1蛋白水平也明显升高。缺氧条件下建立的HIF-1α高表达细胞系HIF-1α蛋白、mRNA水平明显增加,而HIF-1α低表达细胞系HIF-1α蛋白、mRNA水平明显降低,核转位明显减弱。缺氧24h,HIF-1α高表达细胞系TER降低幅度加大,p-MLC、MLCK、ZO-1蛋白水平增加更明显,而HIF-1α低表达细胞系TER的降低幅度减小,p-MLC、MLCK、ZO-1蛋白增加幅度明显降低,细胞骨架重排减轻。5.缺氧和常氧条件下,DMOG处理均可降低VE细胞中FIH蛋白水平,建立的FIH高表达细胞系中FIH蛋白水平均明显升高,明显抑制HIF-1α转录活性。缺氧24h,FIH高表达细胞系TER降低幅度明显降低,p-MLC、ZO-1蛋白水平亦明显降低,细胞骨架重排明显减轻。叁、结论1.严重烧伤早期心、肺、肾、肝等主要脏器的血管通透性、组织含水量明显增加。烧伤血清明显损害体外培养的单层血管内皮细胞的完整性,p-MLC蛋白水平升高介导烧伤血清刺激后通透性的增加。MLCK、ROCK通路均参与了烧伤血清刺激后p-MLC表达的调控。烧伤血清刺激后MLCK蛋白水平的增加,是p-MLC升高的重要调控机制。2.缺氧明显损害体外培养的单层血管内皮细胞通透性,p-MLC蛋白水平升高介导缺氧后通透性的增加。MLCK通路是缺氧后p-MLC表达调控的重要途径。缺氧诱导后MLCK蛋白水平的增加,是p-MLC升高的重要机制,该过程是一个转录依赖的过程。同时,缺氧后ZO-1蛋白明显增加,可能参与缺氧条件下通透性变化的调控。3.缺氧条件下,HIF-1α蛋白水平及活性的增加在血管通透性的变化以及调控中发挥重要作用。HIF-1α参与调控缺氧条件下MLCK蛋白水平的升高及单层细胞中p-MLC水平增加、细胞骨架的重排和应力纤维的形成。另外,HIF-1α也可能通过调控ZO-1蛋白的表达参与缺氧条件下通透性的调控。4.缺氧条件下,FIH在血管通透性的变化及调控中发挥重要作用。FIH参与调控缺氧条件下p-MLC水平的增加、细胞骨架的重排和应力纤维的形成。另外,FIH也可能通过调控ZO-1蛋白表达变化参与缺氧条件下通透性的调控。
陈银兵[7]2011年在《参麦、血必净对严重烫伤家兔早期ET-1、NO及TNF-α影响的实验研究》文中研究说明目的严重烧伤后全身微血管通透性增加是造成低血容量性休克和器官功能障碍的重要原因。目前尚没有找到一个有效的防治血管通透性增高和血浆渗出丢失的方法,只有根据烧伤的面积和深度大量补液来弥补液体的丢失。微循环在结构和功能的变化是导致烧伤休克的病理生理变化的机制之一,微循环的基本变化表现在以下几个方面：1由于早期血管收缩和血浆渗出,灌流量减少；2毛细血管和微静脉壁内皮细胞损害,使血管通透性增加,血浆丢失,加重循环血量的减少；3,休克反应中晚期微血管扩张,血管容量增加,有效循环量进一步减少；4.由于血浆丢失,使血细胞比容增加,细胞容易聚集。研究者们一直在探索改善烧伤后微循环,降低血管通透性的方法,以期通过减少液体丢失而延缓休克发生的时间,减少休克期补液量,改善脏器组织水肿。本研究拟采用家兔30%TBSAⅢ度烧伤模型,观察严重烫伤早期给予参麦注射液、血必净注射液对ET-1、NO及TNF-α的影响,并分析相关机制,为参麦、血必净应用于改善烧伤后机体早期微循环,降低血管通透性提供理论及实验依据。方法1实验动物分组：本实验共使用32只成年健康家兔,雌雄不拘,雌鼠未孕。烫伤对照组：8只；假烫伤组：8只；参麦组：8只；血必净组：8只。2实验前准备：体重,编号,致伤面积为30%,画出背部占体表30%的致伤范围,脱毛面积约为40%。8%硫化钠脱毛备皮,生理盐水洗净。3家兔30%TBSAⅢ度烧伤模型复制：用速眠新麻醉家兔,麻醉成功后,将家兔背部浸入恒温水浴锰(92℃)中20s达Ⅲ度烫伤,伤后迅速脱离热源,保温。伤后即刻对大鼠进行复苏,复苏成功后,模型复制完成。4抽血时相：按烫伤即刻,烫伤后6小时,12小时,24小时,48小时5个时相点抽取家兔颈静脉血液。参麦组和血必净组分别给予参麦注射液和血必净注射液2m1/kg加入等渗盐水至20ml滴注,每日3次,连续两天,然后按时相点抽血。5.检测指标：所采得的全血予离心(1500r/min,10min),取上清液,所得血清放置于-70℃冰箱内保存,待所有标本采集完毕后,再统一检测指标。分别检测各时相血清内的TNF-α、ET-1、NO的浓度,从而参麦注射液、血必净注射液对严重烫伤早期ET-1、NO及TNF-α的影响。TNF-α、ET-1的检测采用ELASA法,NO的检测采用硝酸还原酶法。6.实验数据处理：所有数据处理均采用SPSS13.0软件进行统计学分析。所有计量资料均用x±s表示,组间分析采用两独立样本的t检验进行检验,其中对于方差齐性数据采用方差齐同条件下的t检验,方差不齐数据采用方差不齐条件下的t检验,以P<0.05为有统计学意义。实验结果：1.ET含量的测定：烫伤对照组、参麦组和血必净组伤后血清ET-1水平均呈显着上升趋势,但参麦组、血必净组增高幅度较烫伤对照组慢,12小时相点叁组ET-1均达最高；而在24小时和48小时,参麦组、血必净组分别与烫伤对照组比较有显着差异(P<0.01),但两组之间比较无统计学意义(P>0.05)。2.NO含量的测定：在6小时烫伤对照组、参麦组和血必净组NO水平均达到最高；而在24小时和48小时,参麦组、血必净组分别与烫伤对照组比较有显着差异(P<0.01),但两组之间比较无统计学意义(P>0.05)。3.ET/NO比值的变化：烫伤对照组、参麦组和血必净组伤后血清ET/NO比值均呈显着上升趋势,在12小时叁组ET-1/NO比值水平均达到最高；而在48小时,参麦组、血必净组分别与烫伤对照组比较有显着差异(P<0.01),但两组之间比较无统计学意义(P>0.05)。4.TNF-α含量的测定：烫伤对照组、参麦组和血必净组伤后血清TNF-α水平均呈显著上升趋势,但参麦组、血必净组升高幅度较烫伤对照组慢,在12小时烫伤对照组、参麦组和血必净组TNF-α水平均达到最高；而在24小时和48小时,参麦组、血必净组分别与烫伤对照组比较有显着差异(P<0.01),但两组之间比较无统计学意义(P>0.05)。结论1.参麦注射液、血必净注射液均能通过降低严重烫伤家兔早期血浆ET-1、NO、TNF-α的水平,优化ET/NO比值途径,改善严重烫伤家兔早期微血管循环,降低血管通透性,对内皮细胞起到一定的保护作用。2.检测严重烫伤家兔早期ET-1,N0,TNF-α水平及早期应用参麦注射液、血必净注射液对治疗严重烫伤后机体早期微循环障碍及血管通透性增高有着积极的临床意义。
陈传莉[8]2009年在《肌球蛋白轻链激酶介导的肌球蛋白轻链磷酸化在严重烧伤早期肠粘膜屏障损害中的作用》文中研究说明一、背景与目的肠粘膜上皮屏障是体内重要的生物防御屏障,在抵御肠腔内细菌和/或内毒素的移位过程中起着中坚作用。过去的研究表明,严重烧伤后肠道粘膜上皮组织明显受损,屏障功能紊乱,通透性增加,肠道细菌和/或内毒素移位,从而引发或加重烧伤后一系列病理生理变化,但严重烧伤后肠粘膜屏障功能损害的分子机制仍不完全清楚。肠粘膜屏障完整性得以维持的结构基础是细胞间的紧密连接(TJ)及其相关蛋白。TJ是由多种蛋白质相互作用而形成的复合体,在调节肠粘膜通透性和维持上皮细胞极性中发挥着重要作用。TJ由特异的连接蛋白使两个相邻细胞之间的间歇完全闭锁,与其密切相关的蛋白主要包括ZO-1、occludin、claudin等,其中ZO-1又与胞内细胞骨架肌动蛋白相连,使胞内细胞骨架与细胞外连接蛋白实现信号互为沟通。在相关信号刺激下,由于骨架蛋白活动和细胞回缩,引起连接蛋白结构和功能失调,细胞间隙形成,屏障通透性增加。研究表明,屏障通透性变化与调节涉及细胞骨架重组、紧密连接、粘附连接结构等不同的机制。细胞收缩是各种原因引起屏障通透性增加的共同通路,主要受肌动蛋白(actin)和肌球蛋白(myosin)的影响,并依赖于肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)的磷酸化。鉴于MLC磷酸化在生物屏障功能的调控中起着重要作用,而既往有关研究资料又缺乏对MLC磷酸化与烧伤后肠粘膜屏障功能损害关系的探讨,本研究围绕MLC磷酸化与烧伤早期肠粘膜屏障功能损害,重点探讨肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)所介导的MLC磷酸化与严重烧伤早期肠粘膜上皮屏障功能损害、细胞骨架F-肌动蛋白、细胞紧密连接蛋白等变化的关系,初步明确MLCK所介导的MLC磷酸化在严重烧伤早期肠粘膜上皮屏障功能损害中的作用,以进一步完善烧伤后肠粘膜上皮屏障损害的发生机制。二、方法1.健康成年Sprague Dawley大鼠随机分为正常对照组(伤前)及伤后1、2、6、12、24h组,制备30% TBSAⅢ度烧伤模型。用异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-Dextran)示踪法检测大鼠肠粘膜通透性,免疫荧光法检测肠粘膜组织紧密连接蛋白ZO-1、F-肌动蛋白及p-MLC表达。2.健康成年BALB/c小鼠随机分为4个组:①正常对照组:正常小鼠行假致伤;②ML-9对照组:于假致伤的正常对照小鼠腹腔注射ML-9 (2 mg/kg);③烧伤组:小鼠接受30% TBSAⅢ度烧伤;④烧伤治疗组:于30% TBSAⅢ度烧伤小鼠腹腔注射ML-9(2mg/kg)。FITC-Dextran示踪法检测肠粘膜通透性,HE染色及光镜观察肠粘膜组织结构,透射电镜观察肠粘膜超微结构,免疫荧光法检测肠粘膜ZO-1及F-肌动蛋白,Western blot法检测肠粘膜MLCK及磷酸化型MLC(p-MLC)蛋白表达。3.以培养的单层肠上皮细胞(Caco-2)为模型,Caco-2细胞分为正常对照组(缺氧0h)、缺氧2、6、8、12和24 h组,另设ML-9对照组及缺氧组(ML-9终浓度为100μmol/L,不缺氧或缺氧6h),细胞缺氧是在1% O2条件下进行培养。电阻测定仪检测单层Caco-2细胞的跨细胞电阻(TER),Western blot法检测Caco-2细胞MLCK、MLC及磷酸化型MLC(p-MLC)蛋白表达。叁、主要结果1.烧伤后大鼠肠粘膜通透性明显增加,伤后6h达高峰,为正常对照的2.41倍。烧伤后肠上皮通透性的增加伴随有细胞骨架F-actin及紧密连接蛋白ZO-1的明显重分布,肠上皮细胞p-MLC表达明显增加。2.与正常对照组相比较,烧伤后6h小鼠肠粘膜通透性明显增加,光镜下肠粘膜组织结构受损明显,电镜下肠粘膜上皮细胞间连接增宽。同时,紧密连接蛋白ZO-1明显重分布、细胞骨架F-actin损害,肠粘膜组织p-MLC及MLCK蛋白表达明显增加。给予MLCK特异性抑制剂ML-9(2mg/mL)治疗后上述变化程度减轻。3.与正常对照相比较,缺氧后单层肠上皮细胞TER呈下降趋势,肠上皮细胞p-MLC和MLCK蛋白表达增加,但MLC蛋白表达无明显变化。用MLCK特异性抑制剂ML-9(100μmol/L)预处理能有效防止缺氧引起的单层肠上皮细胞TER降低及p-MLC蛋白表达增加,但对肠上皮细胞MLCK蛋白表达无明显影响。四、结论1.严重烧伤早期肠粘膜屏障通透性显着增加,以伤后6h最重。肠粘膜上皮细胞骨架F-actin及紧密连接蛋白ZO-1的重分布或重排参与了严重烧伤早期肠粘膜屏障通透性增加的发生机制。2.严重烧伤早期肠粘膜屏障通透性的增加伴随有MLCK蛋白表达及MLC磷酸化增加;特异性抑制MLCK介导的MLC磷酸化能明显降低烧伤引起的肠粘膜通透性增加,减轻组织结构受损、F-actin及紧密连接蛋白ZO-1的改变,表明MLCK介导的MLC磷酸化参与了严重烧伤早期肠粘膜屏障功能损害的发生。3.缺氧引起肠上皮细胞屏障功能损害,并伴随有MLCK蛋白表达及MLC磷酸化增加。特异性抑制MLCK活性能抑制缺氧引起的肠上皮细胞MLC磷酸化,减轻缺氧后肠上皮屏障功能损害,MLCK介导的MLC磷酸化参与了缺氧后肠上皮屏障功能损害的发生。
台运成[9]2016年在《HIF-1/ET-1途径对大鼠血管内皮细胞通透性的调控作用及机制》文中研究表明目的:本研究采用大鼠血管内皮细胞原代培养方法,建立了HIF-1α过表达及低表达细胞系,Real-time PCR及Western blot分别检测HIF-1α、ET-1、ETA,ETB、MLCK、p-MLC、ZO-1的m RNA及蛋白表达情况,探讨HIF-1/ET-1途径对大鼠血管内皮细胞通透性的调控作用及机制。方法:(1)将大鼠麻醉,取出腹主动脉后放入D-Hanks液中,去除血管周围脂肪等组织,把血管翻转,使血管腔面暴露在外,用胶原酶使血管内皮细胞离散下来,待细胞生长至80%~90%融合时,用胰蛋白酶消化后按1:2传代,3~5代细胞用于下一步实验;(2)将大鼠HIF-1α基因PCR扩增后,与GV230质粒载体连接,形成重组质粒,再将重组质粒转化大肠杆菌JM109,再提取并鉴定重组质粒,然后将重组质粒转染入大鼠血管内皮细胞,形成HIF-1α过表达细胞系;(3)设计和合成sh RNA,把sh RNA与质粒GV248连接,并转化大肠杆菌JM109,提取重组质粒并鉴定,再将重组质粒转染入大鼠血管内皮细胞,筛选出有效的重组质粒,然后再次转染大鼠血管内皮细胞,形成HIF-1α低表达细胞系;(4)Real-time PCR检测两组细胞HIF-1α、ET-1、ETA、ETB、MLCK、p-MLC、ZO-1相关m RNA水平;(5)Western blot检测两组细胞的HIF-1α、ET-1、ETA、ETB、MLCK、p-MLC、ZO-1蛋白水平。(6)Real-time PCR结果分析采用2-△△Ct进行分析,统计分析采用Graph Pad Prism 5.0软件进行;Western blot结果采用Quantity one灰度分析软件进行分析,所有数据以“均数±标准差(x±s)”表示。结果:(1)HIF-1α过表达时HIF-1α、ET-1、ETA、ETB、MLCK、p-MLC的m RNA水平均升高(P<0.05);ZO-1 m RNA水平降低(P<0.05);(2)HIF-1α过表达时HIF-1α、ET-1、ETA、ETB、MLCK、p-MLC的蛋白水平均升高(P<0.05);ZO-1蛋白水平降低(P<0.05)(3)HIF-1α低表达时HIF-1α、ET-1、ETA、ETB、MLCK、p-MLC的m RNA水平均降低(P<0.05);ZO-1 m RNA水平升高(P<0.05)(4)HIF-1α低表达时HIF-1α、ET-1、ETA、ETB、MLCK、p-MLC的蛋白水平均降低(P<0.05);ZO-1蛋白水平升高。结论:通过细胞培养、RAN过表达及干扰技术,成功建立HIF-1α过表达及低表达细胞系,分别从m RNA及蛋白质水平表明,在HIF-1α过表达时能上调ET-1、ETA、ETB、p-MLC、MLCK的表达而下调ZO-1的表达;在HIF-1α低表达时能下调ET-1、ETA、ETB、p-MLC、MLCK的表达而上调ZO-1的表达。HIF-1通过对ET-1、ETA、ETB、p-MLC、MLCK的调节作用而影响血管内皮细胞的通透性。
李阳[10]2009年在《Rho激酶在肠缺血再灌注肺损伤中的作用及法舒地儿预处理的保护研究》文中研究说明背景:肠缺血再灌注(intestine ischemia reperfusion, IIR)损伤是临床外科常见的组织器官损伤之一,不仅见于肠梗阻、肠系膜动脉栓塞等急腹症,更是严重创伤、烧伤后休克复苏中出现的病理过程,其可导致肠上皮细胞死亡,肠黏膜屏障破坏,肠通透性增加,使内毒素吸收增加及细菌移位至体循环,进而导致大量相关介质和细胞因子的释放,导致远隔器官的损伤,甚至全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[1,2]。其中以肺损伤所致的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)尤为突出,病死率亦很高。Rho激酶(Rho相关卷曲螺旋形成蛋白的激酶)是小G蛋白Rho下游重要的靶效应分子,参与平滑肌收缩,细胞迁徙等多种生理功能,同时研究发现Rho激酶参与机体的炎症反应。因此Rho激酶的激活可能在肺损伤的发生发展中起重要作用。盐酸法舒地儿(Hydrochloride Fasudil, HF):六氢-1-(5-磺酰基啉)-1(H) -1,4-二氮杂卓。HF是一种蛋白酶抑制剂,通过抑制Rho激酶从而抑制炎细胞的迁徙和浸润,减少炎症介质的产生;增加清除氧自由基及抗氧化的能力;增加eNOS的表达,提高eNOS的活性,增加NO的产量,在IIR过程中可能重要发挥保护作用。目的:探讨Rho激酶在IIR所致肺损伤机制中的作用及法舒地儿预处理处理对IIR肺损伤的保护作用,并为为法舒地儿的临床应用提供实验依据。方法:将健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、HF预处理高剂量组(15mg/kg)及HF预处理低剂量组(7.5mg/kg)。用无创小血管夹夹闭肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA)1h、再灌注2h,建立肠缺血再灌注损伤模型。术前60min,HF预处理组注射盐酸法舒地儿;正常对照组仅行剖腹术及SMA分离术,并给予等剂量生理盐水。再灌注结束,取血、肺及肠组织。光镜下观察病理石蜡切片肺、肠组织形态学改变,测定肺、小肠组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力和髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活力,检测血清中肌酸激酶-B(creatine kinase-B, CK-B)水平,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor-α, TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)的水平,通过Western-blotting检测肺、小肠组织中eNOS和P-Moesin蛋白的表达情况。结果:IIR后,1)与对照组相比,模型组组织学形态见小肠及肺损伤较严重,血清中CK-B,TNF-α以及IL-6水平升高(P<0.01,P<0.01),小肠和肺组织中MPO活性显着升高而SOD活性显着降低,(P<0.01,P< 0.01),同时小肠和肺组织中组织中eNOS表达明显减弱,而P-Moesin表达增强。2)HF预处理后与模型组相比组织学形态见肠,肺损伤有所减轻,肺泡灌洗液蛋白含量有所减低(P<0.01),血清中CK-B,TNF-α以及IL-6水平有所降低,MPO活性明显下降(P<0.01),SOD活性明显升高(P< 0.01),eNOS表达增高(P<0.01),p-Moesin表达减弱(P<0.01)。结论:1)小肠缺血再灌注可以导致严重的肺损伤。2)肠缺血再灌注肺损伤机制复杂,其发生和发展与Rho激酶的激活有关。3)HF预处理对肠缺血再灌注导致的肺损伤有明显的保护作用,这种保护作用与Rho激酶的抑制有关。
参考文献：
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[2]. p38激酶/Caldesmon途径介导烧伤血清诱导的血管通透性增加及其机制研究[D]. 褚志刚. 第叁军医大学. 2007
[3]. Rho激酶抑制剂Y - 2 76 32部分预防烧伤血清诱导的内皮屏障功能损害[J]. 郑惠珍, 黄巧冰, 赵克森. 中国病理生理杂志. 2004
[4]. 缺氧诱导因子-1α介导的ROCK通路活化在缺氧后血管内皮高通透性发生中的作用[D]. 刘琛. 第叁军医大学. 2010
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[6]. 缺氧诱导因子1在严重烧伤早期血管通透性调控中的作用[D]. 戚华兵. 第叁军医大学. 2006
[7]. 参麦、血必净对严重烫伤家兔早期ET-1、NO及TNF-α影响的实验研究[D]. 陈银兵. 扬州大学. 2011
[8]. 肌球蛋白轻链激酶介导的肌球蛋白轻链磷酸化在严重烧伤早期肠粘膜屏障损害中的作用[D]. 陈传莉. 第叁军医大学. 2009
[9]. HIF-1/ET-1途径对大鼠血管内皮细胞通透性的调控作用及机制[D]. 台运成. 安徽医科大学. 2016
[10]. Rho激酶在肠缺血再灌注肺损伤中的作用及法舒地儿预处理的保护研究[D]. 李阳. 大连医科大学. 2009