张明刚, 王建莉, 修方明, 李永梅, 安华章[1]2004年在《肿瘤组织来源的exosomes体内外抑制T细胞免疫反应的研究》文中认为背景:肿瘤细胞能够分泌一组直径约30~90上nm的膜性囊泡,称之为exosomes。Exosomes的生物学功能还不十分清楚,根据现有的资料,它们可能与下列生理过程有关:1)丢弃细胞内的废物(如网织红细胞在成熟过程中丢弃TfR),2)作为细胞间细胞膜交换的中介或者在细胞间传递信号,3)exosomes可能与逆转录病毒的体内传播有关,4)exosomes可以作为APC或疫苗来诱导抗原特异性免疫应答反应。通过树突状细胞(DC)的
张明刚[2]2004年在《肿瘤组织来源的exosomes体内外抑制T细胞免疫反应的研究》文中研究表明Burnet和Thomas首先提出免疫监视功能，即免疫系统能够发现并抑制肿瘤的生长和发展。但是肿瘤往往能够冲破这种免疫系统的监视而发生免疫逃逸而生长起来。关于肿瘤免疫逃逸的机制的研究已有很多报道，总结起来大致分为两方面：1)肿瘤诱导荷瘤机体免疫系统功能紊乱；2)肿瘤细胞自身细胞变异来主动地逃避免疫系统的攻击。这些肿瘤的变异体或者丢失一些对于免疫应答起重要作用的表型(例如MHC Ⅰ分子)，或者表达一些蛋白质来加速肿瘤的生长并抑制肿瘤的凋亡。 参与肿瘤免疫的免疫细胞主要有T细胞，NK细胞和抗原提呈细胞(APC)。已有的报道表明，与肿瘤细胞相互作用可以抑制这些免疫细胞包括树突状细胞(DC)的免疫激发功能，并且在肿瘤的局部抑制DC细胞的功能，并使其数量减少。肿瘤局部分泌的抑制性因子能够抑制B细胞，甚至是T细胞的功能。人们已经从肿瘤的培养上清中检测出了多种免疫抑制性因子(如TGF-β，IL-10，VEGF)，它们可能与肿瘤的免疫逃避有关。 Exosomes是直径在30-90nm之间的一类膜性囊泡，首先在细胞系的培养上清中被发现，并由网织红细胞的培养上清中纯化而得到命名。现在发现，大多数细胞如网织红细胞、B细胞、T细胞、DC、肥大细胞和一些肿瘤细胞等等能够分泌Exosomes。但是对于Exosomes的生物学功能仍然不十分清楚。目前的研究表明，Exosomes的生物学功能可能与以下生命现象有关：1)丢弃细胞内的废物(如网织红细胞在成熟过程中丢弃TfR)，2)作为细胞间细胞膜交换的中介或者在细胞间传递信号，3)Exosomes还可以作为APC或疫苗来诱导抗原特异性免疫应答反应，4)Exosomes可能与逆转录病毒的感染有关。Exosomes是否具有其它新的功能?肿瘤来源的Exosomes除了能够诱导抗肿瘤免疫应答反应外，是否与肿瘤免疫逃逸有关，其功能与其不同的组织和细胞来源是否有关?我们通过本实验在此方面进行了探索。 1998年，法国学者Zitvogel L等用DC来源的Exosomes治疗肿瘤，发现能够消除已经发生的肿瘤。自此，科学家们开始重视Exosomes并致力于Exosomes作为肿瘤疫苗的研究。这些研究大多以DC来源的或者肿瘤细胞冲击过的DC来源的ExoS。mes为研究对象。但是，也有文献提示ExosomeS也可能在免疫耐受中起重要作用。例如，人小肠上皮细胞(IEC)分泌的ExoS0mes中，基础状态下即有MHC工类分子、CD26、CD63分子的表达，在炎症状态下，MHCH分子表达大量增加。有人对大鼠IEC分泌的ExosomeS的实验提示，Exosomes能够诱导口服耐受，而且这种耐受状态还可以通过ExosomeS过继转移。尽管如此，另外学者通过对小鼠工EC的研究提出相反的结论，即小鼠工EC分泌的ExosomeS可以诱导强烈的免疫应答反应。那么，到底是各自的实验体系的问题呢还是物种的不同所致呢，目前尚不得而知。 最近，有人用HLA一G阳性的肿瘤细胞株培养分离ExosomeS，发现该种ExosomeS有HLA一G存在，并且用HLA一GI CDNA转染不表达HLA一G的细胞系后分泌的ExosomeS同样有HLA一G的表达。我们已经知道，HLA一G与免疫耐受有关，因而携带有HLA一G的ExoS0mes可能提供免疫耐受的调节信号。有趣的是，有人用供者BMDC来源的ExosomeS预处理受者，然后进行小鼠的同种异体心脏移植，发现能够明显地延长移植物的存活时间并明显地减轻白细胞的浸润，进一步提示ExoS0mes可能会参与免疫耐受的形成。 根据以上资料，我们提出一个假说:肿瘤组织分泌的ExosomeS可能会参与肿瘤的免疫逃逸。为此，我们以一种C57BL/6来源的3LL Lewis肺癌细胞系建立模型，用3LL细胞系和3LL肿瘤组织分泌的ExosomeS进行了体内和体外的功能实验，并从T细胞免疫应答的角度初步探讨了其作用的机制。模型的建立和Exosomes的分离与纯化 我们利用一种C57BL/6小鼠的3LL LewiS肺癌细胞系作模型，将3LL细胞皮下注射到C57BL/6小鼠，待3周时无菌取出肿瘤组织，剪碎后用DMEM加10%的血清在37℃，5%的CZO中培养，30小时后收集培养上清。然后用梯度离心的方法纯化分离ExoS0mes。3LLLewiS肺癌细胞系的细胞在培养30小时后也取培养上清分离纯化Ex0SomeS。为了使所分离的ExosomeS中尽量减少杂蛋白和小牛血清中的Exosomes的影响，我们在培养之前，先把小牛血清用100，0009预离心过夜，并且细胞培养上清超离分离到的沉淀物用PBS反复洗涤离心两次，然后再用蔗糖进行密度梯度离心，收集1.12一1.199/ml之间的成分，以尽量使之纯化。Exosomes的形态学电镜观察 我们将蔗糖分离后的沉淀物用电镜进行分析，可见所得的沉淀物为30一gonm的膜性囊泡构成，这些膜性囊泡都呈碟型。在细胞系来源的ExoS0mes和肿瘤组织来源的ExosomeS之间的电镜结构没有观察到明显的区别。肿瘤组织来源的Exosomes对T细胞增殖反应的体外抑制作用 T细胞是构成肿瘤免疫的主要效应细胞，研制肿瘤疫苗以激发免疫功能或者肿瘤细胞逃逸免疫功能的监视都直接或者间接地与T细胞免疫功能有关，因此本研究首先着眼于肿瘤组织来源的ExosomeS与T细胞功能的关系。 1.肿瘤组织来源的Exosomes抑制丝裂原诱导的T细胞的增殖反
赵丽华[3]2008年在《树突状细胞分泌的exosomes诱导免疫耐受功能的初步研究》文中研究表明树突状细胞(dendritic cells,DCs)是唯一可以诱导初始型T细胞(naive T cell)活化的专职抗原递呈细胞(APC),未成熟DCs(iDCs)能够维持外周耐受,而成熟DCs(mDCs)能够刺激效应性T细胞。DCs能分泌一种直径约为30-100 nm的微小膜囊泡体(exosomes),称Dex,表达一些与DCs功能相关的分子,如MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子、共刺激分子B7以及黏附分子CD54等,Dex的功能取决于其来源细胞类型及其成熟的状态。为了探讨树突状细胞(DCs)分泌的exosomes(Dex)诱导T细胞免疫耐受作用,研究供体Dex降低同种异体移植排斥的可能性。体外诱导和培养正常人外周血单个核细胞来源的iDCs,并负载其自身冻融抗原,用lipopolysaccharide(LPS)促其成熟,流式检测iDCs和mDCs的表型;采用超速离心和超滤的方法分离纯化iDCs分泌的Dex(iDex)和mDCs分泌的Dex(mDex);以混合淋巴细胞反应(MLR)作为同种异体移植体外模型,CCK-8法比较iDex和mDex的生物学功能。结果显示,异源的iDex在iDCs存在时能够抑制MLR中T细胞增殖反应,而异源的mDex在mDCs存在时则增强MLR中T细胞增殖反应。因此mDCs来源的mDex,能够活化T细胞产生免疫应答,在抗肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景;相反iDCs来源的iDex可以诱导外周免疫耐受,在同种异体移植耐受中起重要作用,将成为防止移植排斥反应以及治疗自身免疫性疾病的一种新方法。同时,为了进一步研究调节性DCs分泌的rDex诱导的免疫耐受作用途径和分子机制,为抗肿瘤,预防移植排斥,治疗自身免疫性疾病等临床应用提供理论基础,用TGF-β1联合IL-10诱导调节性DCs,流式细胞仪检测调节性DCs和正常DCs的表面标志及吞噬功能,并用Bradford法检测它们分泌Dex的能力;Western-Blot方法检测并比较iDCs分泌的Dex(iDex)与调节性DCs分泌的Dex(rDex)表达的相关分子;通过CCK-8法分析异源iDex和rDex在MLR中抑制T细胞增殖作用的效果,比较rDex与iDex诱导免疫耐受的能力。结果显示,TGF-β1和IL-10可下调DCs表面的共刺激分子CD80、CD83、CD86的表达,并诱导调节性DCs分泌更多的rDex;rDex抑制T细胞增殖作用显着强于iDex;rDex表达更多的FasL,提示TGF-β1和IL-10诱导的调节性DCs分泌的rDex在免疫耐受中发挥重要作用,有望应用于同种异体移植抗免疫排斥反应。
周猛[4]2015年在《肿瘤细胞释放自噬小体诱导IL-10~+B细胞的产生及其功能的机制研究》文中提出我们前期实验发现,肿瘤细胞释放的自噬小体(Tumor-released autophagosomes, TRAP)可被B细胞所摄取,诱导B细胞活化并促进B细胞分泌抗体和细胞因子,特别是分泌高水平的IL-10。而可分泌高水平的IL-10,是Bregs的重要特征。但是肿瘤细胞释放的自噬小体是否可诱导B细胞进一步分化为IL-10+B细胞或者Bregs,目前尚不清楚。目的：研究肿瘤细胞释放的自噬小体(TRAP)能否进一步诱导B细胞分化为IL-10+B细胞；探讨TRAP诱导产生的IL-10+B细胞是否有免疫抑制功能；探讨TRAP诱导IL-10+B细胞的物质基础及机制：研究肿瘤患者体内是否含有自噬小体以及是否可诱导几-10+B细胞的产生。方法：1.采用]TRAP体外刺激野生型小鼠脾细胞,同时用LPS刺激脾细胞作为对照,72h后收获细胞及细胞培养上清,流式细胞术检测IL-10+B细胞的比例变化；ELISA法检测细胞培养上清中IL-10的含量。磁珠分选小鼠B细胞,与不用浓度的TRAP 37℃共孵育72h；或与E.G7-OVA细胞来源的TRAP, E.G7-OVA细胞裂解液或LPS共孵育72h；或分别与肿瘤培养上清,等体积去除TRAP的肿瘤培养上清,以及等体积培养上清所获TRAP共孵育72h,收集培养上清,ELISA法测检测培养上清中IL-10的分泌水平。分选小鼠B细胞,在体外与TRAP共孵育72h,流式细胞术检测IL-10+B及IL-10-B细胞表面分子表达的差异(CD5、CD1d、CD21、CD23、CD43、CD86、MHC Ⅱ)。TRAP经尾静脉注射小鼠(同时用PBS注射组作为对照),第7天取脾脏细胞,通过计数并结合流式细胞术检测TRAP体内诱导产生IL-10+B细胞的比例及其表面CD5、CD1d的表达。2.分选出WT C57BL/6小鼠的CD4+T和CD8+T细胞并用CFSE标记,放入有抗CD3抗体预包被的孔板中并加入抗CD28抗体以刺激T细胞增殖。同时,在抗CD3抗体/CD28诱导的T细胞增殖体系中加入TRAP诱导的WTB细胞或IL-10-/-B细胞共培养或用Transwell小室隔开培养,流式细胞术检测T细胞增殖情况。分离OT-1小鼠脾细胞并用OVA257-264肽刺激其增殖,同时与E.G7-OVA(OVA+)或EL4(OVA)细胞来源的TRAP诱导的B细胞共孵育,96h后流式细胞术检测T细胞增殖情况。WT C57BL/6小鼠于第0天皮下接种E.G7-OVA肿瘤细胞,小鼠荷瘤成功后,于第4、7、10天DC/OVA疫苗皮下免疫荷瘤小鼠,并于第5、8天过继转移OVA+TRAP或OVA-TRAP诱导的B细胞、并以单独B细胞作为对照,定期测量实体瘤大小及观察荷瘤小鼠的存活情况；末次免疫后第七天,取各组小鼠的脾脏细胞并用OVA蛋白再刺激24h,流式细胞术检测脾脏细胞中IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例；72小时后收获细胞培养上清,ELISA检测细胞培养上清中IFN-y的水平。3.分选WT、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-、-小鼠B细胞,并用TRAP刺激不同时间(0h,1h),流式细胞术检测INF-κB通路中p65蛋白磷酸化情况；TRAP刺激上述B细胞72h后,收集细胞并检测IL-10+B细胞的比例。CFSE标记的WT C57BL/6小鼠CD4+T和CD8+T细胞分别与与TRAP诱导的WT、TLR2-/-、TLR4-/-和MyD88-/-小鼠B细胞共同放入有抗CD3抗体预包被的孔板培养,流式细胞术检测T细胞增殖情况。同时,在抗CD3抗体/CD28诱导的T细胞增殖体系中加入TRAP诱导的B细胞,共孵育72-96h后流式细胞术检测T细胞增殖情况。WT小鼠B细胞用不同浓度的NF-κB活化抑制剂预处理后,与TRAP共孵育72h,流式细胞术检测IL-10+B细胞的比例变化；ELISA法检测细胞培养上清中IL-10的含量。4.采用HMGB1抗体封闭TRAP中的HMGB1抗原表位,随后与磁珠分选的小鼠B细胞共孵育,流式细胞术检测B细胞IL-10的表达,探讨HMGB1对TRAP诱导B细胞分化为IL-10+B细胞的影响。建立稳定表达HMGB1-shRNA的细胞株,提取TRAP并与分选的B细胞共孵育。72h后收获细胞培养上清,ELISA法检测上清中IL-10的分泌量。分选的B细胞与未破碎的TRAP或等量超声破碎后的TRAP共孵育72h,ELISA法检测上清中IL-10的分泌量。5.收集14例肿瘤患者胸腹水,通过高速离心的方法获取提取物；并通过流式细胞术、Western blots、电镜等方法鉴定提取物是否含自噬小体以及其表面HMGB1的表达量。分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),并与14例肿瘤患者胸腹水来源自噬小体共孵育,流式细胞术检测PBMC中IL-10+B细胞比例变化；并分析胸腹水来源自噬小体中HMGB1的含量与诱导产生的IL-10+B细胞是否具有相关性。纯化健康献血者外周血CD4+T、CD8+T细胞并用CFSE标记,放入有抗CD3抗体预包被的孔板中刺激T细胞增殖。同时,在抗CD3抗体诱导的T细胞增殖体系中加入自噬小体诱导的B细胞,共孵育72-96h后流式细胞术检测T细胞增殖情况。结果：1.与肿瘤细胞裂解液刺激组相比,TRAP体外诱导小鼠B细胞分化为IL-10+B细胞的比例显着增高。肿瘤细胞培养上清也可刺激B细胞分泌IL-10,并与等量培养上清中所获TRAP的刺激效果没有明显差别；但去除TRAP的肿瘤细胞培养上清刺激B细胞分泌IL-10明显下降。TRAP体外诱导产生的IL-10+B细胞的表型特征为：CD5+CD1d+MHC-Ⅱmid。TRAP体内亦可诱导IL-10+B细胞的表达,且相较于IL-10-B细胞,CD5+CDldhigh细胞比例显着升高(36.7%vs 11%)。2.抗鼠CD3/CD28单抗能够诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖,CFSE的衰减率分别为65%和81%,而加入TRAP诱导IL-10+B细胞后,CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE的衰减率分别下降为20%和14%；进一步采用Transwell小室培养方法将TRAP诱导的B细胞和T细胞隔开,结果发现：CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE衰减率分别为5%和12%,而且与TRAP诱导的B细胞和T细胞混合培养导致的CD4+T细胞和CD8+T细胞CFSE衰减率下降(4%和10%)相比较,没有明显差异。同时发现,来源于IL-10-/-小鼠B细胞经TRAP诱导后,没有影响CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖(CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE衰减率分别为45%和71%)。在OT-1 CD8+T细胞增殖体系中,OVA257-264肽可刺激OT-1 CD8+T细胞增殖(CD8+T细胞的CFSE衰减率为60.1%)；加入OVA+TRAP或OVA-TRAP诱导B细胞均可抑制CD8+T细胞的增殖(CD8+T细胞的CFSE衰减率分别为9.4%和12.3%)。在C57BL/6小鼠的E.G7-OVA皮下移植瘤模型中,与未免疫组相比,DC/OVA免疫后IFN-γ+CD4+T细胞(0.8% vs 2.9%)和IFN-γ+CD8+T细胞(1.1% vs 3.2%)的比例显着升高；而过继输注OVA+TRAP诱导的B细胞则导致IFN-γ+CD4+T细胞(2.9% vs 0.9%)和IFN-y+CD8+T细胞(3.2% vs 2.0%)的比例较DC/OVA免疫组显着下降；与过继转移OVA+TRAP诱导的B细胞效果相似,过继OVA-TRAP诱导的B细胞亦导致IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞的比例较DC/OVA免疫组显着下降(0.6% vs 2.9%; 1.6% vs 3.2%),且两种B细胞效果无明显差异(0.9% vs 0.6%; 2.0% vs 1.6%)。未免疫组荷瘤小鼠中位生存时间为20天,DC/OVA免疫组小鼠和未刺激B细胞组的中位生存时间分别为31天和29天,但过继转移OVA+TRAP或OVA-TRAP诱导B细胞组的中位生存时间分别为22天和23天,明显短于未刺激B细胞组。3.与未刺激组相比(IL-10+B细胞比例：0.8%),TRAP诱导WT及TLR4-/-小鼠B细胞分化为IL-10+B细胞的比例显着升高(2.1%；2.7%),而TLR2-/-、 MyD88-/-小鼠IL-10+B细胞比例无明显变化(1.0%；0.9%)。与未处理B细胞组相比,TRAP诱导NF-κB活化抑制剂预处理的B细胞分化为IL-10+B比例显着降低,且NF-κB活化抑制剂浓度越高,TRAP诱导产生的IL-10+B细胞比例越低(1.1% vs 1.6%; 0.8% vs 1.6%; 0.7% vs 1.6%)。TRAP与WT或TLR4-/-B细胞孵育后可引起下游NF-kB信号通路中p65的磷酸化,而TLR2-/-、MyD88-/-B细胞中未见p65磷酸化。抗鼠CD3/CD28单抗能够诱导CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖(CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE的衰减率分别为65%和81%)；加入TRAP诱导的WT B细胞后,CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE的衰减率分别降至20%和14%；加入TRAP诱导的TLR4-/-B细胞后,CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE的衰减率为24%和23%;而加入TRAP诱导的TLR2-/-B或MyD88-/-B细胞没有影响CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖(75%和71%：87%和81%)；4.流式细胞术检测发现92.7%的TRAP表面表达HMGB1。与未预处理TRAP相比,HMGB1封闭抗体预处理TRAP诱导B细胞分化为IL-10+B的比例显着降低(0.8% vs 2.2%)；而同型对照抗体处理TRAP对诱导IL-10+B细胞的产生无影响(2.0% vs 2.2%)。与WT B16-F10来源的TRAP及转染Control-shRNAB16-F10来源的TRAP相比,转染HMGB1-shRNA B16-F10来源的TRAP刺激B细胞分泌IL-10的水平显着降低。膜结构完整的TRAP可诱导B细胞分泌高水平的IL-10,而超声破碎后的TRAP则无此能力。5.流式细胞术检测发现82%的提取物表面表达LC3。与HepG2细胞来源的TRAP相似,Western blot检测发现提取物中LC3Ⅱ的表达量要高于LC3 Ⅰ。电镜观察提取物形态,发现提取物中含有大量具有双层膜结构的自噬小体,大小不一,平均直径在200-1000nm不等。14例肿瘤患者胸腹水来源自噬小体(MedAP)均表达HMGB1,且表达水平参差不齐。与HepG2细胞来源的TRAP相似,14例MedAP均可诱导IL-10+B细胞的产生；用Spearman等级相关分析对MedAP中HMGB1的含量与诱导产生的IL-10+B细胞的比例进行相关性分析,结果证实MedAP诱导4例健康献血者PBMC产生IL-10+B细胞的比例均与MedAP中HMGB1的含量成正相关(相关系数分别为R=0.73,P<0.01; R=0.68, P<0.01; R=0.67, P<0.05; R=0.87, P<0.0001)。抗人CD3单抗能够刺激CD4+T和CD8+T细胞增殖,CFSE衰减率分别为49.9%和61.7%;加入MedAP诱导的B细胞后CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE衰减率分别降至27.1%和43.8%,而加入未刺激的B细胞未影响CD4+T、CD8+T细胞的增殖(CD4+T细胞和CD8+T细胞的CFSE衰减率分别为53.8%和62.5%)。结论：1.肿瘤细胞可自发释放自噬小体(TRAP)到细胞外；TRAP体内、体外均可诱导B细胞分化为分泌高水平IL-10、具有CD1d+CD5+细胞表型特征的调节性B细胞。2. TRAP诱导IL-10+B细胞主要通过IL-10抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖、而不依赖细胞间相互接触,且以抗原非特异性的方式发挥抑制性功能；过继输入TRAP诱导IL-10+B细胞能以抗原非特异性方式抑制DC疫苗诱导的T细胞免疫应答及其介导的抗肿瘤作用。3. TRAP诱导IL-10+B细胞及其抑制T细胞增殖依赖TLR2-MyD88-NF-κB信号通路。TRAP膜结构的完整性及其携带的内源性分子佐剂一膜结合型HMGB1对TRAP诱导IL-10+B细胞的产生至关重要。4.肿瘤患者胸腹水中存在自噬小体(MedAP)。不同肿瘤患者来源MedAP均表达HMGB1,其表达水平参差不齐。MedAP能诱导人IL-10+B细胞的产生,且与MedAP中HMGB1的含量成正相关。MedAP诱导IL-10+B细胞可抑制人CD4+和CD8+T细胞的增殖。
朱延亮[5]2017年在《Exosomes作为药物载体的功能化研究》文中研究指明随着分子生物学以及基因组学研究的深入,越来越多疾病的发生被发现与基因异常密切相关,或者其发生过程伴有基因表达异常现象,因此探讨如何从基因层面治疗疾病已经成为研究热点。尤其是最近十多年来包括微小RNA(microRNAs)、siRNA(Small interfering RNA)以及长链非编码 RNA(long noncodingRNA,lncRNA)的发现,更是加速了基因治疗的发展。由于基因治疗所要递送的DNA、RNA或类寡核苷酸分子在体内极不稳定,很容易在未到达病变细胞之前被核酸酶破坏或降解,很难到达靶组织和细胞发挥作用,因此高效、安全的基因递送载体成为了基因治疗的关键因素。目前常用的基因载体主要包括病毒载体和非病毒载体两大类,病毒类载体的优势是具有较好的基因转染能力,缺点是其毒性、免疫源性、致癌作用和难以大规模生产等问题难以克服;而非病毒载体同样存在免疫原性的问题。因此构建具有体内外转染效率高、特异靶向性强和生物安全性好的基因载体显得十分迫切。外泌体(exosomes)是一种由细胞向外分泌的膜性囊泡,其中含有包括核酸、蛋白因子在内的多种生物活性物质,目前已经证实exosomes能够将这些来源于亲代细胞中的生物学活性物质转导至受体细胞,影响受体细胞的生物学行为,扮演着细胞间信号传导载体的角色。这其中最引人注目的就是exosomes中含有丰富的miRNA,这些miRNA借助exosomes从供体细胞进入受体细胞,通过调控受体细胞中靶基因的表达,影响受体细胞的生物学行为。在生物体内exosomes是一种天然的核酸和细胞因子的载体,受此启发,近年来,陆续有研究者开展exosomes作为外源药物载体的研究。本论文围绕这一领域,针对exosomes共载化疗药物和基因药物用于肿瘤的协同治疗、exosomes如何高效的载入外源基因药物等方面展开研究,取得如下创新性研究成果:1、开展了 exosomes同时作为基因药物和化疗药物共载体治疗肿瘤的研究。我们首先通过基因重组技术构建了能够展示于exosomes表面、同时具有靶向Her2作用的融合蛋白(tar-Her2)表达质粒,之后通过HEK293T细胞过表达该融合蛋白,成功获得表面含有靶向Her2的重组蛋白的exosomes;随后,通过电穿孔法成功将miR-21 inhibitor和5-Fu导入exosomes中,实现了 exosomes共载化疗药物和基因药物。之后,我们开展了 Tar-Her2-EXO/miR-21inhibitor/5-FU的体外和体内的抗肿瘤活性和靶向性研究。结果显示,Tar-Her2-EXO/miR-21 inhibitor/5-FU在体外及体内对Her2高表达的HCT116细胞及其皮下移植瘤均具有较好的靶向作用。同时,我们还发现Tar-Her2-EXO/miR-21 inhibitor/5-FU在体外和体内对肿瘤的抑制作用具有抑制作用,并且显着强于Tar-Her2-EXO/miR-21 inhibitor或Tar-Her2-EXO/5-FU,表明exosomes作为基因药物和化疗药物共载体,有利于发挥两种药物的协同作用,提高肿瘤治疗的疗效。2、建立了通过生物学方法获得含有功能性小RNA的exosomes的方法。我们首先构建了 miR-21、siR-artificiality以及miR-21 decoy慢病毒表达载体,之后基于HEK293T细胞建立了上述叁种功能性小RNA的稳定表达细胞株,收集并分析了叁种细胞来源的exosomes中相应过表达的功能RNA的水平,结果显示细胞中过表达的功能性小RNA均能够进入exosomes中。之后,我们又通过双荧光素酶报告基因技术、EGFP报告基因技术等考察了含有功能小RNA的exosomes对受体细胞中靶基因的影响,结果显示这些带有功能性小RNA的exosomes进入受体细胞后,能够对受体细胞中靶基因的表达,或相应miRNA的功能产生影响。3、探讨了通过生物工程方法获得含有siR-PLK1的exosomes(EXO-siR-PLK1),并在体外探讨EXO-siR-PLK1的抗肿瘤作用。我们首先构建了能够表达siR-PLK1和PLK1 silence mutation慢病毒载体,在此基础上建立了过表达siR-PLK1的细胞株,并获取了其来源的exosomes(EXO-siR-PLK1)。使用EXO-siR-PLK1处理BT474细胞后,BT474细胞中PLK1的表达被显着抑制。我们还考察了 EXO-siR-PLK1对BT474细胞周期及增殖的影响,结果显示EXO-siR-PLK1能够破坏BT474细胞的有丝分裂过程,细胞周期被阻滞于G2/M期,同时EXO-siR-PLK1对BT474增殖的抑制作用具有浓度依赖性。综上所述,本论文的研究丰富了 exosomes作为基因药物及小分子药物载体的方法。
陈仕友[6]2015年在《枸杞多糖联合干扰素a2b抑制小鼠肾癌细胞生长及其机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分枸杞多糖联合干扰素a2b抑制小鼠肾癌细胞生长的体外实验目的：探讨枸杞多糖、干扰素a2b在体外是否能抑制小鼠肾癌Renca细胞的生长,明确枸杞多糖联合干扰素a2b治疗Renca细胞的最佳浓度和作用时间,探索其潜在的作用机制。方法：1.MTT法检测不同浓度的枸杞多糖(50,100,200和400 μg/ml)和干扰素a2b(1,000,2,000,4,000,和8,000 IU/ml)作用Renca细胞24h、48h和72h对细胞活力的影响。2.MTT法检最佳浓度枸杞多糖(200μg/ml)联合干扰素a2b (4,000 IU/ml)作用Renca细胞24h、48h和72h对细胞活力的影响,筛选枸杞多糖联合干扰素a2b最佳的作用时间。3.流式细胞术检测枸杞多糖联合干扰素a2b作用48h对Renca细胞凋亡的影响。4.流式细胞术检测枸杞多糖联合干扰素a2b作用48h对Renca细胞细胞周期分布的影响。5. Western blot检测枸杞多糖联合干扰素a2b作用48h对Renca细胞蛋白Bcl-2、Bax、cyclin D1和c-Myc表达的影响。结果：1.MTT结果显示：枸杞多糖(浓度为200μg/ml)和干扰素a2b(浓度为4,000IU/ml)单独作用48h对Renca田胞活力影响最大,在此浓度和时间范围以内,枸杞多糖、干扰素a2b呈剂量和时间依赖性地降低Renca细胞活力。2.枸杞多糖(浓度为200μg/ml)联合扰素a2b(浓度为4,000IU/ml)作用48h降低Renca细胞活力最明显,在48h内呈时间依赖性地降低Renca细胞活力。3.与对照组、枸杞多糖和干扰素α2 b单独运用诱导Renca细胞凋亡的百分比(分别为5.42%+0.86%,34.21%±1.43%,23.15%±1.56%)比较,枸杞多糖联合干扰素α2 b(56.21%±1.32%)诱导Renca细胞凋亡的比例显着增加,且主要为晚期凋亡,差异具有统计学意义P<0.01)。4.与对照组、枸杞多糖和干扰素α2 b单独运用诱导Renca细胞阻滞于G0/G1期的百分比(分别为35.44%+0.97%,57.09%+0.29%,47.61%±0.36%)比较,枸杞多糖联合干扰素α2b(67.81%±0.50%)诱导Renca细胞阻滞于G0/G1期的比例显着增加,差异具有统计学意义(P<0.05),且构杞多糖联合干扰素a2b诱导Renca细胞阻滞于S期的百分比(21.10%±0.46%)显着减少(P<0.01)。5.与对照组比较,枸杞多糖、干扰素α2b单独和联合运用均能显着增加Renca细胞促凋亡蛋白Bax表达(P<0.01),显着降低降低抑凋亡蛋白Bcl-2和细胞增殖蛋白c-Myc表达(P<0.01)；与干扰素a2b单独运用组比较,枸杞多糖联合干扰素a2b更显着下调蛋白Bcl-2、 cyclin D1和c-Myc表达(P<0.01),上调蛋白Bax表达(P)<0.01)；而杞多糖、干扰素α2b单独运用组在降低蛋白Bcl-2和增加蛋白Bax表达无显着差异(P>0.05)；单独运用枸杞多糖组较单独运用干扰素a2b组降低降低蛋白Bcl-2、cyclin D1和c-Myc表达更显着(P<0.05)。结论：1.枸杞多糖、干扰素a2b在体外均能降低肾癌Renca细胞活力,本次试验中最佳作用浓度分别为200μg/ml和4,000IU/ml,最佳作用时间为48h；枸杞多糖联合干扰素a2b作用Renca细胞48h降低细胞活力最明显。2.枸杞多糖联合干扰素a2b诱导肾癌Renca细胞凋亡,且主要为晚期凋亡；诱导Renca细胞阻滞在G0/G1期,减少S期细胞的百分比。3.枸杞多糖联合干扰素a2b诱导肾癌Renca细胞增殖蛋白c-Myc、抑凋亡蛋白Bcl-2和细胞周期调控蛋白cyclin D1表达下调,促进促凋亡蛋白Bax表达上调,促进Renca细胞凋亡,抑制其增殖。第二部分枸杞多糖联合干扰素a2b在体内抑制小鼠肾癌细胞的生长目的：探讨枸杞多糖联合干扰素a2b在体内是否能抑制肾癌Renca细胞生长方法：1.将36只6周龄雄性BALB/c小鼠每只左侧肋部皮下注射1.5×106Renca细胞悬液,建立肾癌移植瘤模型,每周监测各组小鼠体重、肿瘤体积2次。2.当移植瘤长到40-50mm3时,将36只BALB/c荷瘤小鼠随机分为4组(每组9只)：对照组、干扰素a2b组、枸杞多糖组、枸杞多糖联合干扰素a2b组。对照组予每只小鼠腹腔注射无菌PBS100μl,2次/周；无菌PBS 100μl灌胃,1次/天；干扰素a2b组予腹腔注射干扰素a2b 200 IU,2次/周；无菌PBS 100μl灌胃,1次/天；枸杞多糖组予腹腔注射无菌PBS 100μl,2次/周；枸杞多糖20μg灌胃,1次/天；枸杞多糖联合干扰素a2b组予腹腔注射干扰素a2b 200 IU/只,2次/周；枸杞多糖20μg灌胃,1次/日；连续2周,每周监测各组小鼠体重、肿瘤体积2次。3.枸杞多糖、干扰素a2b干预荷瘤小鼠2周后处理小鼠,切取移植瘤作HE染色以鉴定建模是否成功。4.免疫组织化学分析枸杞多糖联合干扰素a2b对荷瘤小鼠移植瘤中抑凋亡蛋白的的影响。结果：1.移植瘤HE染色显示：肿瘤组织中细胞大小不均,形态不一,排列紊乱；细胞核增大,核质比例失常,核深染,异常核分裂,说明成功建立小鼠肾癌移植瘤模型。2.与对照组、枸杞多糖组、干扰素a2b组比较,枸杞多糖联合干扰素a2b治疗能显着降低移植瘤的体积(P<0.01)和重量(P<0.01),而枸杞多糖、干扰素a2b单独运用组间移植瘤的体积和重量无显着变化(P>0.05)。3.免疫组织化学分析结果显示：取5个高倍视野,平均每个视野Bcl-2阳性肾癌细胞数量百分比,对照组为(67.9%±4.2%)、干扰素a2b组(68.7%±3.3%)、枸杞多糖组(66.1%±2.4%)、枸杞多糖联合干扰素α2b组(65.2%±1.9%),各组间抑凋亡蛋白Bcl-2阳性表达率无显着差异(P>0.05)。结论：1.枸杞多糖联合干扰素a2b在体内能抑制小鼠肾癌Renca细胞的生长。2.枸杞多糖联合干扰素a2b对肾癌荷瘤小鼠移植瘤抑凋亡蛋白Bcl-2表达的无明显影响。第叁部分枸杞多糖联合干扰素a2b抑制肾癌细胞分泌exosomes及其蛋白表达的体外实验目的：探讨枸杞多糖联合干扰素a2b在体外对肾癌Renca细胞分泌exosomes及其蛋白表达的影响方法：1.复温枸杞多糖联合干扰素a2b作用Renca细胞后收集的上清液。2.超滤加蔗糖重水密度梯度离心法提取Renca细胞上清液中exosomes。3.透射电镜鉴定枸杞多糖和干扰素a2b干预Renca细胞后exosomes形态及数量的变化4. Western blot检测枸杞多糖联合干扰素a2b对Renca细胞分泌exosomes及其蛋白HSP70和G250表达的影响。结果：1.枸杞多糖、干扰素a2b单独或联合处理Renca细胞后,透射电镜观察各组Renca细胞分泌的exosomes形态无显着变化(P>0.05)；而枸杞多糖联合干扰素a2b处理组分泌exosomes数量较对照组和单独处理组显着减少(P<0.05)。2.枸杞多糖联合干扰素a2b处理Renca细胞后分泌的exosomes蛋白HSP70、G250表达水平显着降低(P<0.05)。结论：1.枸杞多糖联合干扰素a2b在体外能减少肾癌Renca细胞分泌exosomes数量,分泌的exosomes形态无显着变化。2.枸杞多糖联合干扰素a2b能显着降低肾癌Renca细胞分泌的exosomes蛋白HSP70、G250的表达。第四部分枸杞多糖联合干扰素a2b在体内对肾癌荷瘤小鼠MDSCs、CD4/CD8T淋巴细胞比例的影响目的：探讨枸杞多糖联合干扰素a2b体内对肾癌荷瘤小鼠MDSCs、 CD4/CD8 T淋巴细胞比例的影响。方法：1.在第二部分研究中,枸杞多糖、干扰素a2b治疗荷瘤小鼠2周后处理各组小鼠,提取小鼠双侧股骨／胫骨骨髓细胞,流式细胞术检测各组小鼠骨髓中MDSCs比例。2.在第二部分研究中,枸杞多糖、干扰素a2b治疗荷瘤小鼠2周后处理各组小鼠,提取小鼠脾脏,流式细胞术检测各组小鼠脾脏CD4/CD8T淋巴细胞比例。结果：1.流式细胞术检测显示：与对照组MDSCs百分比(47.65%±0.25%)比较,干扰素组a2b(37.7%±0.50%)、枸杞多糖组(37.1%±0.41%)和枸杞多糖联合干扰素a2b组(30.1%±1.01%)显着减少荷瘤小鼠骨髓中MDSCs比例(P<0.05),以枸杞多糖联合干扰素a2b组减少更明显(P<0.01)；与枸杞多糖和干扰素a2b单独处理组比较,枸杞多糖联合干扰素a2b组MDSCs比例显着减少(P<0.05)；而枸杞多糖和干扰素a2b单独处理组间比较,MDSCs比例无显着差别(P>0.05)2.流式细胞术检测显示：与对照组CD4/CD8 T淋巴细胞比例(1.25%±0.12%)比较,干扰素a2b组(1.87%±0.14%)、枸杞多糖组(1.95%±0.21%)和枸杞多糖联合干扰素a2b组(2.21%±0.23%)均能显着升高荷瘤小鼠CD4/CD8 T淋巴细胞比例(P<0.05),以枸杞多糖联合干扰素a2b组增高更明显(P<0.01)。而枸杞多糖和干扰素a2b单独处理组间比较,CD4/CD8 T淋巴细胞比例增高不明显(P>0.05)。结论：1.枸杞多糖联合干扰素a2b在体内能降低肾癌荷瘤小鼠骨髓中MDSCs的比例,这可能是枸杞多糖联合干扰素a2b减少MDSCs的活化、增殖,减轻免疫抑制作用,进而抑制肾癌Renca细胞生长。2.杞多糖联合干扰素a2b在体内能增加荷瘤小鼠脾脏CD4/CD8 T淋巴细胞比例,这可能是枸杞多糖联合干扰素a2b增强机体及T淋巴细胞免疫功能,或提高免疫细胞对肾癌特异性抗原的敏感性,促进细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀灭作用,抑制肿瘤生长。第五部分肾癌细胞来源exosomes在体内活化MDSCs的实验研究目的：探讨肾癌Renca细胞来源exosomes在体内是否能活化MDSCs。方法：1.将54只6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组：生理盐水组(对照组)、exosomes组和Renca细胞组。生理盐水组每只小鼠左侧肋部皮下注射100μl生理盐水；exosomes组每只小鼠尾静脉内注射100μg肾癌Renca细胞来源exosomes溶液；Renca细胞组每只小鼠左侧肋部皮下注射1.5×106 Renca细胞溶液建立小鼠实验模型。每周监测各组小鼠体重和Renca细胞组肿瘤体积2次。2.分别在建模后第10天、20天和30天处死生理盐水组、exosomes组和Renca细胞组小鼠各6只,按照前述方法提取小鼠双侧股骨／胫骨骨髓细胞,采用流式细胞术检测生理盐水组、exosomes组和Renca细胞组小鼠骨髓中MDSCs比例。3.在建模后第10天、20天和30天处死Renca细胞组小鼠后,切下移植瘤作HE染色。结果：1.成功建立BALB/c小鼠实验模型。2.在建模后第10天处理叁组小鼠各6只,流式细胞术检测结果显示：与生理盐水组MDSCs百分比(22.31%±1.15%)比较,exosomes组(31.15%±0.83%)和Renca细胞组(32.85%±1.32%)小鼠骨髓的MDSCs比例显着增高(P<0.05)；而exosomes组与Renca细胞组比较,MDSCs比例无显着差异,无统计学意义(P>0.05)。第20天同法处理显示：与生理盐水组(25.56%+0.36%)比较,exosomes组(40.15%±-.26%)和Renca细胞组(41.85%4±0.56%)的MDSCs比例显着增高。第30天同法处理结果显示：与生理盐水组(25.67%±0.41%)比较,exosomes组(41.23%±0.30%)和Renca细胞组(41.95%4±0.42%)的MDSCs比例显着增高。在exosomes组与Renca细胞组内,第20天和30天比第10天要显着增加MDSCs比例,有统计学意义(P>0.05)。而生理盐水组MDSCs比例在第10、20和30天之间比较无显着差异。结论：肾癌Renca细胞来源exosomes在体内能活化小鼠骨髓MDSCs,促进其增值。第六部分肾癌细胞来源exosomes膜结合型HSP70在体外活化MDSCs及其机制研究目的：探讨肾癌Renca细胞来源exosomes膜结合型HSP70在体外活化MDSCs及其机制。方法：1.提取第四部分研究中exosomes组及Renca细胞组小鼠股骨/胫骨骨髓细胞,按照流式细胞分选和免疫磁珠细胞分选说明书操作分选MDSCs。2.将分选得到的MDSCs 2000 rpm离心7min,用含有10%进口胎牛血清、100 U/ml青霉素/链霉素的DMEM/F-12培养基重悬,接种于用0.1mg/ml多聚赖氨酸包被的细胞培养皿中,在37℃、5%CO2条件下原代培养,隔天换液一次,镜下观察MDSCs形态,当瓶底细胞融合到90%时,用0.25%胰蛋白酶消化、传代。3.免疫荧光技术检测原代培养的贴壁MDSCs,激光共聚焦技术检测悬浮MDSCs。4.将原代培养的MDSCs设立MDSCs组、MDSCs+exosomes组、MDSCs+exosomes+HSP70抑制剂组和MDSC+exosomes+抗TLR-2抗体组。MDSCs组加DMEM/F-12培养基培养,MDSCs+exosomes组加入20μg exosomes共培养,MDSCs+exosomes+HSP70抑制剂组加入20μg exosomes和4μg HSP70抑制剂Pifithrin-μ共培养,MDSCs+exosomes+抗TLR-2抗体组加入20μg exosomes和3μg抗TLR-2抗体共培养24h；然后用Western blot检测各组MDSCs中蛋白TLR2、MyD88、TRAF6、 p38、p-p38和AP-1表达水平。结果：1.免疫磁珠细胞分选MDSCs较流式细胞分选阳性率更高,在后续实验中选择免疫磁珠分选MDSCs。2.免疫荧光检测显示MDSCs有贴壁生长方式,激光共聚焦检测显示MDSCs也有悬浮生长方式；MDSCs在原代培养的过程中会发生分化,在传3代后Gr-1、CDllb双阳性标记的MDSCs数量减少。3. Western blot结果显示：与MDSCs组比较,MDSCs+exosomes组中蛋白TLR2、MyD88、TRAF6、p38、p-p38及AP-1表达水平显着上调(P<0.01)。与MDSCs+exosomes组比较,MDSCs+exosomes+HSP70抑制剂组中蛋白MyD88、TRAF6、p38、p-p38及AP-1表达水平显着下调(P<0.05)；而MDSCs+exosomes+抗TLR-2抗体组中蛋白MyD88、 TRAF6、p-p38表达水平显着下调(P<0.05)。结论：1.免疫磁珠分选MDSCs比流式细胞分选法效果好。2. MDSCs在体外原代培养过程中有贴壁和悬浮两种生长方式,还会发生分化。3.肾癌Renca细胞来源exosomes在体外参与了小鼠骨髓MDSCs的活化,其机制可能是exosomes膜结合型HSP70通过TLR2/M-yD88ATRAF6/P38/AP-1信号通路活化MDSCs,促进MDSCs增殖,同时由于exosomes成分的复杂性,有可能通过其它信号通路同时激活MDSCs。因此,枸杞多糖联合干扰素a2b可通过减少肾癌Renca细胞分泌exosomes,降低exosomes膜结合型HSP70的表达,减少exosomes膜结合型HSP70对MDSCs的活化,抑制MDSCs增殖,减轻其免疫抑制作用,从而抑制肾癌细胞生长。
张峰琴[7]2007年在《以树突状细胞为介导的卵巢癌特异性免疫治疗的实验研究》文中提出目的:为对比研究各种卵巢癌抗原HS-exosomes致敏树突状细胞介导的卵巢癌特异性的免疫治疗效果,制备卵巢癌exosomes、HS-exosomes、热休克蛋白、冻融抗原。方法:采用超速、梯度离心法从卵巢癌A2780、SKOV3细胞培养上清液中分离纯化肿瘤细胞分泌的HS-exosomes、Exosomes;采用透射电镜观察其超微结构;用冻融法制备肿瘤冻融抗原(frozen tomor antigen,FTA);用经43℃热处理5小时的卵巢癌细胞,制备细胞裂解液,利用层析分离纯化出热休克蛋白,经电泳及Western-blot进行蛋白分子定量。结果:制备的exosomes与HS-exosomes经电镜鉴定为:它是一类直径大约30-90nm的双层膜性囊泡小体,对照文献可确定为exosomes与HS-exosomes。热休克的卵巢癌细胞的裂解液纯化后经鉴定含有相对分子量为70Kd的HSP70蛋白。结论:从经热休克处理或未经热休克处理的卵巢癌细胞培养上清液中均能分离纯化出直径大小为30-90nm的双层膜性囊泡样小体,经电镜鉴定从中分离的小体具有exosomes小体典型的形态特征,我们将经热休克处理后卵巢癌细胞分泌的小体归类为HS-exosomes小体,而未经热休克处理的卵巢癌细胞分泌的小体归类为exosomes小体。同时经热休克处理的卵巢癌细胞裂解液中富含HSP70。目的:对比研究卵巢癌抗原致敏树突状细胞的功能及其在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞CTL特异性杀伤卵巢癌细胞的效果。方法:取健康志愿者外周血,密度梯度离心分离单核细胞(PMBC),用GM-CSF、IL-4等细胞因子刺激刺激,培养大量DC,在其培养体系中分别加入exosomes、HS-exosomes、热休克蛋白、冻融抗原,制备负载抗原的DC(Ag-DC),用ELISA法对Ag-DC和未被修饰DC培养上清液的IL-12、TNF-α含量进行检测;从外周血中获取T淋巴细胞,诱导增殖CTL,加入Ag-DC,用MTT法检测抗原致敏DC诱导T细胞增殖的能力;将健康人外周血单个核细胞通过PHA、IL-2、抗CDS单抗、IFN刺激,诱导分化制备大量的LAK、CDSAK、CIK细胞。将LAK、CDSAK、CIK、T淋巴细胞分别与Ag-DC混合培养,诱导的LAK、CDSAK、CIK、CTL细胞作为效应细胞,按效靶比为25:1的比例将效应细胞加入到靶细胞(A2780、SKOV3)培养体系中,利用乳酸脱氢酶(LDH)4小时释放法测定效应细胞对靶细胞的杀伤活性。结果:从健康外周血获得的PMBC,经GM-CSF、IL-4刺激培养7d后,电镜下观察细胞为不规则形,细胞表面粗糙突起明显,细胞核呈肾形和马蹄形,经FCM鉴定,可确定为DC。ELISA法对抗原修饰的DC和未被修饰DC上清液的IL-12、TNF-α含量进行检测,结果表明:所观察的四种抗原均能致敏DC,经致敏的DC所分泌的IL-12和TNF-α的量均显著增加,其中以HS-exosomes-DC分泌的细胞因子量为最高,经卵巢癌抗原冲击致敏DC刺激T细胞增殖的强度,显着高于未致敏DC(p<0.01);HS-exosomes-DC刺激T淋巴细胞增殖强度与其它叁组抗原致敏DC刺激T淋巴细胞增殖强度相比有显着性差异,(p<0.05);而抗原致敏DC、热休克蛋白-DC、Exosomes-DC叁组间相比较对刺激T淋巴细胞增殖无显着性差异(p>0.05)。四种卵巢癌细胞抗原致敏DC诱导的DC-CTL对同种卵巢癌细胞均表现出较强的杀伤活性,但以HS-exosomes-DC诱导的DC-CTL的杀伤活性最强,与冻融抗原-DC相比有差异P<0.05,而与Exosomes-DC-CTL、热休克蛋白-DC-CTL两组之间无明显的差别,未激化T淋巴细胞对卵巢癌细胞无杀伤作用。结论:本研究制备的四种卵巢癌四种抗原在体外均能致敏DC,致敏DC分泌的IL-12和TNF-α细胞因子及刺激T细胞增殖等功能均显着提高,而且致敏DC诱导的CTL杀瘤活性也显着高于未致敏DC诱导的CTL杀瘤活性,制备的4种卵巢癌抗原致敏DC的功能强度存在一定的差异。
陆振[8]2017年在《抗原修饰的树突状细胞来源exosomes在肝细胞癌免疫治疗中的研究》文中研究指明肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上发病率仅次于胃癌和食道癌的第叁大常见恶性肿瘤,严重威胁人类健康。但目前临床上缺乏有效的治疗手段,尽管树突状细胞(Dendritic Cell,DC)为基础的免疫治疗在临床上表现出一定的治疗效果,但治疗效果极为有限;并且DC疫苗作为一种细胞疫苗,存在着货架期短和对病人来源细胞要求高等局限性。近年来,exosome作为细胞分泌的一种膜性生物纳米囊泡结构,受到肿瘤免疫领域的关注。特别是DC来源的exosomes(DEX)携带大量的源细胞功能蛋白,包括MHC-I/II类分子及CD80、CD86、intercellular adhesion molecule(ICAM)等免疫协同刺激因子,可以作为DC取代物,直接激活初始T细胞,诱导毒性T淋巴细胞产生,发挥抑癌效果;而且DEX在-80°C下可保存6个月,货架期较长。基于DEX独特的优势,已有报道发现,负载了肿瘤抗原短肽的DEX在体内可激活肿瘤抗原特异性CTL,发挥显着的抗肿瘤效果,但是DEX在肝细胞癌免疫治疗中治疗效果有待研究。因此,本研究旨在利用不同的肝细胞癌体外和体内模型,通过系统测试负载肝癌特异性抗原甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的DEX_(AFP)在不同肝细胞癌小鼠模型体内的抗肿瘤效果,以确定DEX_(AFP)在肝细胞癌免疫治疗中的治疗效果和潜力,并探讨DEX_(AFP)为基础的免疫治疗潜在的作用机制。首先,我们将表达AFP蛋白的慢病毒载体转染DC2.4细胞株(以下简称DC),以获得AFP稳定表达的树突状细胞系DC_(AFP),通过流式检测确定DC_(AFP)细胞表面主要组织相容性复合体(MHC-I/MHC-II)和协同刺激因子CD80、CD86和ICAM等表达水平显着高于正常DC;并在肝细胞癌皮下瘤模型上确认了DC_(AFP)的肝癌抑制效果。对DC_(AFP)分泌的exosomes(DEX_(AFP)),进行流式检测发现,与正常DC来源的DEX相比,DEX_(AFP)富集更多的MHC-I、MHC-II、CD80、CD86和ICAM分子,表明DEX_(AFP)具有一定的免疫原性。为了测试DEX_(AFP)在体内的抗原特异性,我们将DEX_(AFP)免疫小鼠来源的脾脏细胞分别用DEX和DEX_(AFP)在体外再刺激,并将刺激后的T细胞分别与不同的肿瘤细胞(肝癌细胞Hepa1-6,H22,肺癌LLC1,胰腺癌Panc02)共孵育。结果表明:只有经DEX_(AFP)免疫过的小鼠来源脾脏T细胞可以在体外被DEX_(AFP)进一步活化,并且这些被活化的T细胞只对AFP特异性表达的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6具有杀伤效应,显示了DEX_(AFP)的抗原特异性杀伤作用。为了进一步探究DEX_(AFP)在体内的抗肿瘤效果,我们选择了小鼠皮下瘤模型对DEX_(AFP)的治疗策略进行了优化研究。通过对皮下注射(s.c.)和尾静脉注射(i.v)两种注射方式的治疗效果和生存期比较,结果发现:尽管两者间并无显着性差异,但尾静脉注射组治疗效果稍优于皮下注射组,因此在后续试验中,我们选择尾静脉注射作为主要给药方式。进一步对不同治疗周期的优化试验中发现,多次免疫治疗效果明显优于单次,特别是每周一次,连续免疫叁次治疗效果较佳,因此在后续试验中选择叁次治疗(1次/周)作为主要给药周期。为确定治疗的最佳剂量,我们分别在肝细胞癌皮下瘤模型上,测试叁种不同剂量,通过对不同的DEX_(AFP)治疗剂量比较后,确定单次剂量40μg/鼠为DEX_(AFP)在皮下瘤模型上的最低有效剂量。尽管肝细胞癌皮下瘤模型作为给药方式、周期和剂量优化的有效模型,但不能完全反映肝细胞癌的免疫和肿瘤微环境,而原位肝细胞癌模型则能更好地反映临床肝癌病人的免疫和肿瘤微环境。为了测试DEX_(AFP)对于原位肝细胞癌的治疗潜力和效果,我们在移植型原位肝癌模型上对DEX_(AFP)治疗效果进行了系统的测试研究。首先,我们对荷瘤7天的原位移植瘤小鼠分别进行了每周1次,连续3周和每5天用药1次,连续用药4次的给药周期比较。对其治疗效果的分析,发现两种给药方式均能显着抑制肿瘤生长,并延长荷瘤小鼠的生存期;但相较而言,连续用药3周后,DEX_(AFP)略优于连续用药4次,每5天用药1次的治疗效果。因此在后续试验中,我们选择每周1次,连续3周的给药方式,并在这一给药模式下,探讨了DEX_(AFP)的抑制肿瘤效果与免疫微环境改善之间的相关性。通过比较不同治疗时间点,DEX_(AFP)对原位肝癌荷瘤小鼠的肿瘤生长情况及相对应的免疫细胞和免疫因子水平变化;结果表明:DEX_(AFP)对小鼠原位瘤表现为持续性抑制生长作用;随着治疗次数的增加,DEX_(AFP)对免疫微环境的改善也表现为逐渐增强,特别是在2次和第3次治疗之间,治疗小鼠的免疫微环境改善最为显着,说明DEX_(AFP)对原位肝癌的治疗效果具有累计效应。为了更好地模拟临床肝癌病人病理上的异质性和复杂性及抑制性免疫微环境,同时更为全面地评价DEX_(AFP)的临床适用性。我们利用化学药物二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DENA)诱导法成功地建立了原发性小鼠肝癌模型。通过对原发性小鼠肝癌模型病理和免疫微环境的检测,确立了该模型的病理复杂性和异质性以及抑制性免疫微环境。在DENA诱导后7个月,在小鼠肝脏可见清晰肿瘤病灶,并检测到抑制性免疫微环境,证明原发性肝癌小鼠模型的成功建立。因此,DEX_(AFP)治疗试验从第8个月开始,进行每周一次,为期3周的治疗周期。在最后一次治疗后10周收样。通过对治疗小鼠肝脏肿瘤结节数量、重量和大小及体积的测量,结果发现:与PBS和DEX组相比,DEX_(AFP)能够明显减少小鼠肿瘤结节数量、体积以及肝脏的代偿性增生,表现出显着的地抑瘤效果。为了阐明DEX_(AFP)对原发性HCC免疫和肿瘤微环境的影响,我们分别检测小鼠免疫微环境和肿瘤微环境相应指标,结果发现:DEX_(AFP)治疗组外周血中功能CD8~+T细胞的比例和促进肿瘤免疫因子分泌水平显着升高,而抑制性Treg细胞的比例以及抑制性肿瘤免疫因子分泌水平显着下降,说明DEX_(AFP)显着改善治疗小鼠免疫微环境。对相应肿瘤组织中T细胞数量和免疫因子水平的检测,发现DEX_(AFP)治疗组肿瘤组织中,CD8~+T细胞以及CD3~+T细胞浸润比例显着增加,而抑制性Treg细胞的聚集和抑制性免疫因子分泌显着下调。这些结果说明:DEX_(AFP)对原发性肝细胞癌具有显着抑瘤作用,并且能够改善原发性肝癌免疫和肿瘤微环境。为了阐明DEX_(AFP)抗肿瘤作用机制,我们利用胸腺缺陷的免疫缺陷型小鼠,通过检测DEX_(AFP)对T细胞缺失的免疫缺陷型裸鼠的肿瘤生长抑制效果和生存期作用,确认T细胞在DEX_(AFP)介导的抗肿瘤中的重要作用。同时,对NK细胞的检测,表明NK细胞可能在DEX_(AFP)介导的抗肿瘤过程中也起到一定作用。结论:表达肝癌特异性抗原的exosome对肝细胞癌表现为高效的抑瘤作用,并改善肝细胞癌免疫和肿瘤微环境,可以作为肝细胞癌免疫治疗的非细胞疫苗。
陈绍倩[9]2007年在《白血病细胞来源exosomes诱导CTL的抗白血病作用》文中指出白血病是血液系统最常见的恶性疾病，近年来白血病的发病率呈逐渐上升的趋势。上世纪末期逐渐完善的诱导缓解化疗和支持对症治疗已可以使绝大多数的患者达到完全缓解(Complete Remission，CR)；白血病的治疗目前面临的主要问题是：有一小部分患者因原发耐药导致初次诱导缓解治疗无效不能达到完全缓解；初次诱导缓解治疗有效能达到完全缓解的病人则还面临着残留白血病细胞的继发耐药所导致的复发，这一问题是目前白血病临床治疗中，也是其它肿瘤临床治疗中所面临的最大难题；因此激发患者自体的免疫功能以杀灭白血病细胞／肿瘤细胞的肿瘤疫苗成为肿瘤治疗研究的热点。免疫治疗在肿瘤或白血病的治疗中一直处于辅助治疗的地位，至今没有特别有效的免疫治疗能应用于临床。研究显示肿瘤细胞、肿瘤细胞可溶性抗原、肿瘤细胞蛋白质或蛋白肽以及肿瘤细胞RNA／DNA都携带有肿瘤抗原和／或肿瘤相关抗原，可以作为肿瘤疫苗刺激机体产生抗肿瘤免疫反应；但其免疫原性往往比较弱，目前还难以真正应用于临床解决白血病或肿瘤治疗中所面临的问题。树突状细胞(Dendritic Cells，DC)是目前发现的唯一能激活初始型T细胞(naive T cells)并诱导特异性免疫应答的抗原呈递细胞，目前的研究结果提示激活的T细胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)介导的适应性免疫应答在机体抗白血病效应中起关健作用。用白血病抗原负载的树突状细胞作为“抗白血病治疗性疫苗”的效果已得到了验证，但是目前还有很多相关的诸如树突状细胞的来源和功能维持等问题没有解决，如树突状细胞疫苗需要大量的树突状细胞，功能难以保持，并且难以制定GMP(Good Manufacturing Practice)生产标准，不宜保存等客观问题制约着树突状细胞疫苗的研究和应用。L．Zitvogel和G．Raposo等研究小组的研究结果显示肿瘤抗原冲击后的树突状细胞来源exosomes(DEX)和树突状细胞一样能诱导明显的抗肿瘤免疫反应，产生有效的免疫保护和治疗作用，提示exosomes可能是更有潜能的肿瘤治疗型性疫苗。exosomes是一种直径在30-100nm范围有双层膜的囊泡小体，可由多种细胞分泌，并且携带有所有抗原呈递所需的物质分子，包括MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、共刺激分子CD86、CD80、以及黏附分子CD54、CD11c和CD1a-d；肿瘤细胞来源的exosomes(TEX)除携带有MHC-Ⅰ分子、MHC-Ⅱ分子、共刺激分子和粘附分子等抗原呈递所需要的分子外，还携带有和细胞靶向相关的CD9分子以及肿瘤抗原运载系统热休克蛋白分子(蛋白分子伴娘，hot shock protein，HSPs)，同时也携带有许多肿瘤细胞所共有的共同抗原和肿瘤相关抗原，能把肿瘤抗原转运给专职的抗原递呈细胞和效应细胞，从而激活体内的抗肿瘤免疫反应并放大这种免疫反应，产生对肿瘤的排斥效应。另外和DC疫苗相比exosomes还具有耐高温、可长期冷藏、定量分析和易于制定GMP生产标准等优点，因而被认为是新的抗原传送和呈递的载体，同时也是更有潜能的肿瘤治疗性疫苗。目前对exosomes的研究尚处于初始阶段，国内还未见在白血病方面的研究报道。而且根据文献报道，急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)细胞和慢性粒细胞白血病(Chronic Myelocytic Leukemia，CML)细胞可以直接诱导分化成树突状细胞，这些树突状细胞既具备了白血病细胞的特点，同时又具有树突状细胞的特点和功能，其外泌的exosomes也应该具有树突状细胞来源exosomes和肿瘤细胞来源exosomes的双重特性；而且和实体肿瘤相比，白血病细胞取材更为便捷，更方便研究和应用。基于此本课题研究了白血病细胞来源exosomes诱导的CTL的抗白血病作用。实验方法第一部分K562细胞来源exosomes体外诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用1．K562细胞诱导分化树突状细胞(K562-DCs)的诱导和鉴定根据文献报道的方法，用含有重组人粒细胞-单核细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素-4(rhIL-4)及肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)的RPMI-1640细胞营养液培养K562细胞诱导树突状细胞生成。在倒置显微镜下动态观察细胞的形态变化；流式细胞仪检测培养前后细胞表面CD34、CD11c、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD86和CD54等树突状细胞标志分子的表达；电镜下观察并摄像其典型形态。2．K562细胞和K562-DCs分泌exosomes的提取和鉴定收集对数生长期的K562细胞培养上清液和培养第12-14天的K562-DCs的培养上清液，根据文献报道的多步骤离心获取exosomes的方法，通过低速离心、高速离心去除细胞培养上清液中的细胞和细胞碎片等杂质，再把上清液经过100，000g超高速离心1小时，获取的沉淀即为exosomes。紫外分光光度仪对exosomes进行蛋白定量，经12％SDS-PAGE电泳观察蛋白带型，western blot检测所携带的标志性分子；电子显微镜下观察其形态特征。3．K562细胞来源exosomes诱导CTL对K562细胞和HL60细胞的杀伤作用用K562细胞来源exosomes(Kexo)刺激正常人外周血单个核细胞诱导分化的树突状细胞(MC-DCs)作为实验组，未刺激组做为对照组，然后分别诱导正常人T淋巴细胞产生CTL，MTT法检测两组CTL对K562细胞和HL60细胞的杀伤作用。4．不同K562细胞exosomes诱导CTL对K562细胞的杀伤作用分别用K562细胞源exosomes(Kexo)、K562-DCs源exosomes(DCexo)、热休克K562细胞源exosomes(Hexo)、K562细胞冻融抗原和K562细胞总RNA抗原冲击K562-DCs源exosomes(Rexo、Fexo)刺激正常人MC-DCs，并进一步诱导活化CTL效应细胞，MTT法检测CTL效应细胞对K562细胞的杀伤作用。5．不同K562细胞exosomes联合CPG佐剂诱导CTL对K562细胞的杀伤作用同上方法检测K562细胞来源exosomes(Kexo)、K562-DC分泌exosomes(DCexo)和RNA抗原冲击K562-DC exosomes(Rexo)单独或联合CpG ODN佐剂后诱导CTL对K562细胞的杀伤活性。第二部分CKLFSF8基因转染对K562细胞、K562-DCs及分泌exosomes的影响1．CKLF、CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs中的表达，首先采用免疫组化方法用CKLF单抗检测CKLF在K562细胞和K562-DC中的表达，再分别提取K562细胞和K562细胞总RNA抗原荷载K562-DCs后的RNA，根据CKLFSF8基因特异性引物，采用RT-PCR方法观察CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs中的表达。2．CKLFSF8基因转染对K562细胞和K562-DCs及其分泌exosomes的影响用脂质体转染试剂把携带CKLFSF8基因片段的pcDNA3.1质粒转染到K562细胞和K562-DCs中，倒置显微镜下观察细胞生长，MTT法检测细胞增殖状态，免疫细胞化学法检测细胞表面EGFR(EGF受体)的表达，并提取相应细胞培养上清液中的exosomes，经12％SDS-PAGE电泳观察蛋白带型，western blot鉴定所携带exosomes的标志性分子，电子显微镜下观察其形态特征及其分泌的变化。第叁部分CML患者原代白血病细胞源exosomes诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用1．CML患者原代白血病细胞来源exosomes诱导CTL对患者白血病细胞的杀伤作用CML患者抗凝外周血梯度离心获取原代白血病细胞并培养，同第一部分方法获取CML患者原代白血病细胞来源exosomes(Pexo)，MTT法检测K562细胞来源exosomes(Kexo)和Pexo诱导的患者CTL对患者原代白血病细胞的杀伤作用。2．不同方法获取的Pexo诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用同第一部分方法MTT法检测CML患者Pexo、CML患者原代白血病细胞诱导分化树突状细胞来源exosomes(PDCexo)和患者白血病细胞冻融抗原刺激白血病细胞诱导分化树突状细胞来源exosomes(PFexo)单独或联合CPG ODN佐剂诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用3．PFexo诱导同种异体CTL对患者白血病细胞的杀伤作用取患者治疗后正常自体和HLA完全相合同胞外周血单个核细胞诱导培养树突状细胞，诱导培养第5天分别加入终浓度为20ug／ml的PFexo继续培养48小时，再分别加入同源T淋巴细胞诱导CTL生成，MTT法检测对患者白血病细胞的杀伤作用。实验结果第一部分K562细胞来源exosomes体外诱导的CTL对白血病细胞的杀伤作用1．K562细胞可诱导分化成树突状细胞我们的实验证实K562细胞经rhGM-CSF、rhIL-4和rh TNF-α诱导培养到12-14天时细胞呈典型的树突状细胞形态，透射电镜下可见到由细胞胞浆伸出的长短不一的绒毛样突起，在诱导培养后细胞表面CD34、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD11c、CD54、CD80、CD86和CD40等标志性分子的表达都明显发生改变，呈DC的特点。2．K562细胞及其诱导分化的树突状细胞分泌exosomes从K562细胞培养上清液和K562-DCs培养上清液中都能分离到exosomes(Kexo，DCexo)，SDS-PAGE电泳分析显示二者有相似的蛋白带型。透射电子显微镜下呈50-90nm大小的膜颗粒。Western blot蛋白分析显示都携带有标志性蛋白分子MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD86、CD54、CD80和CD40等分子。3．Kexo诱导的CTL对白血病细胞的杀伤作用我们的实验结果提示，Kexo刺激正常人树突状细胞并诱导T淋巴细胞特异性的对K562细胞的杀伤作用，同时对HL60细胞有一定的交叉杀伤作用。4．不同K562细胞来源exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用不同方法处理K562细胞(诱导分化DCs、K562细胞热休克、K562细胞RNA和冻融抗原刺激K562-DCs)来源exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作比K562细胞来源exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用强，而这四种exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用近似。5．CpG ODN佐剂能增强exosomes诱导的CTL对K562细胞的杀伤作用。Exosomes能诱导有效的CTL对K562细胞的杀伤作用，联合应用CpG ODN Th1型免疫佐剂后，进一步增强了其杀伤作用。第二部分CKLFSF8基因转染对K562细胞、K562-DCs及分泌exosomes的影响1．CKLF和CKLFSF8在K562细胞和K562-DC中的表达CKLF和CKLFSF8在此两种细胞都有表达，并且在K562细胞RNA抗原荷载前后的K562-DC和K562细胞中的表达没有变化。2．CKLFSF8基因转染对K562细胞和K562-DCs的增殖和exosomes分泌的影响我们采用多种转染试剂转染K562-DC均未能达到满意的转染效果，应用能特异性结合树突状细胞受体的JetPEI-Man转染试剂也只是观察到很低的转染率，没有观察到转染对树突状细胞增殖和分泌exosomes的影响。CKLFSF8基因转染K562细胞后，转染率也很低，未能如期筛选出稳定表达的细胞株，并且导致K562细胞的逐渐死亡，但转染空质粒的细胞没有发现此现象，提示CKLFSF8基因转染导致K562细胞的死亡，进一步对多种其它肿瘤细胞的转染试验结果类似。MTT法测定显示转染后的K562细胞增殖受抑，斑点分析显示转染前后外泌的exosomes无明显变化。免疫组化方法检测转染前后K562细胞表皮生长因子受体(EGFR)的表达，发现转染CKLFSF8基因后其表达明显下调，推测CKLFSF8基因转染K562细胞后其增殖受抑制的可能机制是EGFR表达下调导致K562细胞生长信号传导受抑最终导致细胞的死亡。第叁部分CML患者原代白血病细胞源exosomes诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用1．Pexo诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用对CML患者原代白血病细胞来源exosomes(Pexo)诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用的研究显示：Pexo的免疫原性和Kexo有所不同，Pexo诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用比Kexo诱导的更强。PDCexo和PFexo与Pexo相比有更强的免疫原性，联合CpG免疫佐剂可以进一步增强exosomes诱导的CTL对患者白血病细胞的杀伤作用。2．PFexo刺激同种异体树突状细胞诱导的CTL的抗白血病细胞作用患者原代白血病细胞冻融抗原刺激患者白血病细胞诱导分化的树突状细胞来源exosomes(PFexo)分别刺激自体正常及HLA完全相合同胞的MC-DCs和淋巴细胞诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用明显不同，PFexo诱导的同胞CTL对患者白血病细胞的杀伤作用比自体的更强。讨论白血病的治疗目前面临的最大难题是临床医师对耐药的患者没有有效的应对方法，这类患者很难达到长生存。由于白血病免疫治疗的效果还很有限，临床上免疫治疗一直是作为辅助治疗来进行的，但对免疫治疗的探索并没有停止过。近些年对树突状细胞的大量研究证明树突状细胞疫苗对恶性肿瘤的治疗作用是肯定的，但是树突状细胞作为肿瘤治疗性疫苗还存在诸如来源和功能维持等许多问题尚未解决，难以广泛应用。而近些年有关exosomes的研究结果则让我们看到了新的白血病免疫治疗的曙光，几组动物体内和临床实验结果都显示：肿瘤抗原荷载的树突状细胞来源的exosomes可以诱导产生比较好的对肿瘤的预防和治疗效果，而且exosomes更具备了耐高温、可长期冷藏和易于定量等优点，克服了树突状细胞疫苗的一些缺点，尽管目前对exosomes在体内的生理和病理生理作用还不甚明了，还需要进行大量的研究工作，但其作为无细胞治疗性疫苗的潜能是明显的。目前很少有关exosomes在白血病方面的研究报道，白血病细胞可以诱导分化成树突状细胞，具备了肿瘤细胞和树突状细胞的双重特点，并且白血病细胞取材更为便利，更利于研究和应用。基于此我们研究了白血病细胞来源exosomes诱导的杀伤白血病细胞的作用。我们的结果显示K562细胞可以诱导分化成树突状细胞，K562细胞及其诱导分化的树突状细胞分泌的exosomes携带有MHC分子和共刺激分子等抗原呈递所必需的分子，体外能诱导T淋巴细胞产生对K562白血病细胞特异性的CTL杀伤作用和对HL60白血病细胞的交叉杀伤作用。进一步的试验发现K562细胞经过热休克处理、诱导分化成树突状细胞和冻融抗原或RNA抗原冲击K562-DCs后分泌的exosomes能更有效地诱导这种杀伤作用。联合应用CpG ODN佐剂能进一步促进这种杀伤作用。对患者自体原代白血病细胞来源exosome的研究显示，和K562细胞来源的exosomes相比，它诱导的对患者原代白血病细胞的杀伤作用更为明显。患者原代白血病细胞诱导分化树突状细胞来源的exosomes或白血病细胞冻融抗原冲击患者白血病细胞诱导分化树突状细胞源exosomes能诱导比原代白血病细胞来源exosomes更强的杀伤活性。联合CpG佐剂其诱导的杀伤作用进一步增强。患者白血病细胞冻融抗原刺激患者白血病细胞诱导分化的树突状细胞来源exosomes(PFexo)分别刺激自体和HLA完全相合同胞的淋巴细胞诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用明显不同，同胞CTL的杀伤作用更强。提示这些白血病细胞源exosomes都是很好的备选exosomes治疗性疫苗的来源，在对其有了全面的了解和认识后，有望作为白血病治疗性疫苗用于白血病的临床治疗。为了观察趋化因子样细胞因子超家族成员8(CKLFSF8)对exosomes质和量的影响，以探寻更为有效的exosomes来源，我们进一步对CKLF和CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs表达的研究未能达到预期目的，我们的研究发现，CKLF和CKLFSF8在K562细胞及其诱导分化树突状细胞中均有表达。把CKLFSF8基因转染到K562细胞没有如期筛选出稳定表达的细胞株，发现CKLFSF8基因转染抑制K562细胞生长，转染其它细胞如Eca109、HL60、BGC823后也观察到类似的结果，推测CKLFSF8在肿瘤细胞中的表达可能有更微妙的机制，通常的表达可能和细胞的生物活性有关，是细胞生长所必须的，不抑制细胞的生长；但过度表达则可能抑制细胞的生长。进一步用免疫组化分析细胞表面的EGFR的表达，发现CKLFSF8基因转染后EGFR的表达显着下降，推测可能是白血病细胞或肿瘤细胞增殖能力减低的原因。转染CKLFSF8基因后的K562细胞分泌的exosomes质和量无变化，推测可能与设定的检测指标有关，也可能还和其它因素有关，还有待深入的研究。结论：1．K562白血病细胞和慢性粒细胞白血病患者原代白血病细胞均可以诱导分化成树突状细胞，并且白血病细胞和白血病树突状细胞均分泌exosomes。2．白血病细胞和白血病树突状细胞分泌的exosomes携带有抗原呈递所需要的物质分子，并且有抗原呈递功能，可以诱导淋巴细胞活化产生对白血病细胞的特异性和交叉杀伤作用。CpG ODN免疫佐剂可以增强exosomes诱导的免疫应答的强度。3．CKLFSF8在K562细胞和K562-DCs都有表达，K562细胞在CKLFSF8基因转染前后都能分泌具有抗原提呈功能的exosomes并刺激T细胞活化。转染后CKLFSF8在K562细胞的过表达使其细胞表面EGFR表达下调，并且直接抑制白血病细胞的生长。4．Exosomes有希望用于白血病的免疫治疗。
管莎莎[10]2014年在《小鼠树突状细胞与骨髓瘤细胞融合瘤苗衍生exosomes的免疫效应研究》文中研究表明目前肿瘤治疗方法主要有手术、化疗、放疗和生物治疗。其中肿瘤生物治疗是目前研究的热点,具有良好的前景,树突状细胞(Dendritic Cell, DC)是肿瘤生物治疗的重点研究对象。树突状细胞是目前已知功能最强的抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cell, APC),其在肿瘤免疫中发挥重要作用。本课题将DC与肿瘤细胞融合制成瘤苗,使该融合细胞即表达肿瘤抗原又具有提呈抗原的能力。Exosomes为一种直径30-120nm大小的囊泡状物质,其中含有核酸和蛋白质。多种细胞已经被证实在体外都能向细胞外释放exosomes,包括：多种血细胞(B细胞、T细胞、树突状细胞、肥大细胞,血小板)、肠上皮细胞、施万细胞(schwann,又名雪旺细胞)、脂肪细胞、神经细胞、纤维母细胞和多种肿瘤细胞系[37-41]。目前在临床和实验研究中具有抗肿瘤作用的exosomes主要有两种,一是肿瘤细胞产生的exosomes (Tumor Derived Exosomes, TEX),因其含有许多肿瘤细胞所共有的肿瘤抗原,具有潜在的加强肿瘤细胞免疫原性、促进抗肿瘤免疫的作用[42]；二是DCs来源的exosomes (Dendritic Cells Derived Exosomes,DEX)。也有研究表明,某些肿瘤细胞和不成熟树突状细胞来源的exosomes不能有效增强机体免疫,甚至具有免疫耐受作用。因此,exosomes是否具有抗肿瘤免疫效应,不仅与其来源细胞的特点和功能状态有关,也需要对获得的exosomes进行体内外试验进行功能验证。考虑到DC细胞的抗原提呈能力和肿瘤细胞易增殖的特点,有研究者采用杂交瘤技术将DC与骨髓瘤细胞融合制成瘤苗,即克服了DC细胞分离提取和培养困难的问题,也克服了肿瘤细胞免疫原性弱、抗原提呈能力差的弱点,在体内外研究上都显示出了抗肿瘤效应。但该融合细胞分泌exosomes是否具有融合细胞膜标志的特点、是否具有抗肿瘤作用,报道尚少。本文将骨髓瘤细胞和DC融合,再提取融合细胞分泌的exosomes进行抗肿瘤效应研究。目的为获得理化性质稳定、耐高温、制备时可质控,较细胞性瘤苗更具优越性的肿瘤治疗疫苗,本文通过收集DC/肿瘤细胞融合细胞上清液,分离提取exosomes,并对其进行鉴定和抗肿瘤效应研究,以期为DC/肿瘤细胞融合疫苗的应用开辟新的途径。方法1.DC的提取和培养：取6-8周BALB/c雄性小鼠,无菌分离股骨、胫骨和腓骨,髓腔冲洗获得骨髓细胞,静置24h,去除未贴壁细胞,将贴壁细胞培养于含10%胎牛血清DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养液中,加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF)20ng/ml,白细胞介素-4(Interleukin4, IL-4)10ng/ml,诱导其向DC分化。2.骨髓瘤sp2/0细胞培养：从液氮中取出细胞株,复苏后在含10%胎牛血清DMEM培养液中培养,融合前用8-氮鸟嘌呤(8-Azaguanine,8-AG)处理两周。3.DC与sp2/0细胞融合及鉴定：使用聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)化学融合法与电融合法相结合的方法制备DC/sp2/0融合细胞。流式细胞仪分析融合效率,激光共聚焦鉴定融合细胞。4.DC/sp2/0融合细胞的培养：融合后将细胞移入96孔板,使用含1%HAT(H-Hypoxanthine次黄嘌呤,A-Aminopterin甲氨喋呤,T-Thymidine胸腺嘧啶核苷)的10%胎牛血清DMEM选择培养基培养14天,改用含1%HT(H-Hypoxanthine次黄嘌呤,T-Thymidine胸腺嘧啶核苷)的10%胎牛血清DMEM选择培养基培养7天,再改用正常10%胎牛血清DMEM培养基培养。培养期间加入GM-CSF100ng/ml.5.Exosomes的提取及鉴定：收集经筛选后的融合细胞上清,采用密度梯度离心法[15],提取上清液中exosomes,运用紫外分光光度仪对exosomes进行定量,用投射电镜观察exosomes形态,运用SDS-PAGE和western blot对exosomes进行鉴定。6.T淋巴细胞分离和培养：自6-8周BALB/c雄性小鼠脾脏中分离单个核细胞,尼龙毛吸附法获得T细胞,含IL-2(30μg/ml)的10%胎牛血清DMEM培养液进行培养。7.T淋巴细胞增殖实验：在T淋巴细胞培养液中加入exosomes,并用MTT比色法检测T细胞增殖。8.DCex、imDCex及融合细胞Exosomes对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响：将T淋巴细胞培养液中分别加入DCex、imDCex和exosomes,6天后取叁组T淋巴细胞作为效应细胞,进行CTL杀伤试验。设单独T细胞、骨髓瘤细胞为对照。使用MTT比色法检测T细胞靶细胞杀伤能力。9.实验结果用统计学软件SPSS13.0分析。结果1.DC与sp2/0细胞融合及鉴定：小鼠骨髓贴壁细胞经GM-CSF、IL-4体外诱导培养7d,呈现典型形态特征的DCs；与骨髓瘤细胞融合效率经流式细胞仪检测为45%左右,激光共聚焦显微镜下见到了双阳性的融合细胞。2. DC/sp2/0融合细胞分泌exosomes的提取和鉴定：融合细胞呈贴壁生长,类圆形,收集上清提取exosomes经western blot鉴定显示,融合细胞分泌的exosomes携带有MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子。对照组sp2/0细胞分泌的exosomes不带有MHC-Ⅱ分子。3.T淋巴细胞增殖实验：融合细胞分泌的exosomes和成熟DCs来源的exosomes有显着促进T细胞增殖的作用,且与exosomes的剂量呈正相关,与对照组相比P<0.01。未成熟DC分泌的exosomes不具有促进T细胞增殖的能力,与对照组相比,无显着差异,P>0.05。4.CTL实验：融合细胞分泌的exosomes和成熟DC来源的exosomes能诱导出CTL杀伤活性,与对照组相比,有显着性差异,P<0.01；效靶比例以50：1时对靶细胞杀伤能力最强。未成熟DC分泌的exosomes不具有活化CTL的能力,与对照组相比,无显着差异,P>0.05。结论DC/sp2/0融合细胞能够分泌exosomes,该融合细胞分泌的exosomes有显着促进T细胞增殖的作用,并能诱导出CTL杀伤活性。
参考文献：
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[10]. 小鼠树突状细胞与骨髓瘤细胞融合瘤苗衍生exosomes的免疫效应研究[D]. 管莎莎. 郑州大学. 2014
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