徐涛[1]2003年在《小麦耐盐突变体TaGSK1基因的分离和鉴定》文中提出本研究成功地对小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)基因进行了克隆、测序，并应用分子生物学软件对该基因进行了序列比较和蛋白结构的分析。该基因已作为小麦中发现的新基因被GenBank接受(AF525086)。而后，采用PCR方法，以小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)基因克隆载体p~(D-T)23为基础，构建了原核表达载体pBV221-gsk1，并在大肠杆菌DH5 α和BL21中均能成功表达，表达量分别为8％和10.8％。转化的大肠杆菌菌株耐盐性分析表明，转化子的耐盐能力比宿主菌高，在直至浓度为0.90mol／LNaCl的LB培养基中的生长量均明显高于宿主菌DH5 α。从原始的耐盐材料RH8706-49和作为对照的敏盐材料H8706-34基因组中成功克隆、测序了TaGSK1基因。结果表明：TaGSK1有较高的保守性，两种材料耐盐性的差异主要表现在转录和翻译水平，而在DNA水平则无较大区别。进一步的Southern杂交证明TaGSK1基因在RH8706-49和H8706-34基因组中的拷贝数均为3。以敏盐小麦成熟胚愈伤组织为材料，使用构建成功的TaGSK1双元载体pBI121-gsk1，分别采用农杆菌介导和基因枪轰击两种转基因方法进行了TaGSK1基因的小麦遗传转化，在抗性培养基上进行筛选获得阳性愈伤组织。提取转基因阳性愈伤组织基因组DNA，以NPT-Ⅱ基因两端序列为引物，用PCR方法扩增出了NPT-Ⅱ基因，从而证明两种转基因方法均获得成功。对转基因愈伤的实验表明，对照愈伤组织在0.5％NAGl中大多褐化甚至死亡，而转化愈伤组织则生长旺盛，初步表明TaGSK1基因能提高敏盐小麦的耐盐性。试验表明两种转基因方法各有优缺点，转化率的高低与材料的基因型密切相关。 本研究对TaGSK1基因的表达调控及其蛋白功能的深入研究，对揭示小麦耐盐机理，开发利用小麦遗传转化技术都具有重要意义。
吴立柱[2]2004年在《小麦糖原合成酶激酶（TaGSK1）的亚细胞定位及其功能鉴定》文中指出本研究利用我室从小麦耐盐突变体RH8706-49中克隆的小麦糖原合成酶激酶基因(TaGSK1)，在其C端标记绿色荧光蛋白基因(GFP)构建成双元表达载体pBIN-Ta-GFP，并以空载质粒pBINGFP_4为对照转化农杆菌GV3101，经筛选得到阳性农杆菌，采用浸花法转化Columbia型拟南芥，经卡那霉素筛选得到转基因拟南芥ATaGFP和AGFP。将二者的T2种子分别种植于含有卡那霉素的MS培养基上，6d后用confocal观察根部细胞，发现转融合基因TaGSA1-GFP的拟南芥植株(ATaGFP)的绿色荧光主要分布于细胞质内，而对照植株(AGFP)的绿色荧光主要分布于细胞核和细胞膜部位。 将转基因拟南芥ATaGFP和AGFP种子以及野生型Columbia型拟南芥Ac的种子种植于不同浓度的含盐培养基(70mmol／L NaCl，120mmol／L NaCl)上，7d后测量上述叁类幼苗主根的生长量，在含盐70mmol／L NaCl的培养基上依次为8.509cm、6.722cm和1.493cm，经新复极差(SSR)测验转基因植株ATaGFP与AGFP之间差异极显着(p＜0.01)，ATaGFP与Ac之间差异显着(p＜0.05)；在含盐120mmol／L NaCl的培养基上叁类种子的主根平均生长量依次为4.600cm、2.532cm和0.719cm，经新复极差测验转基因植株ATaGFP与AGFP之间，ATaGFP与Ac之间差异均极显着(p＜0.01)。9d后统计各类植株的侧根生长数量，发现叁者在含盐70mmol／L NaCl的培养基上依次为1.737、0.673和0.034条。在含盐120mmol/L NaCl的培养基上依次为0.976、0.289和0.000条，经差异显着性测定，在两种不同含盐量的培养基上，各类植株间侧根生长数量的差异均达到极显着水平(p＜0.01)。说明小麦糖原合成酶激酶TaGSK1能够提高拟南芥的耐盐能力。同时利用confocal观察转基因植株ATaGFP的根部细胞，发现小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)在根尖分生组织和侧根的基部分布较多，这可能是转有目的基因的拟南芥主根生长量和侧根数量增加的内在原因之一。 将转基因拟南芥ATaGFP和AGFP种子分别种于MS培养基上，6d后用1.3mol／L蔗糖溶液处理二者幼苗的根部，经confocal观察，发现转融合基因TaGSK1-GFP的拟南芥植株(ATaGFP)根部细胞未发生质分离，而对照植株(AGFP)却发生了质壁分离。直至用2.0mol／L蔗糖溶液处理后部分细胞才发生质壁分离。说明小麦糖原合成酶激酶TaGSK1具有增强植物细胞抗胁迫、渗透的能力。
徐涛, 赵宝存, 葛荣朝, 沈银柱, 黄占景[3]2006年在《利用基因枪法将Tagsk1基因导入敏盐小麦成熟胚愈伤组织提高其耐盐性的研究》文中研究指明以Tagsk1(TriticumasetiumL.glycogen synthase kinase1)基因的cDNA的碱基序列为基础,设计特异引物由小麦耐盐突变体RH8706-49基因组DNA进行扩增后,得到来自于基因组的Tagsk1基因。采用基因枪法,利用携带该基因的双元表达载体pBI121-gsk1转化敏盐小麦H8706-34和中国春的成熟胚愈伤组织,经Kanamycin和0.5%NaCl筛选获得耐盐愈伤组织。这些被转化的愈伤组织表现出较高的耐盐性,并且能够在含盐培养基上进一步分化出根和芽。
李亚青[4]2005年在《小麦耐盐相关基因TaGSK1的染色体定位及其逆境胁迫下的表达分析》文中研究说明以我室经过小麦花药培养、EMS诱变获得的耐盐性有明显差异的“一粒传”后代中的耐盐突变体RH8706—49和敏盐突变体H8706—34为材料,分离到了耐盐相关基因糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase in Triticum asetium,FaGSk1)。该基因已作为小麦中新发现的基因被GenBank接受,登录号为AF525086。本研究以小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)基因的克隆载体P~(D-T)23为基础,设计引物经PCR扩增标记探针,以中国春缺体-四体系为材料,用Southern杂交的方法将其进行定位于第一同源群的1A、1B和1D染色体;进而通过EST比对,将其进一步定位在1A、1B和1D染色体短臂上。 糖原合成酶激酶在许多信号通路中担任重要的角色,为了揭示它在小麦抗逆中的作用,本文研究了上述两种材料两叶一心时TaGSk1基因在盐、ABA和冷胁迫的条件下的表达情况。其中1%NaCL胁迫处理的时间为0小时、1小时、3小时和12小时;100μM ABA胁迫处理的时间为0小时、0.5小时和1小时;4℃冷胁迫处理的时间为0小时、0.5小时和1小时。在肌动蛋白(actin)为内参的条件下,以半定量RT-PCR法研究表明,TaGSk1基因于逆境胁迫下的表达量在耐盐突变体RH8706—49和敏盐突变体H8706—34有显着的差别。 盐胁迫条件下,在敏盐的H8706-34中TaGSK基因的表达量1小时后与0小时的表达量相比没有明显的改变,3小时后TaGSK基因的表达量才明显提高,到胁迫12小时PaGSK基因的表达量有所下降;在耐盐的RH8706-49中TaGSK基因的表达量盐胁迫1小时后与未胁迫时的表达量相比几乎比胁迫前高了有6倍,表达量显着增加,胁迫3小时其表达量略有下降,但仍保持较高水平,12小时表达量才明显下降。ABA胁迫处理下,TaGSK基因的表达量在胁迫后0.5小时在上述两种材料中都立即增加,但胁迫1小时在在敏盐的H8706-34在敏盐的H8706-34仍略有增加,而在耐盐的RH8706-49中TaGSK基因的表达量有所下降。冷处理胁迫下,TaGSK基因的表达量在上述两种材料中的变化类似,都是在胁迫后0.5小时立即增加 这说明FaGSk1基因在小麦处于逆境条件下发挥着重要作用,不仅跟耐盐密切相关,而且与小麦逆境下的应答有很大的关系。 随着分子生物学的发展,用基因工程的方法培育抗盐小麦新品种成为小麦育种的新手段,也是有效的途径。本文的研究就为基因工程培育抗盐小麦奠定了基础。
杨立霞[5]2005年在《小麦糖原合成酶激酶（TaGSK1）的生化特性分析》文中研究指明本室前期的研究工作表明:小麦糖原合成酶激酶基因(TaGSK1)是小麦耐盐突变体RH8706-49中与耐盐相关的基因;将TaGSK1基因导入野生型拟南芥中研究其功能发现小麦糖原合成酶激酶TaGSK1具有增强植物细胞抗胁迫、渗透的能力;软件分析TaGSK1具有钙调素结合域。本实验从蛋白水平对TaGSK1蛋白的生化特性进行了研究。 构建原核表达载体pGEX-KG-TaGSK1,转化E.coli Xa90后经IPTG诱导融合蛋白可溶性表达,采用GST亲和层析柱进行目的蛋白纯化,获得纯度达到90%以上的Mr约为65kD的GST-TaGSK1融合蛋白。 对提纯的小麦糖原合成酶激酶TaGSK1进行生化特性的研究。首先利用天然电泳方法检测该蛋白与CaM的结合特性,后又用western bloting加以证。结果显示该蛋白表现出依赖于Ca~(2+)的与CaM结合的特性,而Ca~(2+)螯合剂EGTA处理会抑制TaGSK1与CaM的结合,对TaGSK1具有钙调素结合域的预测加以了试验证实,进一步明确了在Ca~(2+)存在的条件下,TaGSK1与CaM的结合。ScanProsite进行功能位点预测,TaGSK1蛋白在第51aa到75aa处具有ATP结合位点,第166aa到178aa处具有ser/thr蛋白激酶活性位点。检测该激酶的自磷酸化与底物磷酸化,以Histone Ⅲ-S作为蛋白激酶的底物,结果显示出该激酶不依赖于Ca~(2+)和CaM的自磷酸化与底物磷酸化的激酶活性。 蛋白质的可逆磷酸化过程在细胞的信号识别与转导中起重要作用,蛋白激酶主要催化蛋白质的磷酸化作用。综合试验结果表明,TaGSK1属于一种钙调素结合的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它在植物细胞抗胁迫、渗透的信号通路中发挥作用。
武玉清[6]2007年在《小麦耐盐相关性状的QTL分析》文中研究指明土壤盐渍化是影响作物产量和品质的自然逆境之一，培育耐盐品种是有效利用盐渍化土壤的一条根本途径。中国有盐渍化和次生盐渍化土地4千万hm~2以上，占我国耕地的1／10左右，严重影响了粮食产量，成为限制农业生产的主要因素。小麦是我国第二大粮食作物，对耐盐相关基因进行精确定位对于培育耐盐碱品种起着非常重要的作用。本研究选用耐盐性达一级的品种德抗961(DK961)与高产品种太空6号(TK6)进行杂交，以杂交形成的186个F_2单株、160个F_(2：3)家系为试验材料，其中F_2为作图群体，F_(2：3)家系及其双亲为耐盐性评价群体。采用SSR分子标记构建部分遗传连锁图。使用水培法对F_(2：3)家系通过发芽率、苗高、根长及鲜重四个性状进行苗期耐盐性鉴定，在此基础上对这四个性状进行初步QTL定位分析，研究结果如下：1．对发芽率、苗高、根长及鲜重耐盐指数进行正态分布检验，这四个性状均符合正态分布。因此这四个性状均符合QTL作图的要求。2．对发芽率、苗高、根长及鲜重耐盐指数这四个耐盐性状进行相关性分析，结果表明两两之间都存在极显着的正相关性。3．用54个SSR位点对186个F_2个体的基因组成进行分析，缺失数据共96个，占整个群体基因组成的0.96％，德抗961基因占整个群体基因组成的48.43％，太空6号基因占整个群体基因组成的50.61％，在0.05水平下进行X~2测验，符合1：1的比例，表明该群体是一个随机群体，适合进行QTL定位的遗传分析。4．使用Map Manager QTX 0.30软件对杂交组合德抗961和太空6号的F_2分离群体186个单株的54个SSR差异位点进行分析，构建了一张包含42个SSR位点，覆盖小麦基因组8条染色体共704.5cM，标记间平均间距为16.8 cM的遗传连锁图。5．用单一标记法和复合区间法对4个性状进行QTL分析。采用单一标记法在5A、5B、5D、3B和4D上检测到显着或极显着位点。采用复合区间法共检测到6个QTL，分别位于5AL、5BL、5DL染色体上。基因作用方式以显性为主，显性效应较大，加性效应较小。在染色体5D上检测到的QTL最多，共有3个QTL。其中SSR标记wmc326、barc141和wmc215与相邻QTL间的遗传距离小于5cM。两种检测方法得到的结果具有一致性。本研究所检测到的与QTL位点距离较近的SSR标记可望为进一步小麦耐盐分子标记提供参考信息。
裴自友, 温辉芹, 任永康, 王晋, 庄丽芳[7]2012年在《小麦的耐盐性及其改良研究进展》文中指出盐碱地是影响作物生产的主要因素,培育耐盐小麦品种是有效利用盐碱地、提高经济效益的最佳途径。就小麦耐盐机理、耐盐性鉴定方法、种质鉴定与品种选育、外源基因利用、耐盐性遗传和耐盐基因克隆等6个方面的研究现状进行了简要概述,提出了进一步改良小麦耐盐性的方法和对策。
杨小玲[8]2010年在《SeNHX1耐盐分子机制与耐盐洋桔梗培育》文中研究指明盐碱胁迫是造成世界农作物减产的主要原因。通过种植耐盐碱植物既能改良土壤，又有一定的效益，是一种相对耗资少，见效快的盐碱地农业发展方式。随着植物耐盐分子生物学的发展，植物耐盐基因工程在培育耐盐新品种中成为研究热点。本文在研究SeNHX1于酵母中的功能、定位和SeNHX1转基因烟草的耐盐性及耐盐机制的基础上，将SeNHX1转化洋桔梗，以期培育耐盐洋桔梗新品种。SeNHX1基因是从盐角草克隆得到。在研究中，构建了pYES2-SeNHX1，pYES2-GFP和pYES2-SeNHX1-GFP叁种酵母表达载体和pBin438-SeNHX1植物表达载体。带有SeNHX1目的基因的酵母表达载体转化酵母nhx1缺陷型菌株296H，可部分恢复Na~+的解毒功能，并提高野生型菌株W303的耐盐性；荧光观察表明，SeNHX1定位于酵母液泡膜。植物表达载体pBin438-SeNHX1转化烟草，过量表达SeNHX1的转基因烟草在离体和盆栽盐胁迫下，均可提高其耐盐性。盆栽盐胁迫下，经过相同盐量的处理，盆栽土Na~+含量大于9.7mg/g时，SeNHX1转基因烟草下部老叶Na~+含量比野生型相应部位的Na~+含量高2.3mg/g FW，嫩叶中的脯氨酸含量比野生型高0.36mg/g FW，两者均达到显着水平；而丙二醛（MDA）含量显着更低。这些结果可以初步推断SeNHX1转基因烟草提高其耐盐性的机制：首先，转基因烟草可吸收盐土中更多的Na~+，促进水份的吸收与利用。其次启动离子分配机制，将吸收的Na~+更多地积累于老叶，防止幼嫩组织受到Na~+的毒害；在细胞水平上，SeNHX1转基因烟草将更多Na~+的区隔化于液泡，防止膜脂和酶活性受到伤害。植物表达载体pBin438-SeNHX1转化洋桔梗，通过检测表明SeNHX1基因已经整合到洋桔梗基因组中，并实现转录。过量表达SeNHX1的转基因洋桔梗组培苗可在含有150mmol/L NaCl培养基中正常生长，叶片中脯氨酸含量比野生型高0.5mg/g FW，两者间达到显着差异，表现了更强的耐盐性。通过移栽管理，获得10株苗龄2个月的转基因洋桔梗。
张春宝[9]2010年在《栽培大豆非生物胁迫诱导的蛋白激酶基因GmGSK的克隆及功能分析》文中提出高盐、干旱、低温等非生物胁迫是影响作物产量的重要环境因素。植物通过长期进化逐渐形成特定的机制来抵御外界环境造成的胁迫,减轻对自身的伤害。其中蛋白激酶可通过对底物可逆的磷酸化来参与胁迫信号的传导,从而进一步调节外界胁迫对作物造成的伤害。因此,蛋白激酶在植物的抗逆途径中起到了非常重要的作用。我们以小麦的TaGSK1基因序列为探针,通过电子克隆在栽培大豆中得到一条类似糖原合成酶激酶的cDNA序列,并通过RT-PCR的方法将其克隆。序列分析表明,此cDNA包含一条1230bp的完整开放阅读框,编码410个氨基酸,估计的分子量为46.5kD,等电点PI为8.64。蛋白序列分析表明,其编码一个与GSK-3同源的蛋白,含有丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶活性位点,命名为GmGSK (Genbank登录号：FJ460228)。Southern杂交表明,GmGSK基因在栽培大豆基因组中至少有两个拷贝。Northern杂交显示,在栽培大豆的根、茎、叶、叶柄及子叶中均能表达GmGSK,但不同的组织器官中GmGSK基因的表达量不同,在根中分布较多。半定量RT-PCR分析结果显示,GmGSK基因的表达可以被NaCl、NaHCO3、干旱、ABA和低温所诱导,这表明GmGSK可能参与了大豆非生物胁迫的信号传导过程或对非生物胁迫的耐受。利用pCAMBIA1302构建GmGSK:GFP融合载体,通过农杆菌渗入法在烟草中叶片细胞中瞬时表达GmGSK:GFP融合蛋白。对GmGSK进行亚细胞定位发现,其分布在细胞膜与细胞质中。为了进一步研究其功能我们分别将其转入大肠杆菌(BL21)和酿酒酵母(INVScl)中,原核表达显示其蛋白大小确为46.5kD左右；在转GmGSK基因的酿酒酵母中,其对NaCl、NaHCO3和干旱等非生物胁迫的耐受能力明显强于非转基因酿酒酵母。最后,通过构建pCAMBIA3300-GmGSK植物双元表达载体,将GmGSK转入烟草,过量表达GmGSK基因,验证其在植物中的生物学功能。结果表明,在高盐胁迫下转基因植株的生长状态、相对生物量、根系发达程度与对照相比均得到了明显的提高。对转基因烟草和非转基因烟草植株共同浇灌适当浓度NaCl,结果显示转基因烟草能明显提高对高盐的耐受性,而非转基因烟草则在不久后死亡。对其生理指标进行测定显示,在盐胁迫下转基因烟草的可溶性糖含量增长幅度明显快于非转基因对照,而外渗相对电导率增长速率则明显慢于非转基因对照,这些有助于提高转基因烟草的耐盐性。以上结果表明,栽培大豆GmGSK基因在生物抵御外界非生物胁迫过程中有重要作用,过量表达GmGSK基因,能显着提高生物的抗逆性,这也为将来利用耐盐基因改善栽培大豆耐盐性方面,提供了一条新途径。
翟朝增[10]2011年在《小麦WTK蛋白激酶相互作用蛋白的筛选与TaNPK基因的分子生物学特性分析》文中研究指明土壤盐渍化、干旱、高温、低温和机械损伤等非生物逆境是影响作物安全生产的重要因素,克隆、筛选与作物抗非逆境协迫相关蛋白基因,在作物抗逆机理解析及应用上有重要的理论和实际意义。蛋白激酶主要催化蛋白质的磷酸化,在植物生长发育、光信号传导、雄性不育、激素调节、病原反应和非生物胁迫等生命活动中起着重要的调控作用。小麦蛋白激酶WTK是本实验室克隆到一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在模拟植物拟南芥中过表达能够显着提高拟南芥对盐和干旱胁迫的抗性,可能在植物的抗逆反应中发挥着重要的作用,但具体的生理功能尚未确认。本研究以盐处理的小麦cDNA文库为基础,进行了WTK相互作用蛋白的筛选与鉴定,并对筛选的一个与WTK可能相作的蛋白激酶TaNPK,进行了启动子功能分析和亚细胞定位,获得了如下主要研究结果:(1)小麦蛋白激酶WTK相互作用蛋白的筛选与鉴定:以WTK cDNA为诱饵,从盐处理的小麦cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白质,共获得了300多个克隆,通过β-galactosidase筛选分析,共得到108个可能互作的阳性克隆。酵母体内的互作验证发现,一个蛋白激酶TaNPK可能与WTK存在相互作用。(2)TaNPK基因启动子的功能分析:利用染色体步移技术从小麦中获得了TaNPK读码框上游2 004 bp的启动子序列,构建启动子缺失突变体,在PEG4 000介导下将重组质粒转入拟南芥叶片原生质体进行瞬时表达分析,以GUS为报告基因研究不同调控序列的活性及盐诱导性分析。PEG介导的拟南芥原生质体瞬时表达分析表明,5′端缺失片段都在不同程度上驱动了GUS的表达;经过NaCl处理后的原生质体,GUS的表达量比不经处理的对照组明显提高,这与NaCl处理下TaNPK的实时荧光定量分析结果一致。研究也发现,-1 083 ~ -1 296 bp区段可能含有响应盐胁迫的负调控元件。(3)TaNPK的亚细胞定位分析:构建TaNPK基因的GFP融合蛋白表达载体16318hGFP-TaNPK,在PEG介导下转化拟南芥原生质体,荧光共聚焦显微镜下观察发现,TaNPK蛋白定位在细胞膜上。因此,TaNPK可能作为一种类受体蛋白激酶参与细胞的抗逆反应。小麦WTK蛋白激酶互作蛋白的筛选结果为以后探讨WTK的生物学功能奠定了基础。分析盐胁迫下启动子活性有助于认识TaNPK基因的调控机制,为解析小麦抗盐机制提供理论依据。
参考文献：
[1]. 小麦耐盐突变体TaGSK1基因的分离和鉴定[D]. 徐涛. 河北师范大学. 2003
[2]. 小麦糖原合成酶激酶（TaGSK1）的亚细胞定位及其功能鉴定[D]. 吴立柱. 河北师范大学. 2004
[3]. 利用基因枪法将Tagsk1基因导入敏盐小麦成熟胚愈伤组织提高其耐盐性的研究[J]. 徐涛, 赵宝存, 葛荣朝, 沈银柱, 黄占景. 生物工程学报. 2006
[4]. 小麦耐盐相关基因TaGSK1的染色体定位及其逆境胁迫下的表达分析[D]. 李亚青. 河北师范大学. 2005
[5]. 小麦糖原合成酶激酶（TaGSK1）的生化特性分析[D]. 杨立霞. 河北师范大学. 2005
[6]. 小麦耐盐相关性状的QTL分析[D]. 武玉清. 中国农业科学院. 2007
[7]. 小麦的耐盐性及其改良研究进展[J]. 裴自友, 温辉芹, 任永康, 王晋, 庄丽芳. 作物研究. 2012
[8]. SeNHX1耐盐分子机制与耐盐洋桔梗培育[D]. 杨小玲. 天津大学. 2010
[9]. 栽培大豆非生物胁迫诱导的蛋白激酶基因GmGSK的克隆及功能分析[D]. 张春宝. 东北师范大学. 2010
[10]. 小麦WTK蛋白激酶相互作用蛋白的筛选与TaNPK基因的分子生物学特性分析[D]. 翟朝增. 西北农林科技大学. 2011