导读:本文包含了复发相关基因论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:基因,多态性,白血病,复发性,细胞,乳腺癌,半胱氨酸。
复发相关基因论文文献综述
崔双,唐禹馨,侯海静[1]（2019）在《复发性早期妊娠丢失与叶酸代谢相关基因多态性关系的研究》一文中研究指出目的探讨复发性早期妊娠丢失(EPL)与叶酸代谢相关基因多态性的相关性。方法选取2016年4月至2018年4月在舟山医院和舟山妇幼保健院妇产科就诊的复发性EPL患者84例为研究组,再选取正常分娩或者是妊娠结局正常的孕妇86例为对照组;采集DNA并检测两组亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T、A1298C位点、甲硫氨酸合成还原酶(MTRR)A66G位点的基因多态性,对不同基因的分布进行比较。结果两组MTHFR基因C677T中CC型、CT型和TT型分布差异有统计学意义(χ~2=7.212,P=0.027);两组MTHFR基因A1298C中AA型、AC型、CC型分布差异有统计学意义(χ~2=6.458,P=0.038)。两组MTRR基因A66G中AA型、AG型、CG型分布差异有统计学意义(χ~2=7.093,P=0.029)。结论复发性EPL与叶酸代谢相关基因多态性具有相关性。(本文来源于《中国妇幼健康研究》期刊2019年09期）
王紫薇[2]（2019）在《急性髓细胞白血病异基因移植后复发相关因素及机制研究》一文中研究指出急性髓细胞白血病(AML)是最常见的血液系统恶性肿瘤之一,异基因造血干细胞移植由于具有独特的移植物抗白血病效应,较常规化疗显着降低了AML患者的复发风险,可以改善患者预后[1],是目前唯一可能治愈急性髓细胞白血病的手段。近二十年来,随着移植技术不断进步,移植相关并发症和死亡率不断下降,但移植后复发率却没有明显降低[2],目前针对复发患者目前仍缺乏有效的治疗选择,因此患者一旦复发,预后极差。研究可能影响移植后复发及复发后生存的因素,对识别高危患者、早期给予有效干预措施具有重要临床意义。虽然异基因移植后供体免疫细胞介导的移植物抗白血病(GVL)效应可以降低复发风险,但仍有部分患者面临复发,既往研究认为这可能与患者体内残存的耐药白血病细胞有关。Lapidot等首次将AML患者标本中的CD34+CD38-细胞群分离后输注给联合免疫缺陷小鼠,重建了与人类临床表现相似的白血病小鼠模型,这群具有与正常造血干细胞相同免疫表型和生物学特性的细胞被命名为“白血病起始细胞(LIC)”[3]。此后许多研究发现,该群细胞参与白血病的发生发展、耐药、复发等各个阶段[4][5][6],患者体内白血病起始细胞的负荷也是影响预后的重要因素[7][8]。虽然LIC与白血病复发关系的研究越来越得到重视,但该群细胞在异基因移植后复发中的作用研究较少,而异基因移植后复发模型是从早期阶段开始研究白血病起始细胞生物学行为变化的优质模型,因此研究此类细胞的生物学特性及其与异基因移植后复发的关系并探索可能的治疗靶点具有重要意义。基于以上研究背景,我们对AML患者异基因移植后复发及复发后生存相关因素进行了比较分析,并首次利用小鼠急性髓细胞白血病异基因移植后复发模型,研究了白血病起始细胞与移植后复发的关系,发现白血病起始细胞表面高表达的C-Kit分子通过上调STAT3磷酸化使PD-L1高表达,从而使该群细胞对供体免疫细胞介导的GVL效应不敏感,可以在移植后复发早期快速增殖而导致白血病复发,酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼治疗可以下调白血病起始细胞表面PD-L1的表达、延长小鼠生存,为急性髓细胞白血病移植后复发的治疗提供了新思路。第一部分:急性髓细胞白血病异基因移植后复发及复发后生存相关因素分析一、实验方法纳入2001年3月至2015年8月在长海医院或瑞金医院接受异基因移植治疗并生存超过100天的急性髓细胞白血病患者218例。分析患者年龄、性别、细胞遗传学/分子学预后分层、供受体性别关系、供体类型、移植前疾病状态、预处理方案、急性移植物抗宿主病(a GVHD)和慢性移植物抗宿主病(c GVHD)、移植物中单个核细胞数等因素对移植后复发率及复发后生存率的影响。单因素分析及多因素分析采用COX比例风险模型,将单因素分析P值小于0.1的因素纳入多因素分析,总生存率(OS)、复发后生存率(pr OS)及无事件生存率(EFS)计算采用KaplanMeier分析法、Log-Rank检验,累积复发率计算采用竞争风险模型、Gray检验,患者信息组间比较采用秩和检验、卡方检验或Fisher精确概率法,P<0.05认为有统计学意义。二、结果:(一)218例患者中男性123例、女性95例,中位年龄36(14-62)岁,中位随访时间21.5(3.4-179.6)个月。叁年OS 62.0%(95%CI 55.0%-69.0%),EFS 54.9%(95%CI 47.9%-61.9%),累积复发率30.2%(95%CI 23.7%-36.7%)。67例(31.02%)患者移植后确诊a GVHD,103例(47.69%)确诊c GVHD。截止随访终点共62例患者复发,中位复发时间5.23(2.17-42.20)月,复发后1年pr OS 33.7%(95%CI 20.6%-46.9%),2年pr OS 16.0%(95%CI 4.9%-27.1%)。(二)移植后复发相关因素:单因素分析显示移植前非CR1状态、半相合移植、男供女移植、移植后发生c GVHD及输注更多单个核细胞是可能影响移植后复发的因素。多因素分析显示移植前非CR1状态[CR2/3 HR 4.62(2.37-8.99),P<0.001;NR HR 3.31(1.75-6.24),P<0.001]是复发的危险因素,而移植后发生c GVHD[局限型HR 0.40(0.21-0.77),P=0.006;广泛型HR 0.33(0.13-0.82),P=0.018]与较低的移植后复发率相关。(叁)影响复发后总生存率的因素:在单因素分析中,移植前疾病状态、细胞遗传学/分子学危险分层、半相合移植、女供男移植、减低强度预处理、移植后发生c GVHD及复发出现在移植2年后是可能影响复发后生存的因素;多因素分析显示复发时伴c GVHD[HR 0.23(0.10-0.52),P<0.001]及复发出现在移植2年后[HR 0.11(0.03-0.43),P=0.001]的患者pr OS更高。叁、结论(一)移植前非CR1状态是复发的重要危险因素(二)移植后发生c GVHD的患者不仅复发率更低,而且复发时有c GVHD症状的患者复发后生存率也更高(叁)移植后晚期复发的患者复发后生存率更高第二部分:C-Kithigh细胞分离鉴定及干性特征研究一、材料方法(一)实验动物及细胞白血病受鼠为BALB/C雌鼠,白血病细胞为BALB/C小鼠来源携带AML1-ETO融合基因及C-Kit N882K突变的急性髓细胞白血病细胞系,并携带GFP荧光标记。(二)C-Kithigh细胞分离鉴定流式分选获得Lin-GFP+Sca-1-C-Kithigh和GFP+Sca-1-C-Kitlow的细胞。两群细胞分别取1×105个细胞以M3234培养基培养,每孔接种细胞1×104个。9-10天后荧光显微镜下计数C-Kithigh和C-Kitlow细胞形成的集落数,比较两者体外克隆形成能力。同样方法分选获得C-Kithigh与C-Kitlow细胞,分别给予BALB/C雌鼠尾静脉注射10个/只、100个/只或1000个/只,比较极限稀释后两群细胞重建小鼠白血病的能力。(叁)细胞凋亡检测给予小鼠尾静脉输注未分选白血病细胞1000个/只,定期处死白血病鼠并获取新鲜骨髓细胞1×106个,以Lin、C-Kit、Sca-1标记,以Annexin V/PI或Annexin V/7-AAD凋亡试剂盒标记后流式检测白血病细胞凋亡情况。同时流式分选获得Lin-GFP+Sca-1-C-Kithigh和GFP+Sca-1-C-Kitlow的细胞,提取蛋白后按照Western Blot标准流程检测比较两群细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2的表达情况。(四)细胞周期检测给予小鼠尾静脉注射未分选白血病细胞1000个/只,定期处死白血病鼠获取新鲜骨髓细胞1×106个,以Lin、C-Kit、Sca-1标记后Lysing Solution固定裂红,TF Fix/Perm Buffer工作液固定穿膜,Ki-67、Hoechst33342标记后流式检测细胞周期分布。G0期细胞表型为Ki67-Hoechst-,G1期为Ki67+Hoechst-,S/G2/M期为Ki67+Hoechst+。(五)细胞周期及凋亡相关基因表达水平检测受体BALB/C小鼠接受未分选白血病细胞1000个/只,造模第14天处死小鼠,流式分选得到Lin-GFP+Sca-1-C-Kithigh和GFP+Sca-1-C-Kitlow的细胞,分别加入TRIzol提取RNA,使用RR036A Takara Prime Script?RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒反转录得到c DNA,RT-PCR引物序列见附表,使用SYBR Green q PCR Master Mix试剂盒进行q RT-PCR检测。(六)比较C-Kithigh与C-Kitlow细胞诱导的白血病小鼠模型外周血CD3+T细胞和CD3+CD4+T细胞表面共刺激分子表达情况随疾病进展的变化分别建立C-Kithigh细胞诱导的白血病模型和C-Kitlow细胞诱导的白血病模型,于造模前、造模后第7、14、21天采集外周血,裂红后以CD3、CD4、CD28、CTLA4、PD-1,ICOS标记后,流式检测两组小鼠外周血CD3+T细胞和CD3+CD4+T表面CD28、PD-1、CDLA4和ICOS的表达情况。(七)数据分析统计结果计量资料以均数±标准差表示,两组间均数比较采用student-t检验,不符合t检验的数据采用秩和检验,多组间均数比较采用单因素ANOVA分析,计数资料结果以例数(百分比)表示,生存分析采用Kaplan-Meier分析,Log-rank检验比较,P值<0.05认为有统计学意义。根据小鼠骨髓中GFP+白血病细胞百分比将白血病发病分为叁个阶段:早期即骨髓GPF+细胞百分比≤10%,中期即骨髓GFP+细胞百分比大于10%小于30%,晚期即骨髓GFP+细胞百分比≥30%。二、结果(一)C-Kithigh细胞较C-Kitlow细胞具有更强的体外克隆形成能力及小鼠白血病重建能力。C-Kithigh细胞形成的集落数量更多,体积更大,C-Kithigh与C-Kitlow细胞形成的集落数分别为14.3±8.1个/1×104个细胞和2.9±1.8个/1×104个细胞(P<0.001)。接受10个/只细胞输注的小鼠全部未发病,输注C-Kithigh细胞100个/只的小鼠发病率70.59%(12/17),发病小鼠中位生存时间29(22-48)天,接受C-Kitlow细胞100个/只的小鼠白血病发病率为33.33%(6/18),发病小鼠中位生存时间35(29-70)天(P=0.011)。输注C-Kithigh细胞1000个/只的小鼠全部发病,中位生存时间27(22-41)天,接受C-Kitlow细胞1000个/只的小鼠白血病发病率77.27%(17/22),发病小鼠中位生存时间31(23-53)天(P=0.002)。(二)C-Kithigh与C-Kitlow细胞凋亡比例均随疾病进展呈升高趋势,但同一发病阶段两群细胞凋亡情况未见明显差异。两群细胞在疾病发生的各个阶段均仅有PI-Annexin V+的凋亡细胞而无PI+Annexin V+的凋亡细胞,两群细胞凋亡比例均随着疾病进展而增加,但在同一发病阶段,两群细胞凋亡比例均未见明显差异(早/中/晚期比较P值分别为0.479/0.673/0.587)。Western Blot方法检测Caspase-3及Bcl-2的蛋白表达水平,结果提示C-Kithigh及C-Kitlow细胞中均未见活化的Caspase3片段(cleaved-Caspase3),Bcl-2蛋白表达在两群细胞间差异不明显。(叁)C-Kithigh细胞处于增殖期的比例始终高于C-Kitlow细胞。随着疾病进展,两群细胞G0期比例均升高,C-Kitlow细胞处于G0期的比例始终高于C-Kithigh细胞(早/中/晚期比较的P值分别为<0.001/0.005/0.029)。随着疾病进展,两群细胞G1/S/G2/M期及S/G2/M期比例均呈下降趋势。在白血病发病各个阶段,C-Kithigh细胞G1/S/G2/M期及S/G2/M期比例均高于C-Kitlow细胞(G1/S/G2/M期比例早/中/晚期比较的P值为0.002/0.034/0.029;S/G2/M期比较P值分别为0.038/0.022/0.029)。(四)C-Kithigh细胞高表达周期正性调控基因及凋亡抑制基因,低表达周期负性调控基因。细胞周期相关正性调控基因Cyclin D2、Cyclin D3在C-Kithigh细胞中表达明显高于C-Kitlow细胞(P值分别为0.048、0.049),细胞周期的负性调控基因P16及P57在C-Kithigh细胞中表达更低(P值分别为0.036、0.050),而凋亡抑制基因Bcl-2在C-Kithigh细胞中高表达(P=0.047)。(五)C-Kithigh细胞诱导的白血病小鼠与C-Kitlow细胞诱导的白血病小鼠外周血T细胞表面共刺激分子表达未见明显差异。比较C-Kithigh细胞诱导的白血病小鼠与C-Kitlow细胞诱导的白血病小鼠外周血CD3+T细胞和CD3+CD4+T细胞表面CD28、ICOS、PD-1及CTLA4的表达情况,结果提示不同发病阶段两组间比较均无明显差异。但在两种白血病小鼠模型中CD3+CD4+CD28+T细胞比例均随着疾病进展明显下降,C-Kithigh组从造模前53.43%降至36.73%(P=0.050),C-Kitlow组从造模前58.60%降至31.58%(P=0.018)。两组CD3+CD4+T细胞PD-1表达均随疾病进展而升高,C-Kithigh组从2.97%升高至7.40%(P<0.001),C-Kitlow组从3.71%升高至7.88%(P<0.001),两组CD3+T细胞PD-1表达均随疾病进展而升高,C-Kithigh组从3.64%升至8.51%(P=0.001),C-Kitlow组从4.20%升高至9.75%(P=0.001)。叁、结论(一)免疫表型为Lin-GFP+Sca-1-C-Kithigh的白血病细胞比表型为GFP+Sca-1-CKitlow的细胞具有更强的体外克隆形成能力和小鼠白血病重建能力,表明其具有更多早期干祖细胞特性(二)随着疾病进展,C-Kithigh与C-Kitlow细胞均呈现增殖受抑、凋亡增加,但C-Kithigh细胞增殖比例始终高于C-Kitlow细胞(叁)C-Kithigh细胞诱导的白血病模型与C-Kitlow细胞诱导的白血病模型外周血T细胞共刺激分子表达在疾病各个阶段均未见明显差异,但是两组均可见CD3+CD4+CD28+T细胞比例随疾病进展而降低,PD-1表达升高第叁部分:C-Kithigh细胞在AML异基因移植后复发中的作用及相关机制研究一、材料方法(一)实验动物及细胞异基因造血干细胞移植供体为8-9周C57BL/6(H2Kb)雌鼠,受体为10-11周BALB/C(H2Kd)雌鼠,白血病细胞系同第二部分。(二)小鼠急性髓细胞白血病异基因移植后复发模型建立受鼠接受8Gy TBI预处理后7小时尾静脉输注供体来源细胞,根据分组BL组小鼠接受供体去T骨髓(TCD-BM)细胞5×106/只+白血病细胞1×104/只,GVL组小鼠接受供体TCD-BM细胞5×106/只+脾细胞2.5×106/只+白血病细胞1×104/只。(叁)研究C-Kithigh细胞在移植后复发中的作用及可能的机制流式分选得到C-Kithigh与C-Kitlow细胞,步骤同第二部分,分别构建Kithigh-BL小鼠模型、Kitlow-BL小鼠模型、Kithigh-GVL小鼠模型及Kitlow-GVL小鼠模型,观察四组间生存差异。利用未分选白血病细胞构建BL小鼠模型与GVL小鼠模型,移植后第9、11、15、21天处死BL组小鼠,移植后第21、28、35、42天处死GVL组小鼠,获取新鲜骨髓细胞,凋亡及周期检测同第二部分,白血病细胞表面配体分子检测:获取白血病小鼠新鲜骨髓细胞以Lin、C-Kit、Sca-1、PD-L1和ICOSL标记后流式检测。比较BL组来源与GVL组来源C-Kithigh细胞周期、凋亡及PD-L1、ICOSL的表达差异,探索GVL效应下C-Kithigh细胞生物行为的改变。(四)阻断PD-1/PD-L1通路联合酪氨酸激酶抑制剂治疗白血病小鼠复苏白血病细胞步骤同前,给予BALB/C小鼠尾静脉注射1×104/只,造模第1、5、9、13、17天给予小鼠PD-L1单抗400ug/只腹腔注射,造模第1天起开始给予达沙替尼20mg/kg·天灌胃治疗,直至对照组开始出现小鼠死亡,比较空白对照组、达沙替尼单药组、PD-L1单抗单药组及联合用药组小鼠生存差异。(五)蛋白印迹法检测STAT3及MAPK(Erk)磷酸化水平处死白血病小鼠,流式无菌分选得到Lin-GFP+Sca1-C-Kithigh、GFP+Sca1-CKitlow、GFP+PD-L1high、GFP+PD-L1low的细胞。提取蛋白后以Peggy Sue全自动多功能蛋白定量分析系统检测STAT3、p STAT3、Erk及p Erk的表达。最后根据p STAT3峰面积与STAT3峰面积的比值(千分比)表示磷酸化水平。(六)统计分析统计方法同第二部分。二、结果(一)GVL组生存较BL组明显延长,Kithigh-GVL组小鼠生存明显较Kitlow-GVL组更短BL组与GVL组小鼠移植后复发率均为100%,BL组小鼠中位生存时间19(15-20)天,GVL组小鼠中位生存时间39(30-52)天(P<0.001)。Kithigh-BL组小鼠中位生存时间20(19-21)天,Kitlow-BL组小鼠中位生存时间21(19-24)天,两组间生存未见明显统计学差异(P=0.076),而Kithigh-GVL组中位生存时间32(24-54)天,Kitlow-GVL组中位生存时间51(31-58)天,Kithigh-GVL组小鼠生存时间更短(P=0.008)。(二)GVL组细胞凋亡比例较BL组更高,但组内比较C-Kithigh细胞与C-Kitlow细胞凋亡无明显差异BL组及GVL组来源白血病细胞在复发各个阶段均仅可见少量PI-Annexin V+凋亡细胞。BL组C-Kithigh及C-Kitlow细胞凋亡比例在复发各个阶段均未见明显差异,GVL组两群细胞凋亡同样未见明显差异(BL组早/中/晚期比较的P值0.674/0.174/0.212;GVL组早/中/晚期比较的P值0.343/0.877/0.561)。组间比较细胞凋亡情况,结果提示在复发中晚期GVL来源Kithigh细胞凋亡明显多于BL来源Kithigh细胞(早/中/晚期比较P值0.486/0.025/0.011),复发中期GVL来源Kitlow细胞凋亡较BL来源Kitlow细胞更多(早/中/晚期比较P值0.943/0.012/0.200)。(叁)比较C-Kithigh与C-Kitlow细胞在BL组与GVL组间周期分布的差异BL组中C-Kithigh细胞G0期比例始终较C-Kitlow细胞更低(早/中/晚期P值分别为0.026/0.028/<0.001),G1/S/G2/M期比例更高(P值分别为0.133/0.032/<0.001)、S/G2/M期比例更高(早/中/晚期P值<0.001/0.002/<0.001)。GVL组内比较同样发现C-Kithigh细胞G0期比例更低、增殖期比例更高(G0期比较P值分别为0.029/0.004/0.003,G1/S/G2/M期比较P值为0.029/0.007/0.002,S/G2/M期比较P值为<0.001/0.002/0.009)。比较移植后复发过程中BL组与GVL组来源C-Kithigh细胞周期分布的差异,发现复发早期BL来源Kithigh细胞G2/S/M期比例明显高于GVL来源(P=0.016),两组间Kithigh细胞G0期及G1/S/G2/M期比例无明显统计学差异。比较C-Kitlow细胞周期分布在BL组与GVL组间的差异,发现复发早期阶段BL来源Kitlow细胞S/G2/M期及G1/S/G2/M期比例均明显高于GVL来源(P=0.002,P=0.028),BL来源Kitlow细胞G0期比例明显低于GVL组(P=0.002)。(四)C-Kithigh细胞PD-L1表达高于C-Kitlow细胞对BL组C-Kithigh细胞与C-Kitlow细胞表面PD-L1、ICOSL表达情况比较发现,在疾病各个阶段C-Kithigh细胞表面PD-L1表达均高于C-Kitlow细胞(早/中/晚期比较P值0.017/0.038/0.038),GVL组C-Kithigh细胞表面PD-L1表达同样持续高于C-Kitlow细胞(早/中/晚期P值分别为0.015/0.002/0.001)。对移植后复发各个阶段BL来源Kithigh细胞与GVL来源Kithigh细胞表面PDL1、ICOSL的表达进行比较,发现不同来源Kithigh细胞表面分子表达未见明显差异,同样不同来源Kitlow细胞表面PD-L1、ICOSL的表达也未见明显差异。(五)达沙替尼治疗延长白血病小鼠生存达沙替尼单药治疗组小鼠中位生存时间27(26-28)天,较空白组生存明显延长[中位生存时间23(21-24)天,(P<0.001)],但PD-L1单抗单药治疗并未能使小鼠获得生存获益[24(22-26)天,(P=0.141)],达沙替尼联合PD-L1单抗治疗组小鼠生存较达沙替尼单药组稍有延长[中位生存时间28(26-31)天,(P=0.027)]。(六)C-Kithigh细胞通过JAK/STAT通路诱导PD-L1高表达Lin-GFP+Sca1-C-Kithigh细胞中STAT3磷酸化水平明显高于C-Kitlow细胞,GFP+PDL1high细胞中STAT3磷酸化水平明显较GFP+PD-L1low细胞更高,给予白血病小鼠达沙替尼治疗后C-Kithigh细胞表面PD-L1表达较对照组明显下调[发病早、中、晚期比较分别为26.8%±4.1%和49.8%±13.5%(P=0.047)、27.3%±4.6%和40.9%±1.6%(P=0.009)、21.6%±7.7%和36.3%±9.7%(P=0.110)],但两组来源C-Kitlow细胞的PD-L1表达差异不明显。叁、结论(一)C-Kithigh细胞通过上调STAT3磷酸化介导PD-L1高表达,使其对供体淋巴细胞介导的细胞周期阻滞更不敏感,导致该群细胞在异基因移植后复发早期可以快速增殖,介导白血病复发(二)酪氨酸激酶抑制达沙替尼治疗可以下调C-Kithigh细胞PD-L1表达水平,延长白血病小鼠生存(本文来源于《中国人民解放军海军军医大学》期刊2019-05-01）
班彦杰[3]（2019）在《不明原因复发性流产与叶酸代谢相关基因多态性及血清HCY、叶酸的关系》一文中研究指出背景和目的复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是一种复杂的疾病。尽管国内将其定义为发生3次及以上的妊娠丢失,但多数专家认为发生2次自然流产者即应给予重视并进行评估,因其再次发生自然流产的可能与3次者相近[1]。而且美国生殖医学协会将RSA定义为2次或2次以上发生在20周之内的妊娠失败[2,3],其中早期流产发生在妊娠12周之前,晚期流产发生在妊娠12~20周[4]。RSA在育龄期女性中的发生率为3%~5%,而RSA患者再次妊娠的自然流产发生率高达70%~80%[5]。RSA病因复杂多样,除遗传、解剖异常、内分泌紊乱、感染、自身免疫、精子质量、生活方式、精神心理及环境等因素外[1,6-9],仍有50%~75%的RSA仍病因不明,称为不明原因的复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)[6]。大量研究表明URSA与基因多态性有关,如:PAI-1、FVL、FII、MTHFR、MTRR等[10],较受关注的是MTHFR、MTRR。有人提出,MTHFR A1298C和C677T、MTRR A66G这两种多态性的突变可能影响亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶还原酶的活性,并影响同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)的代谢,从而导致高同型半胱氨酸血症和血栓形成倾向[10]。高同型半胱氨酸血症可造成血管内皮损伤,导致血栓形成[11],而胎盘动脉栓塞所致的胚胎血供不足、绒毛坏死,最终可导致流产发生[12]。URSA的复发风险随着流产次数的增加而上升[13],给家庭及社会带来严重的影响,但目前临床上缺乏有效预测URSA发生的指标。目前许多研究认为URSA的发生与血栓前状态有关[14-20],约50%-65%的RSA患者被诊断为血栓前状态[18],而血清HCY升高可导致血栓形成,而叶酸(folic acid,FA)作为HCY代谢中的重要原料[17],孕妇体内缺乏后也可导致高同型半胱氨酸血症,从而导致流产。尽管已有研究报道了MTHFR A1298C和C677T、MTRR A66G多态性与URSA的关系,但是结果并不一致[3,21-23]。本研究采用更大的样本量进一步研究MTHFR和MTRR基因多态性与URSA的关系,期望发现URSA的遗传风险因素;通过对不明原因复发性流产孕妇及同期正常孕妇血清中HCY、叶酸的水平进行检测,旨在探讨孕妇血清中HCY、叶酸在预测URSA发生中的价值,为URSA的预防和治疗提供新的依据。资料和方法1研究对象和分组1.1选取2016年9月—2018年2月于郑州大学第叁附属医院进行围产保健的URSA患者218例,对照组264例,统计其一般临床资料(民族、吸烟、饮酒、孕前体质指数)并检测其MTHFR基因的C677T、A1298C位点和MTRR基因A66G位点的序列。1.1.1入组标准:对照组:至少有过一次正常妊娠,且无自然流产病史;URSA组:有2次及2次以上的自然流产病史(且被诊断为复发性流产[2])。1.1.2排除标准:经妇科检查、B超、子宫输卵管造影等检查确诊生殖器解剖学畸形;妊娠早期服用致畸药物史;夫妇双方及胚胎染色体出现异常;胃肠手术史及严重的肝肾功能不全、消化系统疾病病史;糖尿病、冠心病、恶性肿瘤、甲状腺疾病、免疫系统或血液系统疾病史;生殖道病原微生物感染。1.2选择2018年1月—2018年12月在本院检查的不明原因复发性流产孕妇120例(URSA组),包括早期流产组(<12周,60例)、晚期流产组(12~20周,60例)[4],连续2次自然流产者90例,连续3次及以上自然流产者30例;同期常规围产保健的孕妇140例(对照组)汉族妇女,统计其一般临床资料(民族、吸烟、饮酒、孕前体质指数)并检测血清HCY、叶酸水平。入组标准、排除标准同1.1.1和1.1.2.本研究已获得郑州大学第叁附属医院医学伦理委员会的批准,所有参与者均已签署知情同意书。2取样及检测方法2.1受检者漱口后,利用拭子在其一侧口腔颊粘膜反复刷取数次,收集218例URSA患者和264例对照妇女的口腔粘膜上皮的脱落细胞,利用荧光定量PCR技术检测其MTHFR基因的C677T、A1298C位点和MTRR基因A66G位点的序列.2.2采集120例有自然流产史且本次不明原因自然流产患者和140例对照组妇女的空腹静脉血,利用化学发光法测定血清叶酸水平,循环酶法测定血清HCY水平。3统计学方法采用SPSS21.0软件进行统计学分析,定性资料(如民族频率、吸烟饮酒率等)采用χ2检验、Fisher精确检验;所有计量资料正态分布则采用?x±s表示,非正态分布则采用中位数(M)和四分位数(IQR)表示,组间独立样本的比较采用t检验、校正t检验及秩和检验。统计482例妇女样本的基因型频数,对其进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验,采用χ2检验(n≥40和期望值≥5)和Fisher精确检验(n<40或期望值<1)分析样本中基因各位点的基因型和等位基因的分布,计算比值比(OR)并在95%置信区间(95%CI)内呈现。用特异度和灵敏度检验预测URSA的价值,再应用受试者工作特征(ROC)曲线及约登指数评判每个血清指标的预测价值,并确定相应的预测界值。最后根据各单项血清指标的预测界值通过logistic方程建立联合预测因子,以联合预测因子作为检验变量,以是否为URSA作为状态变量绘制ROC曲线,并计算约登指数。以P<0.05认为差异有统计学意义。结果1不明原因复发性流产与叶酸代谢相关基因多态性的关系1.1 URSA组妇女叶酸代谢障碍人群明显高于对照组(P=0.041),差异有统计学意义,且有风险者中高风险患者最多。1.2 URSA组妇女的MTHFR C677T位点T等位基因频率显着高于对照组(OR=1.324,95%CI 1.014-1,729,P=0.039),且CC+CT基因型在URSA组中表达显着降低(OR=0.678,95%CI 0.471–0.974,P=0.035);URSA组患者MTHFR 1298位点C等位基因频率显着高于对照组(OR=1.557,95%CI 1.066–2.275,P=0.021),且AC和AC+CC基因型在URSA组中的表达均高于对照组(OR=1.820,95%CI1.169–2.834,P=0.008;OR=1.740,95%CI 1.137–2.661,P=0,010),差异有统计学意义;URSA组MTRR A66G位点AG和AG+GG基因型频率均高于对照组(OR=1.512,95%CI 1.047–2.185,P=0.027;OR=1.469,95%CI 1.024-2.107,P=0.036),差异有统计学意义。1.3 URSA组中MTHFR 677CT/1298AC复合基因型频率是对照组的6.589倍(P=0.001);URSA组患者携带2个突变基因者最多(69.3%),且明显高于对照组(OR=4.996,95%CI 1.650–15.129,P=0.002)。2妊娠期妇女血清HCY、叶酸水平及联合预测不明原因复发性流产发生的价值2.1自然流产2次、≥3次患者分别与对照组相比,年龄、血清HCY水平差异均有统计学意义(P<0.05),且随流产次数增加,血清HCY水平呈上升趋势;自然流产≥3次者比自然流产2次者发生更早,两者相比差异有统计学意义(P=0.000).2.2早期URSA组与早期对照组孕妇的年龄(33.50(31.00-36.00)vs28.00(28.00-30.00)岁,P=0.000)、血清HCY(7.50(6.90-8.50)vs 6.50(5.60-6.90)μmol/L,P=0.000)、叶酸水平(30.86(25.57-42.48)vs 23.14(15.81-24.00)nmol/L,P=0.000)相比,差异有统计学意义;晚期URSA组与晚期对照组孕妇年龄(32.10±5.60 vs 28.78±4.24岁,P=0.000)、血清叶酸水平(19.46(15.45-33.40)vs34.96(20.40-41.90)nmol/L,P=0.001)相比,差异有统计学意义;2.3分别以HCY+FA、HCY+年龄、FA+年龄、HCY+FA+年龄的联合预测因子作为检验变量绘制ROC曲线并计算约登指数,在各自的预测界值下,曲线下面积分别为0.672、0.783、0.770、0.782,约登指数分别为0.348、0.533、0.571、0.533。结论1 MTHFR C677T和A1298C、MTRR A66G位点基因突变是URSA发生的危险因素。2孕妇血清FA水平联合年龄对URSA的发生具有更高的预测价值。(本文来源于《郑州大学》期刊2019-05-01）
曾星,于洁[4]（2018）在《儿童急性淋巴细胞白血病复发相关基因突变的研究进展》一文中研究指出儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤之一。随着大剂量联合化疗方案的不断改进,对危险因素的认识不断深入,基于危险因素的分层化疗的实施,以及支持治疗保障的提高,儿童ALL治疗效果得到了显着提高。发达国家儿童ALL的5年生存率可达90%以上,但仍有8%～20%患儿复发。ALL患儿首次复发后即使采取积极的增强化疗及异基因造血干细胞移植治疗,仅有少数患儿可以得到长期生存[1]。疾(本文来源于《现代医药卫生》期刊2018年23期）
孙依依[5]（2018）在《研究发现ER阳性乳腺癌复发相关的基因突变》一文中研究指出大型基因组学分析发现特定DNA突变与ER阳性乳腺癌高复发风险相关,而有些基因突变与较好预后相关,或可帮助预测哪些患者可能出现复发转移,从而指导治疗决策。(Nat Commun.2018,9:3476.doi:10.1038/s41467-018-05914-x)美国每年诊断超过266 000例乳腺癌患者,其中约70%为ER阳性乳腺癌,ER阳性乳腺癌有多种阻断ER延缓肿瘤生长的治疗选择,内分泌治疗有效且毒性较小,但有些患者会发生(本文来源于《抗癌之窗》期刊2018年05期）
金鹏,冯虎,刘倩倩,胡媛媛,陈玉丙[6]（2018）在《早期非小细胞肺癌高复发风险相关基因的生物信息学分析》一文中研究指出目的通过生物信息学方法筛选早期非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)高复发风险的潜在标志基因。方法在Gene Expression Omnibus数据库(GEO)选定NSCLC患者基因表达芯片GSE19804,利用在线GEO2R软件确定早期NSCLC中的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)及在早期和晚期中的DEGs;另选定基因表达芯片GSE30219分析NSCLC复发高风险的DEGs;利用DAVID在线数据库对上述确定的与早期NSCLC复发相关的DEGs进行Gene Ontology(GO)和信号通路富集分析;使用STRING在线数据库进行蛋白相互作用(proteinprotein interaction,PPI)网络构建,再利用SYTOSCAPE软件分析获得高得分的枢纽基因,并进行PPI网络的模块分析;采用Kaplan-Meier plotter在线数据库进行生存分析,验证上述枢纽基因可靠性。结果获得早期NSCLC差异基因441个,在NSCLC早期与晚期表达差异的基因26个,与复发相关差异基因126个,最终获得了早期NSCLC高复发风险相关DEGs 10个;富集分析显示,DEGs富集在细胞分裂、细胞周期、细胞增殖和p53信号途径;构建差异基因PPI网络后得到6个枢纽基因:TOP2A、RRM2、CCNB1、DLGAP5、ANLN和CDCA7;生存分析显示,枢纽基因的高表达与患者较差的总生存率显着相关。结论 TOP2A、RRM2、CCNB1、DLGAP5、ANLN和CDCA7可能作为潜在的早期NSCLC高复发风险生物标记物。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2018年01期）
符梅,许文明,覃太周,徐克惠[7]（2017）在《miRNA成熟相关基因DICER、DROSHA、RAN基因多态性与不明原因复发流产的相关性研究》一文中研究指出目的探讨miRNA成熟关键基因DICER、DROSHA和RAN的基因多态性与女性复发流产的相关性。方法收集2013年6月至2015年12月于四川大学华西第二医院就诊的不明原因复发流产(URSA)患者共217例,至少有1次生育史的育龄妇女为正常对照组390例,对照组为同期进行体检和孕前检查育龄妇女。采用病例对照研究的方法,应用PCR-限制性片段长度多态性技术检测miRNA成熟过程中关键基因DICER rs3742330、DROSHArs10719和RAN rs14035单核苷酸多态性。结果 DICERrs3742330,DROSHArs10719和RANrs14035各等位基因和基因型频率在URSA组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)。联合分析发现,DICERrs3742330/DROSHArs10719GG/TT+TC协同会增加复发流产的风险(OR=1.657,95%CI=1.006~2.731,P=0.047)。虽然DICERrs3742330/RANrs14035GG/TT+TC在URSA组较对照组增高,但差异无统计学意义(OR=1.977,95%CI=0.956~4.087,P=0.066),而DROSHA10719/RAN14035TT+TC/TT+TC与复发流产无相关性(OR=0.958,95%CI=0.679~1.353,P=0.808)。结论DICERrs3742330联合DROSHA rs10719可能与URSA相关。(本文来源于《四川大学学报(医学版)》期刊2017年06期）
吴丰苏,汪玉红,刘青,黄萍,孙茂[8]（2017）在《IL-23受体基因单核苷酸多态性与复发性口腔溃疡相关》一文中研究指出目的探讨白细胞介素23受体(IL-23R)基因单核苷酸多态性与复发性口腔溃疡(ROU)的易感性。方法选取ROU患者42例及年龄、性别匹配的86例正常人,采用应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术检测rs11465817和rs1343152基因型。用卡方检验统计两组等位基因和基因型的频率,计算比数比(OR)和95%置信区间(95%CI)评价多态性位点与ROU的遗传易感性。结果 rs1343152位点等位基因和基因型频率在病例组和对照组间差异无统计学意义;rs11465817位点差异显着(OR=2.715,95%CI=1.543~4.777),AA+AC基因型可增加患ROU的易感性2.44倍。结论IL-23R基因rs11465817位点单核苷酸多态性与ROU易感性相关。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2017年10期）
于洋,梁栋,吕峰,杨秦蘅,申鹏[9]（2017）在《负性情绪相关基因在乳腺癌复发与转移中的检测价值研究》一文中研究指出目的研究与观察负性情绪相关基因在乳腺癌复发与转移中的检测价值。方法选取48例乳腺癌术后复发转移患者为观察组,同期的48例未发生复发转移的患者为对照组,然后将两组的5-HTTLPR及NPY2R基因型分布频率及血浆氨基酸类神经递质水平进行比较,并比较观察组中不同复发转移情况者的检测结果,同时以Logistic分析上述研究指标与乳腺癌复发转移的关系。结果观察组的5-HTTLPR的SS基因型及NPY2R的TT基因型频率均高于对照组,血浆氨基酸类神经递质水平均低于对照组,且观察组中不同复发转移情况者的检测结果也存在显着性差异,且经Logistic分析显示,上述研究方面均与乳腺癌复发转移有密切的关系,P均<0.05。结论负性情绪相关基因在乳腺癌复发与转移中的检测价值较高,应重视对乳腺癌患者进行上述方面的检测。(本文来源于《实用癌症杂志》期刊2017年09期）
曾玮,陈平[10]（2017）在《利用基因芯片重注释筛选肝细胞肝癌术后复发相关lncRNA》一文中研究指出[目的]利用基因芯片重注释寻找肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)术后复发相关lncRNA(long non-codingRNA)。[方法]首先利用生物信息的方式重新注释35/41例复发/未复发HCC病例的基因表达谱数据,筛查与HCC术后复发相关的差异表达lncRNA。然后利用ROC曲线评价差异lncRNA的术后复发预测效能。最后利用基因共表达网络与功能富集分析探究差异lncRNA具体的生物学功能。[结果]差异表达分析发现3个lncRNA(LINC00342,LINC00607,LINC01553)显着差异表达[|log(fold change)|>1,q value<0.05]。ROC曲线分析发现该3个差异lncRNA的AUC值为0.693。基因共表达网络分析发现LINC00342相关共表达网络显着富集到"细胞周期"相关功能;LINC00607相关的共表达网络中基因主要富集到"炎症反应"与"免疫反应"相关的生物学功能与通路;LINC01553相关的共表达网络中基因主要富集到"DNA复制与修复"相关的生物学功能与通路。[结论]3个lncRNA与HCC术后复发显着相关,可作为一种潜在的诊断标志物组合,值得进一步的挖掘与研究。(本文来源于《肿瘤学杂志》期刊2017年08期）
复发相关基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
急性髓细胞白血病(AML)是最常见的血液系统恶性肿瘤之一,异基因造血干细胞移植由于具有独特的移植物抗白血病效应,较常规化疗显着降低了AML患者的复发风险,可以改善患者预后[1],是目前唯一可能治愈急性髓细胞白血病的手段。近二十年来,随着移植技术不断进步,移植相关并发症和死亡率不断下降,但移植后复发率却没有明显降低[2],目前针对复发患者目前仍缺乏有效的治疗选择,因此患者一旦复发,预后极差。研究可能影响移植后复发及复发后生存的因素,对识别高危患者、早期给予有效干预措施具有重要临床意义。虽然异基因移植后供体免疫细胞介导的移植物抗白血病(GVL)效应可以降低复发风险,但仍有部分患者面临复发,既往研究认为这可能与患者体内残存的耐药白血病细胞有关。Lapidot等首次将AML患者标本中的CD34+CD38-细胞群分离后输注给联合免疫缺陷小鼠,重建了与人类临床表现相似的白血病小鼠模型,这群具有与正常造血干细胞相同免疫表型和生物学特性的细胞被命名为“白血病起始细胞(LIC)”[3]。此后许多研究发现,该群细胞参与白血病的发生发展、耐药、复发等各个阶段[4][5][6],患者体内白血病起始细胞的负荷也是影响预后的重要因素[7][8]。虽然LIC与白血病复发关系的研究越来越得到重视,但该群细胞在异基因移植后复发中的作用研究较少,而异基因移植后复发模型是从早期阶段开始研究白血病起始细胞生物学行为变化的优质模型,因此研究此类细胞的生物学特性及其与异基因移植后复发的关系并探索可能的治疗靶点具有重要意义。基于以上研究背景,我们对AML患者异基因移植后复发及复发后生存相关因素进行了比较分析,并首次利用小鼠急性髓细胞白血病异基因移植后复发模型,研究了白血病起始细胞与移植后复发的关系,发现白血病起始细胞表面高表达的C-Kit分子通过上调STAT3磷酸化使PD-L1高表达,从而使该群细胞对供体免疫细胞介导的GVL效应不敏感,可以在移植后复发早期快速增殖而导致白血病复发,酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼治疗可以下调白血病起始细胞表面PD-L1的表达、延长小鼠生存,为急性髓细胞白血病移植后复发的治疗提供了新思路。第一部分:急性髓细胞白血病异基因移植后复发及复发后生存相关因素分析一、实验方法纳入2001年3月至2015年8月在长海医院或瑞金医院接受异基因移植治疗并生存超过100天的急性髓细胞白血病患者218例。分析患者年龄、性别、细胞遗传学/分子学预后分层、供受体性别关系、供体类型、移植前疾病状态、预处理方案、急性移植物抗宿主病(a GVHD)和慢性移植物抗宿主病(c GVHD)、移植物中单个核细胞数等因素对移植后复发率及复发后生存率的影响。单因素分析及多因素分析采用COX比例风险模型,将单因素分析P值小于0.1的因素纳入多因素分析,总生存率(OS)、复发后生存率(pr OS)及无事件生存率(EFS)计算采用KaplanMeier分析法、Log-Rank检验,累积复发率计算采用竞争风险模型、Gray检验,患者信息组间比较采用秩和检验、卡方检验或Fisher精确概率法,P<0.05认为有统计学意义。二、结果:(一)218例患者中男性123例、女性95例,中位年龄36(14-62)岁,中位随访时间21.5(3.4-179.6)个月。叁年OS 62.0%(95%CI 55.0%-69.0%),EFS 54.9%(95%CI 47.9%-61.9%),累积复发率30.2%(95%CI 23.7%-36.7%)。67例(31.02%)患者移植后确诊a GVHD,103例(47.69%)确诊c GVHD。截止随访终点共62例患者复发,中位复发时间5.23(2.17-42.20)月,复发后1年pr OS 33.7%(95%CI 20.6%-46.9%),2年pr OS 16.0%(95%CI 4.9%-27.1%)。(二)移植后复发相关因素:单因素分析显示移植前非CR1状态、半相合移植、男供女移植、移植后发生c GVHD及输注更多单个核细胞是可能影响移植后复发的因素。多因素分析显示移植前非CR1状态[CR2/3 HR 4.62(2.37-8.99),P<0.001;NR HR 3.31(1.75-6.24),P<0.001]是复发的危险因素,而移植后发生c GVHD[局限型HR 0.40(0.21-0.77),P=0.006;广泛型HR 0.33(0.13-0.82),P=0.018]与较低的移植后复发率相关。(叁)影响复发后总生存率的因素:在单因素分析中,移植前疾病状态、细胞遗传学/分子学危险分层、半相合移植、女供男移植、减低强度预处理、移植后发生c GVHD及复发出现在移植2年后是可能影响复发后生存的因素;多因素分析显示复发时伴c GVHD[HR 0.23(0.10-0.52),P<0.001]及复发出现在移植2年后[HR 0.11(0.03-0.43),P=0.001]的患者pr OS更高。叁、结论(一)移植前非CR1状态是复发的重要危险因素(二)移植后发生c GVHD的患者不仅复发率更低,而且复发时有c GVHD症状的患者复发后生存率也更高(叁)移植后晚期复发的患者复发后生存率更高第二部分:C-Kithigh细胞分离鉴定及干性特征研究一、材料方法(一)实验动物及细胞白血病受鼠为BALB/C雌鼠,白血病细胞为BALB/C小鼠来源携带AML1-ETO融合基因及C-Kit N882K突变的急性髓细胞白血病细胞系,并携带GFP荧光标记。(二)C-Kithigh细胞分离鉴定流式分选获得Lin-GFP+Sca-1-C-Kithigh和GFP+Sca-1-C-Kitlow的细胞。两群细胞分别取1×105个细胞以M3234培养基培养,每孔接种细胞1×104个。9-10天后荧光显微镜下计数C-Kithigh和C-Kitlow细胞形成的集落数,比较两者体外克隆形成能力。同样方法分选获得C-Kithigh与C-Kitlow细胞,分别给予BALB/C雌鼠尾静脉注射10个/只、100个/只或1000个/只,比较极限稀释后两群细胞重建小鼠白血病的能力。(叁)细胞凋亡检测给予小鼠尾静脉输注未分选白血病细胞1000个/只,定期处死白血病鼠并获取新鲜骨髓细胞1×106个,以Lin、C-Kit、Sca-1标记,以Annexin V/PI或Annexin V/7-AAD凋亡试剂盒标记后流式检测白血病细胞凋亡情况。同时流式分选获得Lin-GFP+Sca-1-C-Kithigh和GFP+Sca-1-C-Kitlow的细胞,提取蛋白后按照Western Blot标准流程检测比较两群细胞凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2的表达情况。(四)细胞周期检测给予小鼠尾静脉注射未分选白血病细胞1000个/只,定期处死白血病鼠获取新鲜骨髓细胞1×106个,以Lin、C-Kit、Sca-1标记后Lysing Solution固定裂红,TF Fix/Perm Buffer工作液固定穿膜,Ki-67、Hoechst33342标记后流式检测细胞周期分布。G0期细胞表型为Ki67-Hoechst-,G1期为Ki67+Hoechst-,S/G2/M期为Ki67+Hoechst+。(五)细胞周期及凋亡相关基因表达水平检测受体BALB/C小鼠接受未分选白血病细胞1000个/只,造模第14天处死小鼠,流式分选得到Lin-GFP+Sca-1-C-Kithigh和GFP+Sca-1-C-Kitlow的细胞,分别加入TRIzol提取RNA,使用RR036A Takara Prime Script?RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒反转录得到c DNA,RT-PCR引物序列见附表,使用SYBR Green q PCR Master Mix试剂盒进行q RT-PCR检测。(六)比较C-Kithigh与C-Kitlow细胞诱导的白血病小鼠模型外周血CD3+T细胞和CD3+CD4+T细胞表面共刺激分子表达情况随疾病进展的变化分别建立C-Kithigh细胞诱导的白血病模型和C-Kitlow细胞诱导的白血病模型,于造模前、造模后第7、14、21天采集外周血,裂红后以CD3、CD4、CD28、CTLA4、PD-1,ICOS标记后,流式检测两组小鼠外周血CD3+T细胞和CD3+CD4+T表面CD28、PD-1、CDLA4和ICOS的表达情况。(七)数据分析统计结果计量资料以均数±标准差表示,两组间均数比较采用student-t检验,不符合t检验的数据采用秩和检验,多组间均数比较采用单因素ANOVA分析,计数资料结果以例数(百分比)表示,生存分析采用Kaplan-Meier分析,Log-rank检验比较,P值<0.05认为有统计学意义。根据小鼠骨髓中GFP+白血病细胞百分比将白血病发病分为叁个阶段:早期即骨髓GPF+细胞百分比≤10%,中期即骨髓GFP+细胞百分比大于10%小于30%,晚期即骨髓GFP+细胞百分比≥30%。二、结果(一)C-Kithigh细胞较C-Kitlow细胞具有更强的体外克隆形成能力及小鼠白血病重建能力。C-Kithigh细胞形成的集落数量更多,体积更大,C-Kithigh与C-Kitlow细胞形成的集落数分别为14.3±8.1个/1×104个细胞和2.9±1.8个/1×104个细胞(P<0.001)。接受10个/只细胞输注的小鼠全部未发病,输注C-Kithigh细胞100个/只的小鼠发病率70.59%(12/17),发病小鼠中位生存时间29(22-48)天,接受C-Kitlow细胞100个/只的小鼠白血病发病率为33.33%(6/18),发病小鼠中位生存时间35(29-70)天(P=0.011)。输注C-Kithigh细胞1000个/只的小鼠全部发病,中位生存时间27(22-41)天,接受C-Kitlow细胞1000个/只的小鼠白血病发病率77.27%(17/22),发病小鼠中位生存时间31(23-53)天(P=0.002)。(二)C-Kithigh与C-Kitlow细胞凋亡比例均随疾病进展呈升高趋势,但同一发病阶段两群细胞凋亡情况未见明显差异。两群细胞在疾病发生的各个阶段均仅有PI-Annexin V+的凋亡细胞而无PI+Annexin V+的凋亡细胞,两群细胞凋亡比例均随着疾病进展而增加,但在同一发病阶段,两群细胞凋亡比例均未见明显差异(早/中/晚期比较P值分别为0.479/0.673/0.587)。Western Blot方法检测Caspase-3及Bcl-2的蛋白表达水平,结果提示C-Kithigh及C-Kitlow细胞中均未见活化的Caspase3片段(cleaved-Caspase3),Bcl-2蛋白表达在两群细胞间差异不明显。(叁)C-Kithigh细胞处于增殖期的比例始终高于C-Kitlow细胞。随着疾病进展,两群细胞G0期比例均升高,C-Kitlow细胞处于G0期的比例始终高于C-Kithigh细胞(早/中/晚期比较的P值分别为<0.001/0.005/0.029)。随着疾病进展,两群细胞G1/S/G2/M期及S/G2/M期比例均呈下降趋势。在白血病发病各个阶段,C-Kithigh细胞G1/S/G2/M期及S/G2/M期比例均高于C-Kitlow细胞(G1/S/G2/M期比例早/中/晚期比较的P值为0.002/0.034/0.029;S/G2/M期比较P值分别为0.038/0.022/0.029)。(四)C-Kithigh细胞高表达周期正性调控基因及凋亡抑制基因,低表达周期负性调控基因。细胞周期相关正性调控基因Cyclin D2、Cyclin D3在C-Kithigh细胞中表达明显高于C-Kitlow细胞(P值分别为0.048、0.049),细胞周期的负性调控基因P16及P57在C-Kithigh细胞中表达更低(P值分别为0.036、0.050),而凋亡抑制基因Bcl-2在C-Kithigh细胞中高表达(P=0.047)。(五)C-Kithigh细胞诱导的白血病小鼠与C-Kitlow细胞诱导的白血病小鼠外周血T细胞表面共刺激分子表达未见明显差异。比较C-Kithigh细胞诱导的白血病小鼠与C-Kitlow细胞诱导的白血病小鼠外周血CD3+T细胞和CD3+CD4+T细胞表面CD28、ICOS、PD-1及CTLA4的表达情况,结果提示不同发病阶段两组间比较均无明显差异。但在两种白血病小鼠模型中CD3+CD4+CD28+T细胞比例均随着疾病进展明显下降,C-Kithigh组从造模前53.43%降至36.73%(P=0.050),C-Kitlow组从造模前58.60%降至31.58%(P=0.018)。两组CD3+CD4+T细胞PD-1表达均随疾病进展而升高,C-Kithigh组从2.97%升高至7.40%(P<0.001),C-Kitlow组从3.71%升高至7.88%(P<0.001),两组CD3+T细胞PD-1表达均随疾病进展而升高,C-Kithigh组从3.64%升至8.51%(P=0.001),C-Kitlow组从4.20%升高至9.75%(P=0.001)。叁、结论(一)免疫表型为Lin-GFP+Sca-1-C-Kithigh的白血病细胞比表型为GFP+Sca-1-CKitlow的细胞具有更强的体外克隆形成能力和小鼠白血病重建能力,表明其具有更多早期干祖细胞特性(二)随着疾病进展,C-Kithigh与C-Kitlow细胞均呈现增殖受抑、凋亡增加,但C-Kithigh细胞增殖比例始终高于C-Kitlow细胞(叁)C-Kithigh细胞诱导的白血病模型与C-Kitlow细胞诱导的白血病模型外周血T细胞共刺激分子表达在疾病各个阶段均未见明显差异,但是两组均可见CD3+CD4+CD28+T细胞比例随疾病进展而降低,PD-1表达升高第叁部分:C-Kithigh细胞在AML异基因移植后复发中的作用及相关机制研究一、材料方法(一)实验动物及细胞异基因造血干细胞移植供体为8-9周C57BL/6(H2Kb)雌鼠,受体为10-11周BALB/C(H2Kd)雌鼠,白血病细胞系同第二部分。(二)小鼠急性髓细胞白血病异基因移植后复发模型建立受鼠接受8Gy TBI预处理后7小时尾静脉输注供体来源细胞,根据分组BL组小鼠接受供体去T骨髓(TCD-BM)细胞5×106/只+白血病细胞1×104/只,GVL组小鼠接受供体TCD-BM细胞5×106/只+脾细胞2.5×106/只+白血病细胞1×104/只。(叁)研究C-Kithigh细胞在移植后复发中的作用及可能的机制流式分选得到C-Kithigh与C-Kitlow细胞,步骤同第二部分,分别构建Kithigh-BL小鼠模型、Kitlow-BL小鼠模型、Kithigh-GVL小鼠模型及Kitlow-GVL小鼠模型,观察四组间生存差异。利用未分选白血病细胞构建BL小鼠模型与GVL小鼠模型,移植后第9、11、15、21天处死BL组小鼠,移植后第21、28、35、42天处死GVL组小鼠,获取新鲜骨髓细胞,凋亡及周期检测同第二部分,白血病细胞表面配体分子检测:获取白血病小鼠新鲜骨髓细胞以Lin、C-Kit、Sca-1、PD-L1和ICOSL标记后流式检测。比较BL组来源与GVL组来源C-Kithigh细胞周期、凋亡及PD-L1、ICOSL的表达差异,探索GVL效应下C-Kithigh细胞生物行为的改变。(四)阻断PD-1/PD-L1通路联合酪氨酸激酶抑制剂治疗白血病小鼠复苏白血病细胞步骤同前,给予BALB/C小鼠尾静脉注射1×104/只,造模第1、5、9、13、17天给予小鼠PD-L1单抗400ug/只腹腔注射,造模第1天起开始给予达沙替尼20mg/kg·天灌胃治疗,直至对照组开始出现小鼠死亡,比较空白对照组、达沙替尼单药组、PD-L1单抗单药组及联合用药组小鼠生存差异。(五)蛋白印迹法检测STAT3及MAPK(Erk)磷酸化水平处死白血病小鼠,流式无菌分选得到Lin-GFP+Sca1-C-Kithigh、GFP+Sca1-CKitlow、GFP+PD-L1high、GFP+PD-L1low的细胞。提取蛋白后以Peggy Sue全自动多功能蛋白定量分析系统检测STAT3、p STAT3、Erk及p Erk的表达。最后根据p STAT3峰面积与STAT3峰面积的比值(千分比)表示磷酸化水平。(六)统计分析统计方法同第二部分。二、结果(一)GVL组生存较BL组明显延长,Kithigh-GVL组小鼠生存明显较Kitlow-GVL组更短BL组与GVL组小鼠移植后复发率均为100%,BL组小鼠中位生存时间19(15-20)天,GVL组小鼠中位生存时间39(30-52)天(P<0.001)。Kithigh-BL组小鼠中位生存时间20(19-21)天,Kitlow-BL组小鼠中位生存时间21(19-24)天,两组间生存未见明显统计学差异(P=0.076),而Kithigh-GVL组中位生存时间32(24-54)天,Kitlow-GVL组中位生存时间51(31-58)天,Kithigh-GVL组小鼠生存时间更短(P=0.008)。(二)GVL组细胞凋亡比例较BL组更高,但组内比较C-Kithigh细胞与C-Kitlow细胞凋亡无明显差异BL组及GVL组来源白血病细胞在复发各个阶段均仅可见少量PI-Annexin V+凋亡细胞。BL组C-Kithigh及C-Kitlow细胞凋亡比例在复发各个阶段均未见明显差异,GVL组两群细胞凋亡同样未见明显差异(BL组早/中/晚期比较的P值0.674/0.174/0.212;GVL组早/中/晚期比较的P值0.343/0.877/0.561)。组间比较细胞凋亡情况,结果提示在复发中晚期GVL来源Kithigh细胞凋亡明显多于BL来源Kithigh细胞(早/中/晚期比较P值0.486/0.025/0.011),复发中期GVL来源Kitlow细胞凋亡较BL来源Kitlow细胞更多(早/中/晚期比较P值0.943/0.012/0.200)。(叁)比较C-Kithigh与C-Kitlow细胞在BL组与GVL组间周期分布的差异BL组中C-Kithigh细胞G0期比例始终较C-Kitlow细胞更低(早/中/晚期P值分别为0.026/0.028/<0.001),G1/S/G2/M期比例更高(P值分别为0.133/0.032/<0.001)、S/G2/M期比例更高(早/中/晚期P值<0.001/0.002/<0.001)。GVL组内比较同样发现C-Kithigh细胞G0期比例更低、增殖期比例更高(G0期比较P值分别为0.029/0.004/0.003,G1/S/G2/M期比较P值为0.029/0.007/0.002,S/G2/M期比较P值为<0.001/0.002/0.009)。比较移植后复发过程中BL组与GVL组来源C-Kithigh细胞周期分布的差异,发现复发早期BL来源Kithigh细胞G2/S/M期比例明显高于GVL来源(P=0.016),两组间Kithigh细胞G0期及G1/S/G2/M期比例无明显统计学差异。比较C-Kitlow细胞周期分布在BL组与GVL组间的差异,发现复发早期阶段BL来源Kitlow细胞S/G2/M期及G1/S/G2/M期比例均明显高于GVL来源(P=0.002,P=0.028),BL来源Kitlow细胞G0期比例明显低于GVL组(P=0.002)。(四)C-Kithigh细胞PD-L1表达高于C-Kitlow细胞对BL组C-Kithigh细胞与C-Kitlow细胞表面PD-L1、ICOSL表达情况比较发现,在疾病各个阶段C-Kithigh细胞表面PD-L1表达均高于C-Kitlow细胞(早/中/晚期比较P值0.017/0.038/0.038),GVL组C-Kithigh细胞表面PD-L1表达同样持续高于C-Kitlow细胞(早/中/晚期P值分别为0.015/0.002/0.001)。对移植后复发各个阶段BL来源Kithigh细胞与GVL来源Kithigh细胞表面PDL1、ICOSL的表达进行比较,发现不同来源Kithigh细胞表面分子表达未见明显差异,同样不同来源Kitlow细胞表面PD-L1、ICOSL的表达也未见明显差异。(五)达沙替尼治疗延长白血病小鼠生存达沙替尼单药治疗组小鼠中位生存时间27(26-28)天,较空白组生存明显延长[中位生存时间23(21-24)天,(P<0.001)],但PD-L1单抗单药治疗并未能使小鼠获得生存获益[24(22-26)天,(P=0.141)],达沙替尼联合PD-L1单抗治疗组小鼠生存较达沙替尼单药组稍有延长[中位生存时间28(26-31)天,(P=0.027)]。(六)C-Kithigh细胞通过JAK/STAT通路诱导PD-L1高表达Lin-GFP+Sca1-C-Kithigh细胞中STAT3磷酸化水平明显高于C-Kitlow细胞,GFP+PDL1high细胞中STAT3磷酸化水平明显较GFP+PD-L1low细胞更高,给予白血病小鼠达沙替尼治疗后C-Kithigh细胞表面PD-L1表达较对照组明显下调[发病早、中、晚期比较分别为26.8%±4.1%和49.8%±13.5%(P=0.047)、27.3%±4.6%和40.9%±1.6%(P=0.009)、21.6%±7.7%和36.3%±9.7%(P=0.110)],但两组来源C-Kitlow细胞的PD-L1表达差异不明显。叁、结论(一)C-Kithigh细胞通过上调STAT3磷酸化介导PD-L1高表达,使其对供体淋巴细胞介导的细胞周期阻滞更不敏感,导致该群细胞在异基因移植后复发早期可以快速增殖,介导白血病复发(二)酪氨酸激酶抑制达沙替尼治疗可以下调C-Kithigh细胞PD-L1表达水平,延长白血病小鼠生存
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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