付石军[1]2008年在《中性植酸酶产生菌的筛选及基因工程菌的构建》文中研究说明中性植酸酶不仅具有较好的热稳定性,有助于抵抗饲料制粒过程中高温引起的酶失活,而且其酶促反应最适pH在7.0-7.5之间,可有效弥补酸性植酸酶的不足。本研究筛选了中性植酸酶产生菌,优化了其液态产酶参数,克隆与分析了其基因,在此基础上,构建了中性植酸酶原核和真核表达基因工程菌,旨在为中性植酸酶产品的工业化生产奠定基础。主要结果如下：1.中性植酸酶产生菌的筛选、鉴定及其液态产酶参数优化通过平板初筛和摇瓶复筛,从土壤中筛选出6株能够分泌中性植酸酶的菌株,其中菌株ZJ-6显示较高的活力。经鉴定表明,菌株ZJ-6为地衣芽孢杆菌,其液态发酵产酶培养基中最佳碳源为l%葡萄糖,氮源为0.1%硫酸铵,初始pH为7.5,最佳培养温度为55℃。经36h培养后,产酶水平达到最高,酶活为0.267U/ml,比活为0.701U/mmg。2.地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶基因克隆及序列分析通过PCR对地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶基因(phyC)进行扩增,获得一段长约1.2kb的特异性产物,并将其克隆到pUCmT载体,构建含有目的基因片段的重组质粒pUCm-T phyC。序列分析表明,phyC基因全长1146bp,编码381个氨基酸,5’端有一段编码31个氨基酸的信号肽序列；不含有酸性植酸酶蛋白中均存在的高度保守的RHGXRXP和HD序列；与已报道的地衣芽孢杆菌(AY651979)、凝结芽孢杆菌(DQ346195)、枯草芽孢杆菌(AJ277890)、淀粉液化芽孢杆菌(AY836773)和芽孢杆菌sp.DSl1(BSU85968)中性植酸酶核苷酸同源性分别为99%、70%、67%、67%和67%,与所编码蛋白同源性分别为99%、69%、65%、65%和64%。该酶蛋白成熟肽二级结构中无规卷曲占57.42%,折迭占40.29%,α-螺旋占2.29%；其叁级结构与模板蛋白lh61A(1.8A)同源性为68.2%。3.中性植酸酶基因工程菌株的构建将地衣芽孢杆菌ZJ-6编码的中性植酸酶基因(phyC)定向插入到原核表达载体pET-30a(+)上,获得的重组质粒phyC-pET-30a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物(EPhyC5)经Ni-NTA亲和层析纯化后比活为2.87U／mg。SDS-PAGE表明,EPhyC5相对分子量为42.86 kDa。将地衣芽孢杆菌ZJ-6中性植酸酶成熟肽基因(phyCm)以N-端融合方式插入到酵母表达载体pPIC9K上的α-因子信号肽编码序列的3’端,构建重组质粒pPIC9K-phyCm,电击法转化毕赤氏酵母GS1 15。经MD／MM平板筛选、G418抗性筛选和酶活性测定,获得20个阳性表达子(pPhyCm),其中pPhyCm6活性最高。将pPhyCm6接种于BMMY培养基中,经0.5%甲醇诱导培养96h,发酵上清液中重组中性植酸酶(PPhyCm6)比活为8.64U／mmg。SDS-PAGE结果表明,PPhyCm6相对分子量为38.78kDa,与理论推算的分子量(38.7kDa)相吻合。在巴斯德毕赤氏酵母中实现了有生物学活性中性植酸酶的分泌表达。4.重组酶及其亲本酶的酶学性质分析野生酶PhyC最适温度和最适pH分别为55℃和7.0；在80℃、pH7.0条件下处理10 min,残余酶活为57.36%；在pH6.5-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均高于80%。EPhyC5最适温度和最适pH分别为60℃和7.0；在80℃、pH7.0条件下处理10 min,残余酶活为68.26%；在pH6.0-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均高于80%。PPhyCm6最适温度和最适pH分别为60℃和7.5；在80℃、pH7.5条件下处理2 min,残余酶活为59.42%；在pH5.0-9.0,25℃条件下处理1h,残余酶活均高于80%。重组酶EPhyC5和PPhyCm6在离子影响、底物特异性和Ca2+依赖性方面与亲本酶PhyC基本一致。EDTA、Cu2+、Cd2+、Ba2+和Mn2+对酶活性均有显着抑制作用；1.0mmol/LCa2+能提高酶蛋白的热稳定性和pH稳定性；植酸钠是特异性作用底物；氟化钠和钒酸铵均能引起酶活性降低。酶学性质
胡勇[2]2003年在《枯草芽孢杆菌植酸酶的性质研究及产酶基因的克隆和序列分析》文中认为本研究从118份样品中分离到一株产植酸酶的枯草芽孢杆菌(命名为Bacillus. subtilis WHNB02)，其发酵液经乙醇沉淀、硫酸铵分级沉淀及Sephadex G-100柱层析等步骤后分离纯化了该酶，纯化倍数约为31.5倍，回收率为13.0％。酶学性质研究表明：该酶为单体酶，SDS-PAGE测得的表观分子量约为42KD；37℃下以植酸钠为底物的Km值为0.5mmol/L；酶反应的最适温度为60℃，80℃作用10min剩余酶活为61％；最适pH为7.0，在pH6.0～10.0范围内稳定；酶活性及稳定性都依赖Ca~(2+)存在，螯合剂及各种金属离子对酶活都有不同程度的抑制作用。1mM的Hg~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Ba~(2+)有中度抑制作用，1mM的EDTA、Cd~(2+)具有很强的抑制作用，剩余酶活在20％以下。根据国际基因库(GenBank)中注册的芽孢杆菌植酸酶phyC基因序列设计了一对引物，PCR扩增获得了一条长约1.2kb的特异性PCR扩增条带。将此PCR扩增片段定向克隆到pUC18质粒的多克隆位点，构建了含有目的基因片段的重组质粒，并转化到JM109大肠杆菌载体菌中获得了阳性克隆菌株。重组质粒中外源片段的DNA序列测定表明，该片段含有植酸酶phyC基因的完整序列，基因全长1152bp，编码383个氨基酸，5’端有一编码26个氨基酸的信号肽序列。将该基因与Kerovuo(1998)所报道的芽孢杆菌植酸酶phyC基因(GenBank Accession: AF029053)进行比较，同源性达92.4％；两条氨基酸序列相比，同源性达93.7％。目前已将Bacillus. subtilis WHNB02植酸酶phyC基因序列及其相应的氨基酸序列在国际基因库中注册，注册号分别为AF220075和AA043434.1。
尹春筱[3]2018年在《产高温蛋白酶菌株的分离鉴定及蛋白酶基因的克隆与表达》文中进行了进一步梳理热泉具有高温的环境特点,其中蕴含多种嗜热微生物,独特的生长环境造就了具有特殊生理机制和独特基因的物种,是发现未知或具有特殊功能酶类的理想场所。蛋白酶可以催化蛋白质的水解,在酶学性质的研究中有很长的历史。蛋白酶同样也是重要的工业酶制剂,应用广泛,但当前存在着热稳定性差的局限性。本研究课题以腾冲热泉中收集到的微生物为研究对象,通过培养分离,筛选,基因组学等方法对嗜热原核微生物展开研究。本实验研究中,针对从云南腾冲热泉取得的水样进行产酶功能筛选,得到一株表达高温蛋白酶的菌株。首先对其进行驯化培养,主要是利用选择培养基筛选能够分解脱脂奶粉产蛋白酶的菌株;同时探究温度、pH、碳源、氮源对菌株生长的影响;最后采用福林酚法测定蛋白酶活性,并对酶的最适pH、温度以及热稳定性、pH稳定性进行测定研究。实验结果筛选得到一株产蛋白酶菌株,经过生理生化试验和16S rDNA鉴定得到该菌株是Aneurinibacillus属。菌株生长的最适氮源、碳源、温度和pH分别为酵母粉、葡萄糖、55℃、pH 7.5。此外该菌株所产的蛋白酶最适温度为60℃,在pH7~9具有较好的酶活性。因此筛选得到的菌株为嗜热芽孢杆菌,所产的碱性蛋白酶具有较高的耐受温度和pH稳定性。采用PCR技术克隆比对后确定丝氨酸蛋白酶基因spr,连接表达载体,构建pET-28a-spr原核表达载体,转化Trans1克隆感受态细胞,将验证成功的阳性克隆转化BL21大肠杆菌,17℃下IPTG诱导表达,破碎细胞,与空载对比后测定酶活。经测序表明,该蛋白酶基因为丝氨酸蛋白酶,全长1206bp,编码含有400个氨基酸残基的成熟蛋白,等电点为5.3,蛋白酶分子量约为42kDa。与大肠杆菌表达系统相比,枯草芽孢杆菌表达系统可以有效的将重组蛋白分泌到细胞外。构建PHY-spr表达载体,在Trans1感受态细胞中克隆,再转入SCK6枯草芽孢杆菌中表达,利用配制好的发酵培养基进行发酵培养72h,与空载对照测定酶活。以腾冲热泉为研究对象,通过对不同热泉微生物的研究可加强我国对高温热泉微生物与高温酶资源的研究与利用。
许波[4]2004年在《中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达》文中认为中性蛋白酶是指其最适作用pH介于6.0～7.5之间的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。由于具有催化反应速度快，无工业污染，催化反应条件适应性宽等独特的性质和优点，被广泛地应用于食品、制药、化妆品、洗涤剂、丝纺、毛皮软化等行业。为了大幅度提高中性蛋白酶发酵单位以降低生产成本，本论文以陆良酶制剂厂的中性蛋白酶生产菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)为研究对象，克隆并在毕赤酵母中表达了其包括pro-序列在内的中性蛋白酶全长基因以及功能区基因。同时，通过对重组毕赤酵母发酵条件的优化，以及重组中性蛋白酶粗酶酶学和应用特性的研究，为中性蛋白酶的蛋白质工程提供理论基础，并为该酶的高效表达和以后的应用奠定基础。 本论文的主要内容有四个部分： 1．枯草芽孢杆菌包括前导序列(pro-序列)在内的中性蛋白酶全长基因和功能区基因片段的克隆； 2．中性蛋白酶全长基因和功能区基因片段在毕赤酵母中的表达； 3．重组毕赤酵母发酵条件的优化； 4．重组中性蛋白酶粗酶的酶学和应用性质研究。 具体的研究结果和结论如下： 1．以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的基因组DNA为模板，根据已报道的nprE基因序列设计引物，成功克隆出了枯草芽孢杆菌中性蛋白酶包括前导序列(pro-序列)在内的全长基因，序列测定结果表明与已报道nprE的基因序列有98％的同源性。据此全长基因再设计引物，克隆出其功能区基因，测序表明克隆正确。 2．将克隆得到的中性蛋白酶全长基因和功能区基因片段分别通过EcoR Ⅰ位点，以正确的ORF与酵母表达载体pPIC9K上的α-因子信号肽编码序列3’端融合，构建成重组表达载体pPIC9K-NPL和pPIC9K-NPS。重组酵母表达载体经Bgl Ⅱ线性化后电击转化宿主SMDI 168，经蛋白酶活性检测、SDS一PAGE及酵母基因组DNA的PCR扩增分析表明，中性蛋白酶全长基因在SMDll68中得到了正确的表达和修饰，转化子NL19实验室摇瓶发酵时，酶活最高可达24100U/mL发酵液(是出发菌株的3倍):而功能区基因由于缺失前导序列，表达产物没有生物学活性，从而进一步说明了枯草芽饱杆菌中性蛋白酶基因中的pro一序列，在指导蛋白酶前体进行正确的空间折迭和形成有生物学活性中性蛋白酶过程中起着重要的作用。重组工程菌连续传10代后，经接种培养、诱导发酵及PCR反应鉴定表明，NL19具有良好的遗传稳定性。 3.通过对重组毕赤酵母NL19发酵过程的两个阶段发酵条件的优化实验，得出生长阶段的最佳发酵工艺为:甘油2%，硫酸按2.5%，Biotin 0.00004%，lmo比磷酸缓冲液10%，pH=5.5，在240rpm、30℃条件下培养48hr，接种量为10%。通过正交实验得出诱导阶段的最佳发酵工艺为:甲醇1 .5%，甘油0.5%，硫酸馁2%，Biotino，00004%，lmoFL磷酸缓冲液10%，pH=7.0，间隔24hr补加一次初始终浓度的甲醇和甘油，在24帅m、30℃条件下诱导培养48hr，接种比例为1:1。验证实验表明，在最佳发酵条件下，NL19表达的中性蛋白酶产量平均可达29878U/I nL。 4.重组中性蛋白酶的分子量约为44.3kDa，最佳底物为酪素，最适作用pH为7.0一7.5，稳定pH范围在6.0一9.0之间，较之原始菌株的pH6.5一5.0，其pH稳定范围更广。最适作用温度为45℃，耐热性较原始菌株有所提高，60℃下处理10min仍能保持10%的酶活力。EDTA和Hg2+严重抑制该酶活力，另外，c了十和cdz+均抑制此酶，而z矛+、Mg2+、M矿十、Fe2+和c了+对酶无明显激活或抑制作用，C扩十对该酶具有稳定作用。 以上研究结果表明，本研究构建的基因工程菌所产中性蛋白酶表达量比原始菌株高，实验室摇瓶发酵时，酶活可达24 1 00U/mL;其粗酶的酶学和应用性质得到了进一步研究，证明工程菌所产中性蛋白酶的耐热性和pH适性较原出发菌株有进一步提高;通过对发酵条件进行优化，最佳发酵条件下的中性蛋白酶产量平均可达29878U/mL。因此，该株基因工程菌所产的中性蛋白酶具有广阔的工业化生产和应用前景。
朱彦博[5]2013年在《海南土着芽孢杆菌筛选、复合及其水质净化效果研究》文中指出海南省是我国养殖水产品出口大省,沿海水质优良,水产品质量高,而且种类丰富。然而,近年来集约化养殖的迅速发展大大增加了水体的有机负荷,养殖水体环境日趋恶化,导致病害频繁发生,给该行业造成严重损失。目前,使用安全高效、绿色环保的微生物制剂改善养殖环境,减少病害发生是保持水产养殖业健康可持续发展的重要措施。芽孢杆菌是公认的一种优良的微生态菌,是水产养殖业中最有效的水质净化菌之一。针对海南地理环境特殊,外来菌种使用效果不理想的现象,本论文从海南文昌市会文镇海水养殖系统中分离筛选并鉴定了2株高蛋白酶活性和4株高脂肪酶活性的海南土着芽孢杆菌,并对2株高蛋白酶活菌株和其中1株高脂肪酶活菌株相复合时的最佳配比用量和复合后的水质净化能力做出了研究,具体结果如下：1.用芽孢杆菌选择性培养基(温度50℃,盐度70),从文昌市会文镇海水养殖系统水样和泥样中初步分离出247株芽孢杆菌；以从一种常见微生物制剂中分离的2株芽孢杆菌SP11001和SP11002作为对照,采用脱脂牛奶平板法筛选出2株高蛋白酶活菌株WC11011和WC11148,其蛋白酶活性均极显着高于对照菌株(P<0.01)。经菌落表型分析、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,该两株目标菌株均为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。将凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)浸泡于菌浓度为1×107CFU/mL的水体中进行48h急性攻毒试验,结果表明,这两株菌对水产养殖动物是安全的。当投放量为2×105CFU/mL时,对于灭菌养殖废水中的脱脂牛奶(5%),2株细菌均可在12h内将其完全降解；对于不灭菌养殖废水中的脱脂牛奶(5%),WC11148在12h时,能将其大部分降解,而WC11011只需8h就能将其完全降解。2.将采集的水样和泥样经富集培养、油脂同化平板初筛、菌种分离、摇瓶发酵及脂肪酶酶活测定,共筛选出4株高脂肪酶活性的芽孢杆菌,其脂肪酶活性分别为14.6U/mL (WC11225)、9.75U/mL(WC11023×10.24U/mL (WC11021)和7.66U/mL(WC11041)。经菌落表型分析、生理生化鉴定和16SrDNA序列分析,这4株目标菌株均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),将凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)浸泡于菌浓度为1×107CFU/mL的水体中进行48h急性攻毒试验,结果表明,这4株菌对水产养殖动物是安全的。当投放量为1.8×105CFU/mL时,24小时内,对于灭菌养殖废水中的橄榄油(1.96%),4株细菌可将其完全降解；对于不灭菌养殖废水中的橄榄油(1.96%),WC11023、WC11225可将其完全降解,WC11021和WC11041只能将其大部分降解；对于含有普通海水培养基的灭菌养殖废水中的橄榄油(1.96%),WC11021和WC11225可将其大部分降解,而WC11023和WC11041只能将其小部分降解；各菌株的培养上清液对灭菌养殖废水中的橄榄油降解效果都不太理想,仅WC11021和WC11225的上清液能降解小部分油脂。3.以对人工配合废水(盐度为30)中的COD降解率为指标,采用单因素试验和正交试验相结合的方法,研究菌株WC11011、WC11148和WC11225复合使用时的最佳配比用量。(1)单因素试验结果表明,在24小时内,当接种量分别为4×104CFU/mL (WC11011)、4×104CFU/mL (WC11148)和1.2×104CFU/mL (WC11225)时,3株菌在16h时对水体COD的降解率达到最大,分别为87.4%、92.5%和65.8%。(2)叁因素叁水平(以菌株为因素,菌株浓度为水平)正交试验结果表明,3株细菌复合时的最佳配比用量为3×104CFU/mL、4×104CFU/mL和1.2×104CFU/mL,对人工配合废水COD16h降解率为96.4%,极显着高于WC11011和WC11225的降解率(P<0.01),显着高于WC11148的降解率(P<0.05)。同时,进一步研究了3株细菌及其复合菌24h降解人工配合废水NH4-N和N02-N的能力,结果表明,WC11011、WC11148和WC11225对NO2-N均有明显降解效果,分别为32.6%、67.5%和30.3%；WC11011、WC11148和WC11225对NH4-N的降解率分别为0%、35%和29.1%；复合菌对NH4-N和NO2-N的24h降解率分别为62.9%和81.8%,极显着高于单株细菌的作用效果(P<0.01)。
于鹏[6]2014年在《南极产低温植酸酶菌的分离、产酶条件优化及酶学性质研究》文中研究指明植酸酶作为一种绿色饲料添加剂，能够有效提高饲料中植酸磷的利用率，降低植酸的抗营养作用，从而降低生产成本，并能够缓解粪磷排泄所造成的环境污染，在饲料行业中已经得到广泛应用。现在应用的植酸酶大多为中高温植酸酶，与低温植酸酶相比它们在低温下活性较低，而单胃动物的生理温度在39℃左右，在水产养殖业中通常需要植酸酶在低于28℃具有较高的催化活性。因此，低温植酸酶具有巨大的潜在应用价值。本研究通过两步筛选法从南极深海沉积物样品中分离出10株产植酸酶菌株，其中一株具有较高的植酸酶活性，命名为JMUY14。经形态学、生理生化和26S rRNA ITS区序列系统发育分析鉴定为红酵母属（Rhodotorula sp.）。据我们所知，这是首次有关红酵母属产植酸酶的报导。采用单因素试验和响应面试验设计相结合的方法对Rhodotorula sp. JMUY14的产酶条件进行了优化，结果如下：葡萄糖4%，蛋白胨2%，NaNO31.5%，KCl0.025%，MgSO4·7H2O0.025%，MnSO4·H2O0.002%，FeSO4·7H2O0.002%，发酵时间48h，发酵温度25℃，培养基初始pH5.0，接种量10%。通过对单因素试验结果进行分析，选取发酵温度（℃）、接种量（%）和蛋白胨添加量（%）为显着因子进行Box-Behnken Design (BBD)，结果如下：在发酵温度26℃，接种量10.4%，蛋白胨添加量2.3%的条件下，植酸酶产量达到205.447U/ml，与软件预测的植酸酶产量201.948U/ml基本一致，比优化前大约提高了3.4倍。通过硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析对Rhodotorula sp. JMUY14的胞外植酸酶进行了分离纯化，纯化倍数和回收率分别为15.16和5%，植酸酶的比活达到31635U/mg。Rhodotorula sp. JMUY14的植酸酶具有以下特性：（1）等电点为4.33，分子量为63kDa；（2）最适温度为50℃，在10℃和37℃分别保留17.5%和85%的酶活，表明其在低温下具有较高的活性；在45℃和50℃孵育50min分别保留64.8%和41%的酶活，55℃处理10min、20min、30min、40min、50min分别保留45.7%、36.2%、22.9%、21.0%、12.4%的酶活，60℃或65℃处理10min酶活基本丧失；（3）最适pH为5.0，在pH2.0-8.0稳定性较好，适于在单胃动物胃肠道中发挥作用；（4）Mg2+、Fe2+、Fe3+、K+、Na+、Ca2+、EDTA和EGTA能够增强植酸酶的活性；Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ag+、PMSF、Phenylgloxal hydrate和SDS能够抑制植酸酶的活性，其中Phenylgloxal hydrate是组氨酸酸性磷酸酶的特异性抑制剂。因此，Rhodotorula sp. JMUY14的植酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶（HAP）家族；（5）在0.1mg/ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液中37℃孵育1h，剩余酶活分别为92.2%和75.6%，表明它具有较强的蛋白酶抗性；（6）植酸酶对植酸的Km和Vmax值分别为0.247mM和0.0265mM/min，对植酸钠的Km和Vmax值分别为0.817mM和0.0218mM/min，表明该植酸酶对植酸具有较高的亲和力。
王凯[7]2016年在《青藏高原土壤中产植酸酵微生物的筛选及酶学特性研究》文中研究说明植酸酶是一类催化植酸盐水解为无机磷酸盐和肌醇的酶类,作为一种新型饲料添加剂,在动物营养及环境保护等领域具有很大的应用潜力。在单胃动物饲料中加入微生物源植酸酶不仅能有效提高磷的利用率,降低磷对环境污染,而且可解除植酸对饲料中营养因子螯合作用,提升饲料的营养价值,因而在国内外受到广泛关注。本研究对青藏高原地区土壤中产植酸酶微生物进行分离筛选,诱变选育,获得高产植酸酶菌株,并对其产植酸酶的性质进行了研究,取得了如下主要研究结果。1、从青藏高原土壤中共分离得到18株产植酸酶菌株,分别来自叁种不同的生境,其中柴达木盆地灌丛沙丘根际分离得到10株(占55.5%),青藏高原沙化草原分离得到3株(占16.7%),青藏高原铁路沿线5株(27.8%),其它沙化地且植被较少的取样地未分离得到植酸降解菌。通过16s/18s rRNA基因序列分析方法对18株菌进行鉴定,其中Erwinia persicina AT1-1,Fusarium tricinctum BLH-2,Talaromyces pinophilus NMH 2-1-1,Cladosporium cladosporioides NMH 3-3-2菌株是首次发现植酸降解菌。对18株菌酶活的研究发现Penicillium glabrum NMH 2-3-1产植酸酶活性最高(2695.3 U/mL)。2、在28℃、160 r/min条件下对菌株Penicillium glabrum NMH 2-3-1进行摇瓶培养,培养6d后,对所产植酸酶进行了纯化和酶学性质研究,结果表明该酶在pH 4.0~8.0和20~60℃性质稳定,最适反应温度为55℃,60℃保温1h,酶活保持在75%,具有较好的热稳定性。Mn~(2+)、Cu~(2+)、Al~(3+)对该酶活具显着抑制作用,Ca~(2+)、Mg~(2+)显着提高该酶的活性。该酶具有较好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解能力。3、对Penicillium glabrum strain NMH 2-3-1进行了紫外线诱变选育,得到4株高产植酸酶的菌株,分别命名为P.glabrum U1、P.glabrum U2、P.glabrum U3、P.glabrum U4,其中P.glabrum U3产植酸酶酶活最高,达到3611.3 U/mL,较出发菌株提高34%。通过甲基磺酸乙酯(EMS)对P.glabrum U3株菌进行再次诱变,通过复筛,最终得到4株高产菌株,其中P.glabrum E1酶活比P.glabrum U3提高8.9%,达到4014.9 U/m L,较原始出发菌株提高了近49%。对P.glabrum E1连续传代培养,产酶性能基本稳定。4、通过Plackett-Burman实验设计对发酵条件进行优化。结果表明,培养液中NH4NO3、MnSO4、FeSO4的浓度是影响植酸酶酶活的显着因素。利用Box-Behnken设计进行了3因子优化设计,优化得到的培养基组成及发酵条件为:淀粉1.5%、NH_4NO_3 0.375%、Mg_SO_4·7H_2O 0.05%、KCl 0.05%、MnSO_4 0.008%、FeSO_4 0.0078%,pH 6.0,接种量2%,30℃,摇床转速160 r/min。酶活达4197.15 U/mL,较优化前菌株,植酸酶酶活提高了4.9%。5、在37℃条件下,用P.glabrum E1产植酸酶粗提液对麸皮、豆粕、棉粕、玉米粉四种饲料原料植酸磷降解率进行了测定,结果表明,4种原料的植酸磷含量分别为69.64%、62.82%、61.24%、44.00%,加入酶液3 h后,该植酸酶粗提液对4种饲料原料中植酸磷降解率分别为47.08%、59.95%、62.48%、65.74%,表明该植酸酶对四种原料中的麸皮植酸磷降解效率最好,然后依次是豆粕>棉粕>玉米粉,对麸皮的降解率要分别比豆粕、棉粕、玉米粉高出8.82%、4.96%、28.38%。
盛军[8]2008年在《海洋金黄色隐球酵母菊粉酶发酵生产、酶的分离纯化以及基因克隆的研究》文中指出菊粉是存在于菊芋,大丽花和菊苣根中的一种主要碳水化合物。菊粉酶能够水解菊粉,产物是果糖和低聚果糖。果糖拥有甜度高,热量低,不易造成龋齿,糖尿病患者也可使用的优点。而低聚果糖其生理功能更加广泛,有提高机体免疫力、改善脂质代谢、降低胆固醇,促进矿物质吸收等作用。因此菊粉酶应用前景广泛。许多种酵母所产的酶诸如脂酶,蛋白酶,菊粉酶,植酸酶等已经工业化生产了。在这些酶类中,菊粉酶受到了广泛的重视。虽然有很多关于陆地酵母产菊粉酶的研究,但是目前并没有关于海洋酵母产菊粉酶的报道。我们对从不同的海洋环境中分离到的500多株酵母进行了筛选,发现分离自中国南海海泥中的酵母G7a能够产生大量的菊粉酶。根据传统的鉴定方法及分子生物学鉴定,G7a最终被鉴定为Cryptococcus aureus(金黄色隐球酵母),这是关于海洋隐球酵母产菊粉酶的首次报道。G7a所产的菊粉酶在pH 5.0以及温度50oC时展现出良好的酶活性。最佳的产酶条件是:用人工配置的海水培养发酵,其中含菊粉4.0% (w/v), K_2HPO_4 0.3% (w/v),酵母提取物0.5% (w/v),KCl 0.5% (w/v), CaCl_2 0.12% (w/v), NaCl 4.0% (w/v)以及MgCl_2·6H_2O 0.6% (w/v)。在最佳条件下摇瓶发酵42小时后酶活力达到85.0U/mL。在酵母所产的菊粉酶中该酶活力已经达到了相当高的水平。用粗酶液水解菊粉,产物中含有大量的单糖及寡聚果糖。为了开发菊粉酶的应用潜力,我们对菊粉酶进行了纯化,并对酶学性质进行了全面研究。本研究收集了海洋酵母G7a的发酵液,经过超滤,浓缩,分子筛以及离子交换柱等步骤进行纯化后发现其特异性酶活力增加了2.44倍。纯化后的菊粉酶经测定分子量是60.0 kDa。纯化后菊粉酶的最佳作用pH和温度分别是5.0和50°C。Ca~(2+), K~+, Na~+, Fe~(2+)和Zn~(2+)能够促进酶活的提高,然而Mg~(2+), Hg~(2+)和Ag~+对纯化后的菊粉酶有抑制作用。苯甲基磺酰氟(PMSF),碘乙酸(iodoacetic acid)与乙二氨四乙酸(EDTA)能够强烈的抑制酶活性。纯化后菊粉酶对底物菊粉的Km和Vmax分别是0.1114 mol/L与0.0085 mg/min。水解产物中存在的大量单糖表明纯化后的菊粉酶有很强的外切酶活性。水解大量的菊粉需要高浓度的菊粉酶溶液。因此本研究以Plackett–Burman design为基础采用响应面(RSM)法对Cryptcoccus aureus G7a固体发酵(SSF)产菊粉酶的产酶条件进行了优化。采用五因素五水平的设计方案,在最佳条件下:即湿度61.5%,接种量2.75%,底物配比(麸皮:稻壳)0.42,温度29 oC,pH 5.50发酵,根据统计学预测的每克底物干重里的菊粉酶酶活力最大可达436.2U,发酵120小时后,实验过程中实际测得的酶活力是每克底物干重420.9U,这比以往报道的酵母所产菊粉酶的酶活力都要高。利用SMARTTM RACE cDNA amplification kit试剂盒,通过反转录合成Cryptococcus aureus G7a的cDNA链,我们得到了该胞外菊粉酶的基因。该基因含有一个编码菊粉酶的1557bp的开放阅读框,没有内含子存在。该基因编码518个氨基酸其中包括一个推测得到的含有21个氨基酸残基的信号肽。由菊粉酶基因推测出的蛋白序列含有六个可能的N-糖基化位点,该菊粉酶与Cryptococcus neoformans和Aspergillus fumigatus的β果糖苷酶的相似性分别达到了71%与58%。另外,海洋酵母G7a不仅能产生大量的菊粉酶,同时它还是一个优良的单细胞蛋白源,因此对该酶的研究具有重要的工业应用价值。
国春艳[9]2010年在《木聚糖酶和纤维素酶对后备奶牛生长代谢、瘤胃发酵及微生物区系的影响》文中进行了进一步梳理本研究从土壤等环境中筛选出产木聚糖酶菌株,分析其中酶活力较高的一株黑曲霉S8-3产酶酶学性质。对该菌株液体发酵后将其与纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶等按不同比例复配,在体外对玉米—豆粕—青干草底物进行降解,确定可在反刍动物日粮中添加的复合酶的酶系组成。进一步用体外法研究了外源酶与瘤胃内源酶的协同作用,探讨了外源酶提高饲料利用率的机制。随后研究了复合酶在动物体内的作用效果,以3月龄到7月龄的后备牛为试验动物进行了生长消化代谢试验,分析了添加外源酶对后备牛生长性能、营养消化、血液指标、瘤胃发酵及瘤胃微生物区系变化的影响。本研究系统分析并阐述了外源酶制剂在后备牛日粮中的应用效果及其作用机制。现摘要如下:产木聚糖酶菌株的筛选研究从生长作物、长期堆积草料或腐质物的土壤中筛选产木聚糖酶菌株。通过富集培养定向筛选技术,从土壤中分离获得18株产木聚糖酶菌株,挑选其中5株进行摇瓶培养。对产酶最高的菌株S8-3进行鉴定,同时分析该菌株产生的木聚糖酶的酶学性质。经鉴定该菌株为黑曲霉(Aspergillums Niger);该菌株发酵液的木聚糖酶活性为628.43 U/mL;木聚糖酶的最适作用温度为45聚,最适pH为4.5,在705保温30 min后酶活力仍为60%以上,在pH 3.0-7.0内稳定性较好。预期该菌株产的木聚糖酶具有用于饲料添加剂的潜力。外源酶对玉米-豆粕-青干草型底物人工瘤胃发酵的影响利用体外培养法研究了8种不同外源复合酶组合对玉米-豆粕-青干草型底物瘤胃发酵的影响。外源复合酶由纤维素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和果胶酶组成。研究表明,各组复合酶处理的产气量、氨态氮浓度、VFA浓度与对照组相比有所增加,均存在显着差异(P<0.05)。研究结果表明,在本试验条件下,添加外源复合酶可以改变瘤胃发酵模式,提高体外发酵产气量、发酵液氨态氮浓度和VFA浓度,提高饲料的消化率。研究结果表明,在本试验条件下,高纤维素酶、低木聚糖酶处理组对玉米-豆粕-青干草类型底物降解效果较好,酸性蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶比例的变化对结果影响较小。外源酶与瘤胃内源酶互作作用的研究在反刍动物日粮中添加外源酶能提高饲料消化率的机制尚不清楚。在瘤胃中直接水解可能是一种方式,但是与瘤胃内庞大的消化酶系相比,外源酶的添加量所占比例较小,因此外源酶在瘤胃内对底物的水解所发挥的作用需要进行量化。本试验采用体外发酵法研究添加外源酶制剂对瘤胃内源酶对羧甲基纤维素、木聚糖及TMR等不同底物降解作用的影响。试验采用7不同完全随机区组设计,研究木聚糖酶、纤维素酶、瘤胃内源酶等3种单酶、复合酶A(木聚糖酶:纤维素酶:瘤胃内源酶=1:1:2)、复合酶B(木聚糖酶:瘤胃内源酶=1:1)、复合酶C(纤维素酶:瘤胃内源酶=1:1)及空白对照组共7个处理组分别在4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0等6个pH条件进行体外发酵试验。试验选用的外源纤维素酶和木聚糖酶均为粉状商品酶,使用前进行纯化。瘤胃内源酶通过采集奶牛瘤胃液,经过离心、过硫酸铵沉淀、透析脱盐、琼脂糖凝胶分离纯化等一系列步骤自行制备。在pH4.5-7.0,395条件下测定瘤胃内源酶,外源酶及复合酶对羧甲基纤维素、木聚糖和TMR的降解能力。外源酶制剂与瘤胃内源酶在降解羧甲基纤维素、木聚糖和TMR上具有互作作用。复合酶A降解TMR,葡萄糖和木糖浓度分别较瘤胃内源酶提高了86%和112%;复合酶B降解TMR,木糖浓度较瘤胃内源酶提高了217%,葡萄糖浓度变化无差异。复合酶C降解TMR,葡萄糖浓度和木糖浓度分别较瘤胃内源酶提高了43%和94%。尤其在pH6.0-6.5条件下,复合酶的降解能力更强。研究结果表明,复合酶A中纤维素酶与木聚糖酶的比例更有利于底物的降解。瘤胃内源酶和外源酶之间的互作作用提高了瘤胃内环境中的底物的降解,这可能是添加纤维素酶、木聚糖酶等外源酶促进饲料消化的重要作用机制之一。添加外源酶制剂对后备牛消化代谢及血液生化指标的影响为研究添加外源酶制剂对3-7月龄后备牛生长性能及消化代谢的影响,分别选取16头3月龄、4月龄、5月龄的后备荷斯坦奶牛,共48头。将叁月龄牛只随机分为2组,分别标记为CT,ET;将四月龄牛只随机分为2组,分别标记为CA,EA;将五月龄牛只随机分为2组,分别标记为CM,EM,共六个处理组。CT、CA,CM组牛只饲喂对照组TMR,ET、EA,EM组牛只饲喂加酶TMR,剂量为20g/日·头。结果表明:ET、CT组之间,EA、CA组之间,EM、CM组之间,试验牛只体增重和日增重均有显着差异(P<0.05),表明添加复合酶可以增加后备牛的腹围和胸围,促进后备牛的生长。对各处理组牛只瘤胃液中发酵参数测定结果显示,添加酶制剂可以增加瘤胃液中总挥发性脂肪酸和乙酸含量提高乙酸/丙酸比例,改善瘤胃发酵水平。消化试验结果表明,添加酶制剂可以提高后备牛TMR的NDF、ADF和总能表观消化率,但对蛋白质和粗脂肪表观消化率没有显着影响。对各处理组间血清学指标分析结果显示,血浆中甘油叁酯、胆固醇、ALP含量差异不显着(P>0.05),白蛋白含量和白球比在个别处理组之间存在显着差异。添加外源酶制剂对后备牛瘤胃发酵参数及瘤胃微生物变化的影响利用PCR-DGGE技术分析叁月龄、四月龄、五月龄后备牛在饲喂对照组TMR和加酶处理TMR后瘤胃内细菌和真菌的区系变化的影响。酶制剂处理使3-7月龄后备牛瘤胃微生物DGGE图谱条带数量增加,瘤胃微生物区系发生了变化。序列分析结果表明,酶制剂处理组中有2个克隆分别与普雷沃氏菌和瘤胃黄色球菌相似度高于96%,该处理可以促进瘤胃微生物区系优势菌群的建立。
参考文献：
[1]. 中性植酸酶产生菌的筛选及基因工程菌的构建[D]. 付石军. 浙江大学. 2008
[2]. 枯草芽孢杆菌植酸酶的性质研究及产酶基因的克隆和序列分析[D]. 胡勇. 四川农业大学. 2003
[3]. 产高温蛋白酶菌株的分离鉴定及蛋白酶基因的克隆与表达[D]. 尹春筱. 东华理工大学. 2018
[4]. 中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达[D]. 许波. 云南师范大学. 2004
[5]. 海南土着芽孢杆菌筛选、复合及其水质净化效果研究[D]. 朱彦博. 海南大学. 2013
[6]. 南极产低温植酸酶菌的分离、产酶条件优化及酶学性质研究[D]. 于鹏. 集美大学. 2014
[7]. 青藏高原土壤中产植酸酵微生物的筛选及酶学特性研究[D]. 王凯. 兰州交通大学. 2016
[8]. 海洋金黄色隐球酵母菊粉酶发酵生产、酶的分离纯化以及基因克隆的研究[D]. 盛军. 中国海洋大学. 2008
[9]. 木聚糖酶和纤维素酶对后备奶牛生长代谢、瘤胃发酵及微生物区系的影响[D]. 国春艳. 中国农业科学院. 2010