论文摘要
近年来, CRISPR/Cas9技术被迅速应用于生物学研究的各个领域。miRNA-125a已被证实与生殖密切相关,研究者在自然流产的患者中发现了异常的miRNA-125a。该研究利用CRISPR/Cas9技术在人绒毛膜滋养层细胞HTR8-S/Vneo中对miRNA-125a进行了定点编辑。对于定点敲除,我们首先在pX458表达载体的基础上额外引入一组启动子和sgRNA骨架序列用于片段敲除,此后分别设计用于单点敲除和片段敲除的sgRNA进行表达载体的构建,表达载体转染HTR8细胞后通过流式分选和T7EI酶切鉴定阳性单克隆;对于定点敲入,我们在体外构建供体载体,与CRISPR表达载体共转染HTR8细胞,通过流式分选和PCR鉴定阳性单克隆。DNA测序结果显示,敲除及敲入阳性单克隆细胞系在指定区域的碱基序列发生了改变; RT-qPCR结果显示,阳性单克隆细胞系中mi RNA-125a-5p和mi RNA-125a-3p的表达量较野生型也发生了相应变化;体外实验还显示, miRNA-125a有抑制HTR8-S/Vneo细胞系增殖及迁移的功能。研究证实, CRISPR/Cas9技术在细胞系中编辑mi RNAs是有效可行的,且对于miRNA-125a的定点敲除,片段敲除的效果要好于单点敲除。
论文目录
文章来源
类型: 期刊论文
作者: 王瑚,张璐,马旭,夏红飞
关键词: 人绒毛膜滋养层细胞,片段敲除,定点敲入
来源: 中国细胞生物学学报 2019年02期
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 国家卫生计生委科学技术研究所遗传优生中心,北京协和医学院研究生院
基金: 国家自然科学基金(批准号:81771590)资助的课题~~
分类号: Q78
页码: 218-227
总页数: 10
文件大小: 3371K
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标签：人绒毛膜滋养层细胞论文; 片段敲除论文; 定点敲入论文;