实时荧光环介导等温扩增技术检测土壤中的类鼻疽伯克霍尔德菌

论文摘要

目的结合荧光染料EvaGreen与环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）探索快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的可行性。方法根据类鼻疽伯克霍尔德菌filc基因片段设计了LAMP引物,利用荧光染料EvaGreen建立实时荧光环介导等温扩增技术（real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp）,优化反应条件,扩增产物经电泳鉴定。通过类鼻疽伯克霍尔德菌和其他致病菌验证特异性,比较RealAmp与普通LAMP技术的敏感度,并测定人工污染土壤模拟样本的检出限。结果恒温63℃条件下,20～60 min即可完成RealAmp检测;利用该方法检测类鼻疽伯克霍尔德菌为阳性,其余致病菌如鼠疫杆菌、布鲁氏杆菌、大肠杆菌等13株参考菌株及蜱虫的DNA（含大量假单胞菌属细菌）呈扩增阴性;RealAmp技术检测类鼻疽伯克霍尔德菌核酸的灵敏度为102CFU/mL,检测克隆株质粒的灵敏度可达101copies/μL,比普通LAMP技术的灵敏度高10倍;人工污染土壤模拟样本RealAmp的检出限为4.4×101 CFU/g,且20 min左右即可判定结果;直接检测24份浓度为4.4×101CFU/g～4.4×108CFU/g的类鼻疽伯克霍尔德菌人工污染土壤样本,在检出限以上,检出率同荧光定量PCR一致。结论该方法特异性强、灵敏度高,且可实时监测类鼻疽伯克霍尔德菌,有望成为快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的有效方法,增强抵御生物恐怖战争的能力。

论文目录

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

1.1.2 主要试剂与仪器

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成

1.2.2 细菌DNA模板的制备

1.2.3 RealAmp反应体系

1.2.4 产物电泳验证

1.2.5 RealAmp的特异性验证

1.2.6 RealAmp的灵敏度实验

1.2.6.1 细菌核酸检测灵敏度

1.2.6.2 克隆质粒检测灵敏度

1.2.7 普通LAMP的灵敏度实验

1.2.7.1 普通LAMP反应体系

1.2.7.2 细菌核酸检测灵敏度

1.2.7.3 克隆质粒检测灵敏度

1.2.8 人工污染土壤

1.2.8.1 人工污染土壤模拟样本的制备

1.2.8.2 RealAmp检测人工污染土壤的灵敏度实验

1.2.9 人工污染土壤RealAmp与实时荧光定量PCR的对比检测

2 结果

2.1 RealAmp检测类鼻疽伯克霍尔德菌方法的建立

2.2 产物的电泳结果分析

2.3 RealAmp检测类鼻疽伯克霍尔德菌方法的特异性

2.4 RealAmp与普通LAMP检测类鼻疽伯克霍尔德菌方法灵敏度的比较

2.4.1 普通LAMP检测类鼻疽伯克霍尔德菌方法的灵敏度

2.4.2 RealAmp检测类鼻疽伯克霍尔德菌方法的灵敏度

2.5 RealAmp检测人工污染土壤的检出限

2.6 RealAmp与实时荧光定量PCR的对比检测人工土壤中的类鼻疽伯克霍尔德菌

3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李子微,宾蕾,尹艳,高琦,赵勇,张平平,潘纹玉,陆沙,邓仲良

关键词: 类鼻疽伯克霍尔德菌,基因,快速检测,环介导等温扩增技术

来源: 中国人兽共患病学报 2019年03期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学,基础医学

单位: 南华大学公共卫生学院,生物应急与临床POCT北京市重点实验室(BZ0329),军事医学研究院微生物流行病研究所

基金: 国家重点研发计划(No.2017YFC1601503),中国载人航天预先研究项目(No.010101),湖南教育厅重点课题(No.15A165),南华大学大学生研究性学习与创新性实验计划(No.20164890101),南华大学自然科学基金项目资助(No.2018KYY266),衡阳市重点实验室项目(No.2018KJ110)联合资助~~

分类号: S852.61;R378

页码: 216-222

总页数: 7

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实时荧光环介导等温扩增技术检测土壤中的类鼻疽伯克霍尔德菌

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