土壤氨氧化古菌的富集、特性及耐高氨氮机制研究

论文摘要

氨氧化古细菌（AOA）在地球氮循环中发挥重要的作用,但其在农田及其他生态系统中对氨氧化的贡献,以及在这些生态系统中所扮演的角色尚不清晰,其中一因素是缺少足够可供研究的菌株。分离或富集的AOA菌株对于确认不同AOA谱系的生理特性至关重要,但是AOA富集或分离非常困难且耗时（平均2至3年）,国内外科学家经过了十几年的努力只得到了30余个AOA的培养物,这限制我们对AOA的认识。从环境中获得更多的AOA培养物对全面探索其在不同环境中的生态,生理学和基础生物化学具有重要的意义。本研究设计了一种从土壤中快速富集Nitrosocosmicus属AOA的“两步法”策略。首先,联用卡那霉素和氨苄青霉素作为抑制细菌的选择压力,并使用石英砂作为AOA细胞的附着载体。仅培养40-75天,即可获得丰度>20%的AOA富集物。在第二步中,选择环丙沙星和阿奇霉素的抗生素组合提高AOA的丰度。这两种抗生素能够针对生物膜并杀死聚集物中的细菌,仅培养一代,AOA在富集物中即可达高丰度（>90%）。按照两步法富集策略,在90-150天的富集时间内,从农田土壤中获得了3株AOA。系统发育分析表明,这些AOA属于土壤Group I.1b奇古菌中的Ca.Nitrosocosmicus属。对“两步法”的原理解析表明,氨苄青霉素与卡那霉素具有促进AOA形成生物膜的能力,有利于AOA附着在石英砂上;环丙沙星与阿奇霉素抑制AOA生物膜的形成,并且能抑制其胞外多糖的分泌。根据特性和来源将其中一株AOA命名为Candidatus Nitrosocosmicus agrestis。Ca.N.agrestis形态上是直径0.8-1.2μm的不规则球形,被较厚的胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances,EPS）包裹。在生理上该AOA在pH 6.0-8.0的范围中生长,μmax为0.033 h-1,最适温度37℃,最适盐度0-0.2%;耐受硝化抑制剂ATU,DCD,DMPP的能力强于AOB,但对NP敏感;有机物不能促进其氨氧化,但可以缓慢利用尿素。Ca.N.agrestis的基因组编码有氨氧化,碳固定,尿素利用,氨基酸合成及其他代谢途径的基因,还编码有碳水化合物酯酶,糖苷水解酶,以及多种有机物的转运通道,这些酶与多糖的合成,分泌以及分解有关,可能是生物膜形成与利用的基础。此外Ca.N.agrestis仅编码有一个低底物亲和力的铵离子通道Amt-2,并且其编码有亚细胞定位胞质的碳酸酐酶CA-β和CA-γ-2,而其他的类群的AOA只编码定位于周质的CA-γ-1。Ca.N.agrestis与其他的Ca.Nitrosocosmicus属的AOA普遍具有耐高氨氮的能力。但发现对于单个Ca.N.agrestis细胞,高氨氮不会明显抑制其氨氧化作用,但会明显抑制其蛋白质的合成效率。Ca.Nitrosocosmicus属的AOA都具有疑似多胺转运的DME通道,推测其耐氨氮机制可能是合成多胺再通过DME通道外排多胺,在此过程消耗的能量致使其合成蛋白质的量减少。利用相关基因在不同氨氮下的相对表达在转录水平上验证了该耐氨氮的机制。

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摘要

ABSTRACT

缩略词表

第一章绪论

1.1 氮循环与农田生态系统

1.1.1 氮循环

1.1.2 氮循环中的微生物

1.1.3 农田生态系统中的氮循环与氮损失

1.1.4 氮肥损失的危害

1.1.5 农田生态系统中的硝化作用与硝化微生物

1.2 氨氧化古菌（AOA）的发现及分布

1.2.1 AOA的发现过程——非培养阶段

1.2.2 AOA的发现过程——培养阶段

1.2.3 AOA的分布

1.2.4 土壤中的AOA

1.3 AOA的分类与特性

1.3.1 古菌的分类与奇古菌门

1.3.2 氨氧化古菌的分类

1.4 AOA的特性

1.4.1 AOA的生理学特性

1.4.2 AOA的基因组

1.5 氨氧化古菌的研究方法

1.5.1 基于环境的调查与实验室培养

1.5.2 系统发育研究

1.5.3 基因组研究

1.5.4 富集以及分离培养

1.6 研究意义与内容

1.6.1 研究意义

1.6.2 研究内容

第二章土壤氨氧化古菌的富集策略——两步法

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 富集土壤样品

2.2.2 理化性质测定

2.2.3 基因组DNA提取

2.2.4 PCR、克隆及测序

2.2.5 扩增子测序

2.2.6 富集培养

2.2.7 绝对定量PCR

2.2.8 荧光原位杂交（FISH）

2.2.9 扫描电镜

2.3 结果与讨论

2.3.1 广州地区农田土壤AOA群落分析及富集样品选择

2.3.2 不同抗生素对富集起始阶段的影响

2.3.3 确定AOA富集物的传代方式

2.3.4 第一步——快速获得高浓度的AOA富集物

2.3.5 第二步——快速获得高丰度的AOA富集物

2.3.6 富集物中AOA的鉴定

2.3.7 两步富集策略的验证

2.3.8 两步富集AOA策略的原理

2.4 小结

第三章 Candidatus Nitrosocosmicus agrestis的形态,生理及生化特性研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 AOA种子准备及接种方法

3.2.2 AOA生理生化实验

3.2.3 AOA形态观察

3.3 结果与讨论

3.3.1 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的形态特征

3.3.2 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化及生长特性

3.3.3 温度与NaCl浓度对Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影响

3.3.4 亚硝酸盐浓度对Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影响

3.3.5 氨氮与pH对Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影响

3.3.6 尿素对Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影响

3.3.7 氰酸盐对Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影响

3.3.8 有机碳源对Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影响

3.3.9 氨氧化抑制剂对Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氨氧化的影响

3.4 小结

第四章 Candidatus Nitrosocosmicus agrestis基因组的解析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 SS富集物的宏基因组测序样品准备

4.2.2 宏基因组文库构建及测序

4.2.3 宏基因组数据分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 富集物宏基因组DNA样品的准备

4.3.2 宏基因组数据处理

4.3.3 基于ANI及标记基因的进化分析

4.3.4 Ca. Nitrosocosmicus agrestis基因组基本信息

4.3.5 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的代谢途径及其他功能总览

4.3.6 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的能量代谢

4.3.7 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的谢

4.3.8 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的氮代谢

4.3.9 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的碳水化合物活性酶（CAZy）

4.3.10 Ca. Nitrosocosmicus agrestis的转运蛋白

4.4 小结

第五章 Candidatus Nitrosocosmicus agrestis的耐氨氮机制研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 不同氨氮浓度下的AOA培养

5.2.2 RNA提取及反转录

5.2.3 相对荧光定量PCR

5.2.4 蛋白质提取与定量

5.2.5 培养基上清液中的多胺成分分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 基于基因组信息分析Ca. Nitrosocosmicus agrestis的耐氨氮机制

5.3.2 氨氮代谢相关基因的表达分析

5.3.3 不同氨氮下的能量利用分析

5.3.4 不同氨氮下的分析多胺释放量分析

5.3.5 Ca. Nitrosocosmicus agrestis耐氨氮机制的生态意义

5.4 小结

结论与展望

结论

创新之处

展望

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢

附件

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘亮霆

导师: 林炜铁

关键词: 氨氧化古菌,农田土壤,两步法,生理与基因组特性,耐氨氮

来源: 华南理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,农艺学

单位: 华南理工大学

基金: 国家自然科学基金(41473072)

分类号: S154.3

DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.004308

总页数: 180

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