百合DXS基因的克隆及功能分析初探

论文摘要

百合是世界著名的球根花卉,具有极高的观赏价值和经济价值。通常亚洲百合无香,喇叭百合和东方百合香味浓烈,影响其实用价值。百合花香差异的主要原因是萜烯类物质的差异释放,因此,本研究集中于萜烯类合成途径中的第一个基因1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）基因。试验结果如下:（1）应用RACE技术,从‘演员’中克隆获得了DXS基因的cDNA序列,命名为LeDXS（GenBank登录号为MF576067）。该序列全长2471 bp,包含一个2142 bp的开放阅读框,编码713个氨基酸,预测蛋白分子量约为76.3 kD。系统进化分析结果显示,LeDXS属于II型DXS。亚细胞定位预测定位于叶绿体中。（2）qRT-PCR结果表明,LeDXS基因在不同品种百合花瓣中均有表达,且浓香型百合DXS表达量显著高于淡香型和无香型。对LeDXS表达水平与单萜类物质总量相关性分析发现,DXS表达水平与单萜类物质释放量不存在显著相关性。（3）通过农杆菌介导的烟草遗传转化,GUS染色结果显示瞬时转化率为70%,稳定遗传转化只获得两个卡那霉素抗性的愈伤。（4）将‘朱丽叶’种子播种于MS基本培养基上,30 d后,发芽率为39.2%;以组培苗嫩叶为外植体,筛选出较适宜诱导愈伤组织的培养基为:MS+1.5 mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+6 g/L琼脂,诱导率为20.43%;愈伤增殖效果最佳培养基为:MS+2.0 mg/L PIC+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂,增殖率为0.0203 g/d;愈伤分化最佳培养基为MS基本培养基,分化率为100%。以上结果为研究百合DXS生物学功能和建立百合遗传转化体系奠定了基础,同时也为百合花香育种提供了理论依据。

论文目录

摘要

英文缩略语表

第一章文献综述

1.1 百合概述

1.2 花香概述

1.2.1 植物花香种类及释放规律

1.2.2 花香代谢合成途径

1.2.3 百合花香研究进展

1.3 DXS基因研究进展

1.4 百合遗传转化概述

1.4.1 百合愈伤诱导研究进展

1.4.2 百合遗传转化研究进展

1.5 本研究的目的和意义

1.6 技术路线

第二章东方百合DXS基因的克隆

2.1 材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.2 方法

2.2.1 百合总RNA的提取及检测

2.2.2 cDNA第一链的合成

2.2.3 5’/3’序列的获得

2.2.4 DXS基因全长克隆

2.2.5 DXS基因的生物信息学分析

2.3 结果与分析

2.3.1 总RNA的提取结果

2.3.2 DXS基因5’-RACE/3’-RACE序列的获得

2.3.3 LeDXS基因cDNA全长克隆

2.3.4 DXS蛋白结构分析

2.3.5 聚类分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 DXS基因表达研究

3.1 材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 主要试剂

3.1.3 仪器设备

3.2 方法

3.2.1 百合总RNA的提取及检测

3.2.2 cDNA第一链的合成

3.2.3 荧光定量PCR分析

3.2.4 百合单萜类花香释放与DXS相对表达量相关性分析

3.3 结果与分析

3.3.1 各样品总RNA的提取结果

3.3.2 DXS基因在品种间的表达模式

3.3.3 总单萜类含量与DXS的表达水平相关性分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章烟草遗传转化初探

4.1 材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 菌株、载体及主要试剂

4.1.3 主要试剂及培养基配制

4.1.4 主要仪器设备

4.2 方法

4.2.1 pBI121-LeDXS载体的构建

4.2.2 转化农杆菌

4.2.3 pBI-LeDXS过表达载体对烟草的遗传转化

4.2.3.1 侵染液的制备

4.2.3.2 烟草遗传转化条件探索

4.2.4 转化叶片GUS检测

4.2.4.1 GUS染色工作液配制

4.2.4.2 GUS染色步骤

4.3 结果与分析

4.3.1 pBI-LeDXS过表达载体的检测

4.3.2 pBI-LeDXS过表达载体的农杆菌转化

4.3.3 农杆菌介导的烟草遗传转化

4.3.4 GUS基因瞬时表达

4.4 讨论

4.5 小结

第五章百合再生体系的建立

5.1 材料

5.1.1 植物材料

5.1.2 主要试剂

5.1.3 主要试剂配制

5.1.4 主要仪器设备

5.2 方法

5.2.1 ‘朱丽叶’组培苗的获得

5.2.2 愈伤组织诱导

5.2.3 愈伤组织增长

5.2.4 分化培养基的筛选

5.3 结果与分析

5.3.1 ‘朱丽叶’组培苗的获得

5.3.2 愈伤组织诱导

5.3.3 愈伤组织增长

5.3.4 分化培养基的筛选

5.4 讨论

5.5 小结

第六章结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

Abstract

作者在攻读硕士期间公开发表的论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张浩宇

导师: 杜方

关键词: 百合,脱氧木酮糖磷酸合酶基因,荧光定量,遗传转化,组织培养

来源: 山西农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 山西农业大学

基金: 山西省应用基础研究项目,百合SNP标记的开发及群体遗传机制研究(项目编号:201601D011077),山西农业大学引进人才科研启动项目,新,奇,特,优百合的引种选育及扩繁推广(项目编号:2014ZZ02),山西省研究生教育改革研究课题,基于问题的案例教学改革理论与实践-以园艺专业学位研究生培养为例(项目编号:2017JG37)

分类号: S682.29;Q943.2

DOI: 10.27285/d.cnki.gsxnu.2019.000151

总页数: 63

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