论文摘要
副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,H.parasuis）是巴斯德氏菌科（Pasteurellaceae）嗜血菌属的革兰氏阴性菌,早期定植在猪的上呼吸道,当宿主遭受环境迫害或免疫力下降时,它会扩散到肺部并导致肺炎,甚至进入血液循环并侵入多个组织,引起全身性格拉瑟氏病（Glsser’s Disease）,多为纤维性多发性浆膜炎,关节炎和脑膜炎等症状,疾病的爆发对全球养殖者造成了一定影响。细胞致死膨胀毒素（Cytolethal distending toxin,CDT）是H.parasuis的重要毒力因子,由亚基CdtA、CdtB、CdtC组成。为了解副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素（HpCDT）与宿主细胞相互作用机制,本研究以PK-15细胞为模型,应用酵母双杂交的方法筛选宿主细胞相互作用蛋白。（1）构建酵母双杂交cDNA文库:提取PK-15细胞的总RNA,运用SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA,再将纯化后的ds cDNA与pGADT7-Rec共转化至Y187酵母感受态细胞,在SD/-Leu营养缺陷培养平板上筛选培养,收集PK-15细胞的酵母cDNA文库。经检测,文库滴度达到了7.5×107CFU/mL,插入的双链cDNA片段范围为3002000 bp,片段平均大小为500 bp。基本符合构建文库的要求,可用于与HpCDT不同亚基蛋白相互作用的蛋白筛选。（2）构建诱饵质粒:以PCR方法扩增cdtA,cdtB,cdtC基因片段,定向克隆至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,利用PEG/LiAc法将空载体pGBKT7及重组载体转化至Y2H Gold酵母感受态细胞,用筛选培养基检测其毒性和自激活活性。双酶切及测序验证正确,成功构建pGBKT7-CdtA,pGBKT7-CdtB,pGBKT7-CdtC诱饵载体;转化产物涂布于SD/-Trp中,空载体pGBKT7及重组载体上酵母数量,大小无明显差异,证明重组载体对其无毒性;转化产物涂布于SD/-Trp,SD/-Trp/X-α-gal平板上,有菌落生长,涂于SD/-Trp/X-α-gal/AbA,无菌落生长,证明重组载体对酵母菌种无自激活活性。成功构建酵母双杂交载体pGBKT7-cdtA,pGBKT7-cdtB及pGBKT7-cdtC,证明其无毒性和自激活活性,为进一步筛选与PK-15细胞文库相互作用蛋白奠定基础。（3）Mating方法筛库及点对点验证:肾上皮细胞（PK-15）cDNA文库构建好的诱饵载体pGBKT7-cdtA,pGBKT7-cdtB,pGBKT7-cdtC进行酵母双杂交筛选,并将杂交液部分涂布到SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp营养缺陷型平板上,观察菌落的生长状态;剩余的杂交液全部涂布到SD/-Leu/-Trp/X-α-gal/AbA营养缺陷型平板上,筛选相互作用的阳性菌落,筛选到的阳性菌落克隆到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal/AbA营养缺陷型平板上进行再筛选,重复在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal/AbA营养缺陷型平板上筛选一次,对筛选到的阳性菌落提取质粒,并进行扩大培养,送测序及BLAST分析,最终初步筛选到5种与CdtA相互作用的蛋白,经过回复性验证,分别为线粒体核糖体蛋白S26（MRPS26）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、DNA甲基化结合蛋白3（MBD3）、屏蔽自整合因子1（BANF1）、核糖体蛋白L32（RPL32）。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 李晓月
导师: 倪宏波
关键词: 副猪嗜血杆菌,细胞致死膨胀毒素,酵母双杂交,互作蛋白的筛选
来源: 黑龙江八一农垦大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,畜牧与动物医学
单位: 黑龙江八一农垦大学
基金: 国家重点研发计划项目(2017YFD0501000),黑龙江八一农垦大学研究生创新项目(YJSCX2017-Y36),猪流行性腹泻病毒变异毒株检测及疫苗株培育项目(CXRC2017009),哈尔滨兽医研究所王春来副研究员提供的黑龙江省自然科学基金项目(C2016067)
分类号: S852.61
总页数: 70
文件大小: 4420K
下载量: 110
相关论文文献
标签：副猪嗜血杆菌论文; 细胞致死膨胀毒素论文; 酵母双杂交论文; 互作蛋白的筛选论文;