王丽珍, 李蕾[1]2006年在《釉原蛋白、釉蛋白及成釉蛋白在小鼠牙胚组织发育过程中的表达》文中认为目的比较小鼠釉原蛋白(Amelogenin,AMELX)、成釉蛋白(Ameloblastin,AMBN)和釉蛋白(Enamelin, ENAM)在牙胚组织发育过程中表达的差异,从而揭示其不同的功能。方法选择牙胚发育期分别位于钟状期、钟状晚期、釉质成熟期的昆明小鼠头颅切片,使用抗鼠 AMELX、AMBN 和 ENAM 多克隆抗体(由美国德州大学健康科学中心 Dr． Simmer 赠送),行免疫组织化学 En Vision二步法染色,观察叁种蛋白在叁种发育阶段小鼠头颅切片中的表达情况．结果免疫组化结果显示,叁种蛋白在叁种小鼠牙胚的成釉细胞、釉质、牙本质中的表达存在时空顺序差异,随着牙胚发育和釉质成熟,AMELX 呈递减表达,而 AMBN 和 ENAM 则较恒定表达。AMELX 在周围发育中的编织状骨组织中也有微弱表达．结论 AMELX、AMBN 和 ENAM 为主要的釉质基质蛋白,在牙胚发育的不同阶段有不同的调节矿化的作用,AMELX 在釉质矿化早期促进晶体生长,而其在骨中的表达则进一步表明其在骨修复中可能的作用；AMBN 促进釉质基质矿化,并维持晶体形状、大小；ENAM 促进和维持晶体生长,并与再矿化有关。
郭鹏, 吴补领, 田宇, 逄键梁, 张敬雷[2]2003年在《成釉蛋白在小鼠牙胚发育不同时期的免疫组化定位》文中提出目的 :观察成釉蛋白 (ameloblastin ,AMBN)在小鼠牙胚发育不同时期的表达和分布情况。方法 :采用免疫组化的方法观察AMBN在小鼠牙胚不同时期的表达和定位。结果 :蕾状期、帽状期和钟状早期牙胚中未见AMBN的表达 ;出生后 1d钟状期 ,在成釉细胞和釉基质中呈强阳性表达 ,成牙本质细胞和牙本质基质中呈弱阳性表达 ;出生后 3d ,在成釉细胞胞浆中呈弱阳性表达 ,在成牙本质细胞中表达阳性 ,着色较成釉细胞深 ;出生后 7d ,AMBN在成釉细胞托姆氏突呈弱阳性表达 ,其余部位呈阴性表达。在牙胚发育的各个时期 ,AMBN在外釉细胞、星网层细胞、牙乳头细胞均呈阴性表达。结论 :AMBN参与釉基质的形成 ,可能与牙胚发育中基质形成的信息传递有关
郭鹏[3]2003年在《成釉蛋白在小鼠牙胚发育中的表达和作用研究》文中研究表明牙釉质基质蛋白(enamel matrix protein)是牙齿发育过程中由上皮来源的细胞在外胚间充质细胞诱导下分泌的，这些蛋白不但是构成釉质形态和结构的支架，而且在其生物矿化以及牙本质形成过程中发挥重要的调控作用。成釉蛋白(ameloblastin，AMBN／sheathlin／amelin)，又称鞘蛋白(sheath proteins)，是釉质基质中含量最多的非釉原蛋白，是釉质基质蛋白的重要组份，主要分布在牙釉质的釉柱鞘中，被认为是牙齿特异性蛋白。近年来，不少学者在AMBN的基因特征、蛋白结构和功能、组织定位等方面展开了深入的研究，先后克隆了小鼠、大鼠、猪、人和鳄鱼等的基因序列，用免疫组化或原位杂交方法对部分种属的动物和人的AMBN或AMBN mRNA的表达进行了时空定位，并在此基础上对蛋白的功能作了初步研究。但是，关于该蛋白的许多问题仍悬而未决，尤其是AMBN在牙齿发育中的作用，大部分结论都是由推测得到的，缺少直接的证据。为进一步明确AMBN在牙齿发育中的作用，本研究采用分子生物学、器官培养、电镜等方法，对AMBN的功能作了进一步研究和探讨，以期揭示AMBN影响牙齿发育的作用机制。本研究分两个部分，具体内容如下： 1 AMBN在小鼠牙胚发育中的表达 实验采用免疫组化技术，应用AMBN血清抗体对小鼠第一磨牙牙胚 第四军医大学硕士学位论文AMBN的表达特点进行了研究。结果显示：AMBN在分泌期的成釉细胞。新形成的釉质基质呈强阳性表达，在成牙本质细胞中呈一过性的弱表达，牙胚处于蕾状期、帽状期、钟状早期的各层细胞以及在钟状晚期的外釉细胞层、星网层、牙乳头细胞和细胞间质中阴性表达。推测，AMBN不参与牙齿发育早期（如成釉细胞、成牙本质细胞的分化等）的调控，但对釉质基质的形成和分泌起了重要的作用，AMBN不是组成牙本质的蛋白，但参与了牙本质形成过程，并在启动牙本质基质形成中具有信号分子作用。2 AMBN反义核酸对体外培养牙胚发育的影响研究 为了明确AMBN在牙胚发育中的作用，我们用牙胚体外培养。反义核酸和电镜等技术，对小鼠牙胚发育中的AMBN功能进行了研究。首先成功建立了昆明鼠牙胚体外培养体系，应用的培养环境为BGJb无血清、无抗生素半固态培养体系，牙胚在体外培养最长达 20 d，所建立的牙胚培养体系完整再现了牙胚从帽状晚期或钟状早期到牙根开始形成这一主要的牙胚发育阶段，成釉细胞也从内釉上皮发育成具有分泌功能的成釉细胞，并出现基质的分泌，不仅如此，还在体外成功观察到了上皮根鞘的形成和上皮隔结构；其次，设计合成了AMBN反义核酸，应用所建立的牙胚体外培养体系，分别用光镜和电镜观察了AMBN被反义核酸阻断表达后小鼠牙胚发育的情况。经用Western蛋白印迹检测表明，所设计的反义核酸对AMBN InRNA具有良好的封闭效果并成功阻断了牙胚对AMBN的表达；在缺乏AMBN情况下，与对照组相比，实验组牙胚在体外可以继续生长发育至钟状晚期，出现成釉细胞和成牙本质细胞的分化，成釉细胞可以分化成为分泌期型成釉细胞，胞浆中缺少合成蛋白质所必需的粗面内质网和高尔基氏体，缺乏溶酶体，表明对蛋白合成和脚的能力降低；实验组牙胚有牙尖形成和基质分泌，但牙尖形态异常，基质形成减少，牙尖周围基质（釉质基质和牙本质基质）最厚处为O．6卜m，明显薄于对照组的5．spin，基质中胶原纤维粗细不等，排列稀疏， 3 第四军医大学硕士学位论文未见钙化现象，充分证明了AMBN在牙胚发育中参与釉质基质形成和矿化过程，影响胶原纤维和牙本质基质的合成，促进成釉细胞对蛋白质的合成和釉质基质蛋白降解。结果说明，AMBN通过影响成釉细胞的生理代谢来影响牙胚的发育。
李晓聪[4]2018年在《Vps4b在基因敲除小鼠牙胚发育中的时空表达及作用研究》文中进行了进一步梳理背景与目的细胞液泡蛋白质分选因子4 B(Vacuolar protein sorting 4B,VPS4B)是AAA ATP酶家族成员之一,在细胞内蛋白质运输、溶酶体降解、病毒体出芽以及调节有丝分裂等过程中发挥着重要的作用。本课题组此前对一个牙本质发育不良I型(Dentin dysplasia type I,DD-I)家系进行外周血基因测序发现其致病基因为VPS4B,其次通过体外细胞实验初步阐述VPS4B基因通过Wnt通路调控牙齿的发育过程。为阐明该基因在牙齿发育过程中的详细作用机制,构建Vps4b基因敲除小鼠展开进一步的研究。本实验运用已成功构建的Vps4b基因敲除小鼠模型,明确Vps4b基因在牙胚发育过程中的分布情况,并探讨该基因突变对牙齿发育相关基因的影响,进一步揭示该基因在牙齿致畸中的作用机制。材料与方法以CRISPR-Cas9技术构建的Vps4b基因敲除小鼠模型为研究对象,采用定点交配的方式合笼,记录怀孕时间。分别于怀孕13.5、14.5、16.5天断颈处死孕鼠取胎鼠头部及尾巴;于出生后2.5天和7天处死新生小鼠取下颌骨和尾巴。采用PCR技术鉴定胎鼠及新生幼鼠的基因型。将胎鼠头部及幼鼠下颌骨石蜡包埋后获取下颌第一磨牙牙胚组织切片,通过HE染色确定各组牙胚的发育时期,免疫组织化学方法分别检测不同发育时期的正常小鼠下颌第一磨牙牙胚中Vps4b、Dspp和Col-I的表达分布情况,并对比Vps4b基因敲除后小鼠牙胚中Vps4b、Dspp和Col-I的表达变化。结果PCR结果显示子代小鼠基因型为Vps4b~(+/+)和Vps4b~(+/-)两种。HE染色表明胚胎13.5、14.5、16.5天的小鼠下颌第一磨牙牙胚分别发育至蕾状期、帽状期和钟状期,出生后2.5天、7天牙胚处于分泌期和矿化期。正常小鼠免疫组织化学染色显示:蕾状期和帽状期时,Vps4b在牙胚中广泛表达,Dspp和Col-I均无表达;钟状期Vps4b表达于内、外釉上皮、牙乳头和牙囊,Dspp在内釉上皮和牙乳头中表达,Col-I表达于牙乳头和牙囊;分泌期和矿化期Vps4b、Dspp和Col-I在成釉细胞、成牙本质细胞和牙囊中均有表达,牙乳头亦可见Vps4b和Col-I的阳性表达。小鼠基因突变后Vps4b在蕾状期成釉器中变为阴性表达,在一些组织中表达强度变弱(P<0.05);Dspp在钟状期的牙乳头和分泌期的牙囊中均未见表达,在分泌期的成釉细胞、成牙本质细胞和矿化期牙囊中阳性细胞数减少(P<0.05);Col-I在钟状期、分泌期和矿化期的表达部位均无变化,仅在部分组织表达强度下降(P<0.05)。结论在Vps4b~(+/+)小鼠发育过程中Vps4b表达于不同阶段的牙胚中且随着发育的进行表达强度发生改变,说明Vps4b可能参与了牙胚的正常发育。在Vps4b~(+/-)小鼠发育过程中Vps4b表达强度减弱,且牙齿发育相关蛋白的表达下降,推测其可能通过调节自身及牙齿发育相关蛋白的表达进而影响牙齿的发育。
张宇涛[5]2016年在《ClC-3对牙和颌骨发育的影响》文中指出ClC-3氯通道属于电压门控型氯离子通道。研究表明ClC-3在成骨细胞和破骨细胞中表达,且其过表达可促进骨矿化因子的分泌[1]。同时ClC-3在破骨细胞中通过调节细胞酸化来促进骨吸收[2]。此外ClC-3氯通道在小鼠的牙胚中也有所表达,其mRNA在成釉细胞类细胞LS-8和成牙本质类细胞MDPC-23中表达。但是ClC-3对骨骼和牙发育得影响并没有详细报道。此次试验我们主要观察ClC-3对颅颌骨和牙发育的影响。我们首先利用BALB/c小鼠来验证CLC-3在牙胚中的表达与分布,基于此预试验的结果,我们建立了ClC-3基因缺陷的斑马鱼动物模型,观察ClC-3氯通道基因缺陷对牙齿和骨骼发育的影响。具体实验内容如下:1、选取出生前孕13.5 d、15.5 d、18.5 d的BALB/c胎鼠和出生后1 d、5 d的BALB/c仔鼠,进行常规的组织处理、石蜡包埋和系列的切片,在对石蜡切片进行CLC-3免疫组化染色,观察CLC-3蛋白在小鼠牙胚中的分布与表达。2、分析斑马鱼的clcn3基因结构特征,设计并合成clcn3特异的Morpholino,摸索斑马鱼clcn3 Morpholino的最佳显微注射浓度,建立ClC-3基因缺陷的斑马鱼动物模型,并观察注射后斑马鱼的一般性状及特异性的颅颌骨和牙齿的改变。实验结果如下:1、CLC-3蛋白在小鼠胚胎第15.5 d到出生后五天的下颌第一磨牙均有表达,且随着不同的发育阶段表达特点也不一样。在小鼠牙胚发育为蕾状期时表达于口腔上皮细胞,帽状期时在牙乳头和牙囊细胞中表达。钟状晚期及小鼠出生后可见CLC-3蛋白在牙乳头细胞、牙囊细胞、成釉细胞、成牙本质细胞和星网状层细胞、中间层细胞广泛表达。2、clcn3在不同发育阶段的斑马鱼存在表达,并有一定的组织分布规律;通过摸索,我们发现clcn3 Morpholino的最佳注射浓度为0.25 nmol/μl,且M2的注射效果最佳。注射后发现斑马鱼出现以下一些表型变化:心脏水肿、搏动频率减慢、造血功能障碍、身体发育短小、骨骼弯曲且活动力减弱等。颅颌骨的畸形主要包括:腹侧观舌骨小角排列成倒“V”形,且夹角增大;腮弓软骨呈“一”字形排列。严重者颅颌骨排列失去正常结构,且排列混乱;斑马鱼颅部的头尾径长度减小。背侧观颅部小梁发育左右不对称且变短。牙齿的主要变化为:斑马鱼的牙齿数量减少,多为一颗,且疏松地附着在第五腮弓软骨上。通过以上实验,我们发现CLC-3蛋白在小鼠牙胚以及不同发育阶段的斑马鱼表达,ClC-3氯通道基因缺陷可造成斑马鱼颅颌骨及牙齿的发育异常。ClC-3通过何种机制影响颌骨和牙的发育,我们将在后续试验中深入。
王丽珍, 李蕾[6]2006年在《釉原蛋白、釉蛋白及成釉蛋白在小鼠牙胚组织发育过程中的表达》文中研究说明目的:比较小鼠釉原蛋白(amelogenin,AMELX)、成釉蛋白(ameloblastin,AMBN)和釉蛋白(enamelin,ENAM)在牙胚组织发育过程中表达的差异,从而揭示其不同的功能。方法:选择牙胚发育期分别位于钟状期、钟状晚期、釉质成熟期的昆明小鼠头颅切片,使用抗鼠AMELX、AMBN和ENAM多克隆抗体(由美国德州大学健康科学中心Dr.Sim-mer赠送),行免疫组织化学EnVision二步法染色,观察叁种蛋白在处于叁个不同发育阶段小鼠头颅切片中的表达情况。结果:免疫组化结果显示,叁种蛋白在叁种小鼠牙胚的成釉细胞、釉质、牙本质中的表达存在时空顺序差异,随着牙胚发育和釉质成熟,AMELX呈递减表达,而AMBN和ENAM则较恒定表达。AMELX在周围发育中的编织状骨组织中也有微弱表达。结论:AMELX、AMBN和ENAM为主要的釉质基质蛋白,在牙胚发育的不同阶段有不同的调节矿化的作用,AMELX在釉质矿化早期促进晶体生长,而其在骨中的表达则进一步表明其在骨修复中可能的作用;AMBN促进釉质基质矿化,并维持晶体形状、大小;ENAM促进和维持晶体生长,并与再矿化有关。
王丁[7]2014年在《小鼠磨牙牙胚发育过程中Caveolin-1、CD147和MMP-2的时空表达研究》文中研究说明牙齿发育是外胚层来源的牙上皮和神经脊来源的间充质相互作用的结果。由多种信号分子间的级联反应构成的信号网络调节着牙齿的形态发生、组织分化和硬组织形成。基底膜位于上皮组织和外胚间充质组织之间，它的及时降解，使两者接触相互作用，传递信号诱导牙齿发育。胞膜窖(Caveolae)是细胞膜表面特异性内陷微区，提供了细胞信号转导的平台，其标记蛋白窖蛋白-1（Caveolin-1）处于细胞信号传导的中心位置，能够募集多种信号分子至Caveolae，并调节它们的活性。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)可能参与成釉器-牙乳头基底膜的改建和最终的降解，并且诱导细胞移行和生长分化。体外研究证明：Caveolin-1作为负性调节剂，与细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN/CD147)结合，阻碍CD147糖基化和自身寡聚化，调节CD147介导的信号传导，进而影响MMP活性。然而，在牙齿发育的不同阶段，Caveolin-1、CD147和MMP-2的时空表达模式，以及叁者的时空表达模式间有无联系仍不清楚。目的检测Caveolin-1、CD147和MMP-2在不同发育阶段小鼠牙胚中的表达，探讨叁者在小鼠牙胚发育过程中的时空表达模式及相互关系，为深入研究Caveolin-1在牙胚发育中的作用奠定基础。方法收集小鼠胚胎期E11.5、E13.5、E14.5、E16.5、E18.5天和出生后两天（PN2）的下颌第一磨牙牙胚。采用免疫组织化学技术检测Caveolin-1、CD147和MMP-2在上述牙胚组织中的表达，并分析其表达模式间的关联性。结果牙板期E11.5天，在牙上皮和间充质中未检测到Caveolin-1、CD147和MMP-2的表达。蕾状期E13.5天，Caveolin-1表达于牙上皮结构。CD147弱表达于致密间充质。未检测到MMP-2的表达。帽状期E14.5天，Caveolin-1和CD147在成釉器中的表达均明显增强。Caveolin-1高表达于成釉器的舌侧部分，而CD147高表达于成釉器的唇侧部分，二者在表达部位上呈现出明显的异质性。未检测到MMP-2的表达。钟状早期E16.5天，Caveolin-1在未来牙合面部位的内釉上皮中强表达。CD147表达在内釉上皮、中间层和星网状层。MMP-2的表达较之前明显增强，主要位于内釉上皮，尤其在基底膜表达明显。钟状晚期E18.5天，Caveolin-1和CD147都表达于内釉上皮，Caveolin-1的表达强度弱于CD147。MMP-2广泛弱表达于内釉上皮、外釉上皮以及牙乳头。出生后PN2天，Caveolin-1强表达于成釉细胞和颈环处的牙上皮。CD147强表达于成釉细胞和成牙本质细胞，但在颈环处表达较弱；MMP-2主要表达于成釉细胞，尤其在成釉细胞和中间层相邻接处表达明显。结论1. Caveolin-1、CD147和MMP-2参与了小鼠牙胚发育。2.在小鼠牙胚发育的蕾状期至钟状早期，Caveolin-1与CD147的表达存在拮抗性，提示可能在牙胚发育过程中Caveolin-1参与CD147表达的调节。
吕晓琳[8]2016年在《Cdc42对小鼠釉质发育影响的初步研究》文中研究表明研究背景和目的在牙齿牙釉质的发育过程中,成釉细胞的功能十分重要。它既具有合成和分泌釉质基质的功能,又对其合成分泌的基质有重吸收以及降解的作用,同时它还和钙盐的转运相关,因此成釉细胞是釉质形成过程中十分关键的细胞。当外界环境或者内在营养、遗传等因素发生变化时,都有可能导致成釉细胞的分化产生异常,从而会造成牙釉质不同程度的发育不全。为了明确釉质发育过程及其影响因素,许多国内外学者针对成釉细胞的细胞学特性进行相关探索。在导致牙釉质结构异常的各种疾病原因中,由于遗传因素而不涉及全身其他疾病的异常称为遗传性牙釉质发育不全(amelogenesis imperfecta,AI)。目前我国对触的研究多局限于家族病例的报道,而国外学者对AI的病因进行了深入探索。对于导致趟的病因中,首先被确定的致病基因是编码釉原蛋白的基因。迄今为止,已发现的釉原蛋白(AMELX),釉蛋白(ENAM),金属基质蛋白酶20(MMP20)和丝氨酸蛋白酶4(KLK4)这四个致越基因的突变数目分别为15、9、4和1。但它们突变引起的舡仅占所研究越家族数目的四分之一,这说明还存在别的与趟发病相关基因[2]。很多学者也对此进行了相关研究。近来的研究开始围绕着Rho介导的信号通路在釉质发生过程中发挥的潜在调节作用[扪。Rho蛋白属于小G蛋白家族,是Ras超家族的亚家族成员。通常,我们根据Rho蛋白基因序列的同源程度和功能不同,可以将其分为RhoA、 Rac1、Cdc42及缺乏GTP酶活性等四大类。其中RhoA、Rac1、Cdc42经常被学者们作为研究的重点。Rho蛋白在信号转导过程中起主调控器的作用,大部分Rho蛋白快速转换于与GTP结合和与GDP结合这两种状态之间,即活化状态和非活化状态。因此,它能够在细胞的信号转导过程中起到“分子开关”作用。它们在调节肌动蛋白细胞骨架方面起到举足轻重的作用,同时显着影响转录因子活性、膜运输途径、细胞极性和微管动力学。即它们参与调控细胞内吞作用和胞外分泌、细胞形状和细胞与细胞相互作用,以及调控细胞极性、细胞运动等生理过程[5,61。作为Rho蛋白家族的主要成员之一,细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在与GTP结合时呈激活状态,反之与GDP相结合时则呈失活状态。在与GTP结合时,Cdc42能够激活其下游的效应因子,进而会导致一系列的细胞反应。研究显示Cdc42在细胞生长、分化、程序化死亡、细胞极性的建立等方面起到重要作用,在细胞内参与了许多重要的代谢调控过程。Cdc42能够诱导伪足等的重建,并且使肌动蛋白多聚化和组装[7],从而参与了细胞骨架的维持及重组。同时,有研究人员认为Cdc42是通过影响p21CIPI的功能从而参与调控锚定依赖性细胞的细胞周期[8],以及在细胞外因子刺激细胞引起的转录过程中发挥较重要作用。此外,Cdc42分子有助于细胞内吞作用,常发生于一些特殊的微环境。目前,尚未发现有关Cdc42蛋白在牙齿发育过程尤其釉质发育过程中具体表达情况以及发挥作用的研究报道。因此,本实验旨在明确Cdc42在小鼠牙齿发育过程中的具体表达,并且对其在小鼠成釉细胞中可能发生的作用进行初步探讨。本论文分以下四个部分内容：第一章：Cdc42在小鼠牙胚发育中的表达本实验分别获取E13.5、E15.5、E17.5及E19.5的小鼠磨牙牙胚,经过固定、脱水、透明、包埋蜡块,最后得到组织切片。将组织切片进行HE染色和组织免疫荧光检测。通过免疫荧光方法检测整个牙胚发育包括蕾状期、帽状期、钟状期、钟状晚期等过程中Cdc42的表达情况,初步了解其在牙胚发育尤其釉质发育过程中都有不同程度的表达。第二章：小鼠成釉细胞离体培养、纯化及鉴定本实验通过酶消化法体外培养小鼠成釉细胞,缩短培养时间。以基底膜抽提物包被,利于细胞贴壁及生长。并通过差速消化法,可获得纯化的成釉细胞。其纯度较高,有利于相关基础研究的进行,为小鼠成釉细胞的体外培养及纯化提供了思路。第叁章：Cdc42在小鼠成釉细胞中的表达本实验通过RT-PCR从mRNA水平证实了小鼠成釉细胞中Cdc42的存在,用Western blot从蛋白水平检测了Cdc42在小鼠成釉细胞中的表达,最后通过免疫荧光进一步明确定位Cdc42主要表达于小鼠成釉细胞胞膜与胞质位置,为以后探讨Cdc42在小鼠成釉细胞中所发挥生物学功能影响奠定了基础。第四章：抑制Cdc42对小鼠成釉细胞釉基质蛋白表达的影响本实验通过运用Cdc42抑制剂ML141培养小鼠成釉细胞,达到抑制细胞中Cdc42。再通过Western blot检测小鼠成釉细胞中釉基质蛋白表达水平,从而初步探寻Cdc42对釉质发育过程可能发挥的作用。材料与方法小鼠牙胚切片的制作分别获取E13.5、E15.5、E17.5及E19.5组织标本。将标本置于4%多聚甲醛溶液中固定后,再通过50%、70%、80%、90%、95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%I、100%Ⅱ的乙醇溶液中按由低到高梯度浓度达到脱水目的。脱水完成的标本放入二甲苯中透明,再置于60℃的蜡中浸蜡。浸蜡后的组织按照切片需要方向包埋出蜡块。石蜡切片机上5 μm连续切片,捞片放入烤箱备用。HE染色将组织切片浸入二甲苯中脱蜡,之后依次经过由低到高梯度浓度乙醇溶液复水。苏木精染核,盐酸酒精溶液分化脱色,流水返蓝,镜下观察至合适深度后浸入伊红溶液中染色。复染好的组织切片再次经过脱水透明步骤,最后树胶封片,正置显微镜下观察。组织免疫荧光将组织切片浸入二甲苯中脱蜡,之后依次经过梯度浓度乙醇溶液复水。蒸馏水洗涤之后,运用枸橼酸钠溶液进行抗原热修复。再通过BSA封闭液封闭非特异性抗原。一抗4℃孵育过夜,二抗及Hoechst避光室温孵育后,荧光防淬灭甘油封片,荧光显微镜下观察。小鼠成釉细胞离体培养取新生小鼠脱颈处死浸泡于75%酒精中消毒后,沿上下颌骨中线将头部分为上下两部分,置于预冷无菌的D-Hanks溶液中清洗,于体视显微镜下完整分离上下颌中的第一磨牙牙胚。将牙胚收集加入0.25%含有EDTA的胰酶中,剪碎并37℃消化20 mmin,每5 mmin钟摇晃一次以促进胰酶作用均匀。将所得细胞悬液1000r/min离心5 mmin,弃去上清,用含有10%胎牛血清的DMEM培养基重悬,接种于用0.25 mg/mL Geltrex Matrix包被的培养皿中,置于37℃、50%C02饱和度和饱和湿度标准条件的孵箱中,隔天换液。小鼠成釉细胞纯化利用上皮与间充质两种细胞对胰蛋白酶耐受力的不同,取原代培养4d细胞,吸出培养基,用无菌的D-Hanks溶液清洗细胞后,加入0.25%胰蛋白酶,在倒置显微镜下观察至长梭形成纤维样细胞边缘收缩,而上皮样细胞并无明显变化,此时加入培养基中止消化,并轻轻淋洗贴壁细胞,然后加入全培继续培养。一周后重复差别消化,连续培养。细胞免疫荧光将细胞消化后并种植于细胞爬片上,培养1d后,用无菌的D-Hanks溶液清洗,4%多聚甲醛溶液室温下固定10 min, PBS溶液清洗3次,每次5 mmin,0.1% TritonX-100孵育5 min后PBS清洗,5%的BSA室温封闭1h,一抗(K14和AMELX)孵育4℃过夜,PBS洗3次,每次5一mmin,红色荧光二抗室温孵育1h, Hochest复染细胞核,最后用荧光防淬灭剂封片,荧光显微镜下观察。RT-PCR提取细胞总RNA,将RNA逆转录为cDNA后,用PCR扩增仪进行扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳跑胶,放入激光成像系统中观察。Western blot常规提取细胞的蛋白,采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白的浓度,并将各样品蛋白浓度调至相同。分别配好分离胶与浓缩胶、上样、倒入电泳缓冲液进行电泳跑胶、转膜、封闭、依次孵育一二抗、最后显影液曝光,观察记录结果。统计学分析所有数值采用Mean±SD记录,应用SPSS13.0统计软件对资料进行统计分析,计量资料采用One Way ANOVA比较多组差异性,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.Cdc42在小鼠牙胚发育过程中的表达情况免疫荧光方法检测到Cdc42在小鼠牙胚蕾状期、帽状期、钟状期及钟状晚期都有表达,在釉质发育过程中在成釉器中有不同程度的表达。2.小鼠成釉细胞的离体培养及纯化原代培养的小鼠成釉细胞生长良好,其中混有大量成纤维样细胞,经改良纯化后明显好转,细胞呈铺路石样成片生长,细胞纯度较高。3.Cdc42在小鼠成釉细胞中的表达情况RT-PCR显示Cdc42 mRNA在小鼠成釉细胞中表达,Western blot显示Cdc42在小鼠成釉细胞中检测到表达,细胞免疫荧光显示Cdc42在小鼠成釉细胞中表达并定位于胞膜与胞质。4.抑制Cdc42对小鼠成釉细胞釉基质蛋白表达的影响运用Cdc42抑制剂ML141培养小鼠成釉细胞,达到抑制Cdc42的效果。通过Western blot检测到小鼠成釉细胞釉基质蛋白有不同程度的变化。结论1.Cdc42在各阶段小鼠牙胚尤其成釉器中有不同程度表达变化,表明Cdc42可能参与釉质发育过程。2.采用基底膜抽提物作为基质,酶消化法培养后经差速消化法纯化得到小鼠成釉细胞,有利于相关基础研究的进行。3.小鼠成釉细胞中表达Cdc42,其主要表达于小鼠成釉细胞胞膜与胞质,提示Cdc42与成釉细胞有密切联系。4.当Cdc42受到抑制,小鼠成釉细胞中AMELX、AMBN、MMP20以及KLK4都出现了不同程度的变化,提示Cdc42可能影响小鼠成釉细胞釉基质蛋白的表达情况。
胡雪峰[9]2012年在《BMP及FGF信号在哺乳动物牙齿发育中的作用机制》文中研究说明信号分子参与了哺乳动物器官发育过程的调控,主要包括四大信号家族成员：骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、刺猬蛋白(Hedgehog, Hh)和Wnt。牙齿发生是研究哺乳动物器官发育机制的重要模式器官之一。本研究对BMP和FGF信号在牙齿发育过程中的作用和相关机制进行了深入的研究。利用RNA原位杂交技术检测了BMP和FGF信号分子及其受体在人类牙胚早期发育中的表达模式。结果发现,在人的牙胚发育过程中,BMP2、BMP3、BMP4、 BMP7、NOGGIN、SMAD4、BMPRIa、BMPRIb、BMPRII等在帽状期和钟状期的牙上皮和牙间充质中均呈现强烈的表达;GF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、 FGF10以及FGFR1在人的帽状期和钟状期牙胚的牙上皮和牙间充质也均呈强烈的表达。结果表明,BMP和FGF信号分子在人帽状期和钟状期的表达模式与其在小鼠中牙胚发育相同时期的表达模式有较明显的差异,BMP和FGF信号在人早期牙胚的发育中起着重要的作用。人类牙齿和小鼠的牙齿在组织结构和发育虽然有许多相似之处,但也存在许多不同和特异之处。这种差异显然是由遗传因素所决定的分子调控机制上的差异而造成的。本研究对理解人类牙齿发育的分子调控机制提供了新的重要的实验数据。为探究信号分子活性水平的稳态对器官发育的作用,本研究以Noggin基因剔除小鼠作为动物模型,探讨了BMP信号稳态对牙齿形态发生的影响及BMP信号稳态的调制机制。结果发现,Noggin是维持上门牙正常发育的关键因子,Noggin的缺失将造成上门牙的发育异常。Noggin基因剔除小鼠的下门牙和磨牙发育正常是由于Chordin、Gremlin等BMP的其他拮抗物具有功能丰余的作用,能补偿Noggin的功能,保持BMP信号的内稳态,调控牙齿的正常发育。结果证实,BMP信号的稳态对牙齿器官的发育是至关重要的,BMP信号的稳态的破坏将导致牙齿发育异常。人类牙齿的发育分化周期长达400天,而小鼠的只有20天,这是人和小鼠牙齿发育的主要差异之一。FGF信号分子具有刺激细胞分裂,抑制细胞分化的作用。分析FGF信号在人牙胚中的表达模式发现,FGF8等信号分子在人牙胚中持续表达,与小鼠的表达模式有明显差异。本研究利用牙胚组织的慢病毒感染过表达方法,在小鼠E13.5的牙胚间充质细胞中过表达F_gf8。发现,与对照组相比,过表达F_gf8的牙胚发育明显滞后,发育速率降低。在证实了人牙间充质具有诱导牙齿发育潜能的基础上,再用表达FGF8钟状早期的人牙胚间充质与小鼠E13.5的牙上皮重组,植入裸鼠的肾囊膜中发育,发现小鼠牙上皮的分化延缓。钟状期的人牙上皮与小鼠牙胚间充质重组后移植,发现没有表达FGF8的小鼠牙间充质大大地加速了人牙上皮的发育进程。实验结果证实FGF8可能是调控人类牙齿器官发育周期关键因子之一综上所述,本研究检测了BMP信号和FGF信号通路关键因子在人帽状期和钟状期牙胚的表达模式,为理解人类牙齿发育的分子调控机制提供了重要的实验数据；利用Noggin基因剔除小鼠的模型证实了信号分子的稳态对牙齿发育的重要作用；证实人钟状期牙胚间充质具有诱导牙齿发育潜能；证实了FGF8是调节人类牙齿器官发育周期的关键因子。研究结果有利于进一步理解哺乳动物(包括人类)牙齿发育的分子机制,为人类牙齿再生的研究提供理论基础,同时为理解人类其他器官的发育的分子机制有普遍的提示意义。
张蓉[10]2001年在《牙本质涎磷蛋白在牙齿发育、矿化及牙髓损伤修复中作用的研究》文中认为牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）是一牙牙本质非胶原蛋白，主要由成牙本质细胞表达，是目前较为公认的牙齿特异性蛋白。近年来，DSPP的基因结构及mRNA水平的表达模式己较清楚。蛋白印迹实验证实小鼠牙胚中有DSPP蛋白的存在。但是，DSPP在蛋白水平的表达模式如何？它的生物学功能和作用机制是什么？它在牙髓损伤修复中的作用又如何？目前国内外均未见报道。这些问题的研究，对我们在该蛋白后基因水平的了解具有重要意义，也为我们深入了解牙本质生物矿化机制、对牙体组织疾病和损伤进行生物性防治提供理论依据。本研究针对上述问题，从以下几方面进行了实验研究：一.DSPP在小鼠牙胚及软骨发育中的表达 采用免疫组化和原位杂交方法分别从蛋白和基因水平对DSPP在小鼠牙胚发育各阶段（蕾状期除外）的表达进行检测。结果显示：DSPP在蛋白和基因水平的表达基本一致。它在成牙本质细胞的表达始于钟状中期（胎龄19d），并贯穿以后的各个时期；而在前成釉细胞和成釉细胞中具有一过性表达。提示DSPP在小鼠牙胚发育过程中的表达具有时空特异性。此外，在实验中我们意外发现，除牙齿外，DSPP还可在小鼠鼻软骨中表达。为进一步证实这一结果，本实验采用RT-PCR方法，首次从小鼠鼻软骨中克隆到719bp的DSPP cDNA序列，并且在进一步的研究 第四军医大学博士学位论文中发现DSPP在软骨的表达于生后16d时为阳性，而生后sd时为阴性。结果提示：DSPP并非为牙齿的特异性蛋白！除牙齿外，它还可在小鼠鼻软骨中表达，且表达具有时间特异性。二．DSPP反义核酸对体外培养牙胚发育和矿化影响的研究 采用反义核酸技术，用特异的与 DSPP mR＼A互补的反义寡脱氧核昔酸（ODN）抑制体外培养小鼠牙胚中DSPP的翻译，继而观察该抑制反应对牙胚生长及矿化的影响。实验共分为叁组：反义ODN组；正义ODN组及空白对照组。培养牙胚均取自胎龄为17d Balb／C子鼠上颌第一磨牙。对照牙胚置于无血清BGjb半固体培养基中培养；其余牙胚分别置于含有30 11M，长 15hP的 DSPP反义或正义 ODN的半固体培养基中培养。牙胚体外分别培养16d和 10d后，进行HE，von Kossa染色或透射电镜检测。结果显示：同空白对照组牙胚相比，反义ODN组牙胚明显缩小，且vonKossa染色结果为阴性（对照为阳性）；而正义ODN组牙胚形态、大小及vo。Kossa染色结果与空白对照相似。进一步的透射电镜显示：反义 ODN组牙尖处成牙本质细胞中粗面内质网扩张较对照更为明显，而牙本质基质厚度却小于对照，且胞外基质中胶原纤维粗细不等，排列紊乱。本研究首次用直接的实验证据说明DSPP反义ODN不仅可抑制牙胚的矿化，还可减缓体外培养牙胚的发育。该影响可能是通过对成牙本质细胞分泌功能的影响及对胶原纤维粗细和排列方向的控制所造成的。研究证实：DSPP在牙本质矿化中起着重要作用。同时，实验结果还提示：DSPP在维持牙齿正常的生长发育中也起着重要的作用。叁．DSPP在大鼠牙髓损伤修复中的表达 采用单纯开放法构建大鼠实验性牙髓损伤修复模型，并在此基础上采用兔疫组化和原位杂交方法，对DSPP在牙髓早期损伤修复中的表达进行研究。结果显示：DSPP在牙髓损伤后的表达与损伤后时间具有显着相关性。它在成牙本质细胞中的表达于损伤后 6－12h下调、l－3 d时 第四军医大学博士学位论文显着上调而于7d时趋于正常。结果提示：DSPP可能在早期牙髓损伤修复中起重要作用。 本研究通过多种研究技术和手段，从基因和蛋白水平；大体和超微结构方面对DSPP在牙齿发育、矿化及牙髓损伤修复中的作用进行了较为系统的研究。结果证实了DSPP在牙本质矿化中起着重要作用。同时发现：DSPP在维持牙齿正常发育中也起着重要作用。并且除牙齿外，它在软骨中也有表达。为进一步全面了解该蛋白和深入探讨牙本质生物矿化的分于机制提供了实验依据。
参考文献：
[1]. 釉原蛋白、釉蛋白及成釉蛋白在小鼠牙胚组织发育过程中的表达[C]. 王丽珍, 李蕾. FDI世界口腔医学大会论文摘要汇编. 2006
[2]. 成釉蛋白在小鼠牙胚发育不同时期的免疫组化定位[J]. 郭鹏, 吴补领, 田宇, 逄键梁, 张敬雷. 牙体牙髓牙周病学杂志. 2003
[3]. 成釉蛋白在小鼠牙胚发育中的表达和作用研究[D]. 郭鹏. 中国人民解放军第四军医大学. 2003
[4]. Vps4b在基因敲除小鼠牙胚发育中的时空表达及作用研究[D]. 李晓聪. 郑州大学. 2018
[5]. ClC-3对牙和颌骨发育的影响[D]. 张宇涛. 第四军医大学. 2016
[6]. 釉原蛋白、釉蛋白及成釉蛋白在小鼠牙胚组织发育过程中的表达[J]. 王丽珍, 李蕾. 口腔颌面外科杂志. 2006
[7]. 小鼠磨牙牙胚发育过程中Caveolin-1、CD147和MMP-2的时空表达研究[D]. 王丁. 郑州大学. 2014
[8]. Cdc42对小鼠釉质发育影响的初步研究[D]. 吕晓琳. 南方医科大学. 2016
[9]. BMP及FGF信号在哺乳动物牙齿发育中的作用机制[D]. 胡雪峰. 福建师范大学. 2012
[10]. 牙本质涎磷蛋白在牙齿发育、矿化及牙髓损伤修复中作用的研究[D]. 张蓉. 第四军医大学. 2001