导读:本文包含了猪瘟病毒石门株论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:猪瘟,病毒,石门,感染性,蛋白,核糖体,杆状。
猪瘟病毒石门株论文文献综述
孙永科,胡超英,林明星,陆欣然,杨玉艾[1]（2016）在《猪瘟病毒石门株在ST细胞连续传代后E0基因变异分析》一文中研究指出为了解猪瘟病毒(CSFV)石门(Shimen)株连续传代后变异情况,根据已发表的CSFV E0基因序列(AF092448.2),设计合成引物,以在ST细胞中连续传代培养的CSFV石门株细胞毒总RNA为模板,每5代通过RT-PCR方法扩增病毒的E0基因,测定其核苷酸序列和氨基酸序列,用DNA Star软件分析比较原代、5代、10代、15代、20代、25代接毒细胞中CSFV E0基因的变异性。结果显示,接种病毒第10代的病毒E0基因在630核苷酸位点出现变异,第15代病毒在632核苷酸位点出现变异。本研究通过分子生物学方法发现CSFV Shimen株在ST细胞连续传代过程中E0基因能保持遗传的稳定性。(本文来源于《动物医学进展》期刊2016年06期）
童超[2]（2015）在《猪瘟病毒石门株和疫苗C株嵌合病毒构建及其特性鉴定》一文中研究指出猪瘟是猪的重要传染病,具有致死性及高度传染性等特点,其病原为猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV),为黄病毒科瘟病毒属成员,是有囊膜的单股正链RNA病毒。CSFV基因组长约12.3kb,基因组两端为非编码区,编码区为一个11697bp的开放性阅读框,编码长度为3898个氨基酸的多聚前体蛋白,在宿主细胞蛋白酶的作用下逐步裂解为8种非结构蛋白和4种结构蛋白,基因组内的顺序依次为Npro、Core、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、 NS5A和NS5B,其中Core、Erns、E1和E2为结构蛋白。对CSFV主要蛋白的功能研究已较为深入,在病毒复制及其与宿主细胞互作研究方面也取得了进展,这些研究成果得益于感染性克隆技术发展。以疫苗C株作为骨架进行新型猪瘟标记疫苗的开发是一大研究热点,但相对于强毒株,C株病毒本身在体外培养细胞中的生长较慢。我们发现以C株感染性克隆为基础拯救的重组病毒滴度较低,可能与其细胞适应性差有关。本研究拟在C株和强毒株石门株感染性克隆的基础上,通过对两个毒株不同蛋白区段进行相互置换,构建一系列重组嵌合病毒,以研究结构蛋白及非结构蛋白对猪瘟病毒细胞适应性的影响,解析影响猪瘟病毒在ST细胞和PK-15细胞中复制的重要蛋白,为从基因水平上对疫苗C株进行改造提供依据,也为进一步探索猪瘟病毒体外复制和组装机制奠定基础。1.重组c株商低代次毒株与石门株体外增殖能力差异比较在相同感染比条件下,无论是高代次还是低代次重组C株病毒(RecCpp40和RecCpp80)在细胞内的增殖能力均弱于石门株,但叁株病毒感染过程中基因组复制水平差异不明显(P>0.05)。感染后96h RecCpp80的子代病毒数量是RecCpp40的30倍以上(P<0.01)；感染后96h细胞外病毒粒子数比较结果显示,胞内病毒增殖能力与释放到胞外的病毒量成正比,石门株胞内增殖能力强,释放到胞外的病毒粒子数也显着高于重组C株病毒(P<0.05);石门毒株C株细胞间的扩散能力显着优于RecCpp80,特别是在覆盖琼脂糖的情况下,石门毒株的扩散能力受琼脂培养基的影响较小,在两种培养条件下均能形成大而弥散的病毒斑。因此,我们推测C株与石门株之间的细胞适应性差异主要与病毒在细胞内的增殖能力及其细胞间扩散能力相关。2.猪瘟病毒C株与石门株嵌合病毒构建及其细胞内增殖能力和兔体反应比较为了解析不同毒株体外增殖能力差异的分子基础,我们构建了石门株的感染性克隆,并以疫苗C株和石门株感染性克隆为基础构建了猪瘟病毒结构蛋白和非结构蛋白编码基因互换的感染性克隆,并成功拯救了石门株重组病毒和11个重组嵌合猪瘟病毒。体外生长特性比较结果显示,疫苗C株和石门株半长基因组的相互置换可提高C株病毒的体外增殖能力,其中置换有石门株非结构蛋白至非编码区半长的嵌合毒株与C株重组病毒RecCpp80相似。置换石门毒株NS2-NS4B的重组嵌合C株病毒体外增殖能力显着提高,而置换有C株NS2-NS4B区段嵌合石门毒株的体外增殖能力低于亲本石门重组病毒,说明非结构蛋白NS2-NS4B区段对猪瘟病毒的体外增殖具有重要作用。置换石门毒株NS4A-3 -UTR片段或NS5A-3 -UTR,不增强C株嵌合病毒的体外增殖能力。为了评价基因置换对疫苗C株兔体适应性的影响,将嵌合毒株进行了兔体接种实验。结果显示,分别含有C株前半长(结构蛋白)或后半长(非结构蛋白)基因的嵌合毒株均能够引起兔定型热反应,含有石门毒株NS2-NS4B基因区段的嵌合C株病毒亦能引起兔体温升高反应,但置换C株NS4A-3-UTR和NS2-NS4B区段的嵌合石门毒株则不诱导兔体发热反应。以上结果说明C株的两端非编码区以及结构蛋白区域与兔体适应性密切相关。3.猪瘟病毒NS2跨膜区在病毒增殖中的作用为了初步解析NS2蛋白在猪瘟病毒增殖中的作用,对NS2的N端6个跨膜结构(Transmembrane, TM)序列分别进行了PCR扩增后,构建了12个含有NS2不同区段融合表达GFP的真核表达重组质粒,转染ST细胞后比较了不同跨膜区融合蛋白的亚细胞定位。结果表明,NS2蛋白N端不同区段的跨膜结构均能在定位于内质网中,在细胞内呈现网状分布。以石门株感染性克隆为模板,对NS2的N端6段潜在跨膜结构进行单段缺失,或通过在跨膜区核心序列中央插入丙氨酸改变跨膜区构象,成功构建12个NS2不同突变的感染性克隆,体外转录RNA电转ST细胞以拯救重组病毒。结果显示,缺失任何一段NS2跨膜结构均导致病毒复制缺陷,不能产生子代病毒。在TMl正中插入丙氨酸后不影响子代病毒复制和组装,在TM3和TM6中相应的插入则导致病毒产生时间延后,在3-4代连续传代才能获得重组病毒；而在TM2,4,5中分别插入突变后,病毒RNA在细胞内呈低水平复制,且不产生重组病毒。上述结果说明NS2的跨膜区在猪瘟病毒复制和组装过程中具有重要作用,但作用的具体机制需要进一步研究。综上所述,我们以猪瘟病毒C株与石门株之间在体外培养细胞适应性差异为切入点,通过结构蛋白和非结构蛋白基因置换以及NS2蛋白跨膜区的缺失或丙氨酸插入,探明了非结构蛋白NS2-NS4B区以及NS2跨膜区对猪瘟病毒的增殖具有重要作用,疫苗C株基因组两端的非编码区以及结构蛋白区域介导兔体发热反应。研究结果为深入探索猪瘟病毒的增殖机制和猪瘟疫苗C株的改良奠定了良好基础。(本文来源于《浙江大学》期刊2015-04-24）
曹志,张彦明,郭抗抗,郑敏萍,宁蓬勃[3]（2014）在《猪瘟病毒石门株调控猪巨噬细胞Toll样受体介导的天然免疫应答》一文中研究指出引言Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)通过介导天然免疫应答,产生免疫效应分子,对侵入机体的病毒进行清除,而病毒为了能够生存也会通过多种方式影响TLRs介导的免疫应答。猪瘟病毒(CSFV)感染过程中免疫应答机制的研究已获得了一些重要结果,但CSFV影响TLRs介导的天然免疫应答机制还不完全清楚。本课题组分析了CSFV石门株对猪巨噬细胞TLRs基因及TLRs信号转导通路中关键位(本文来源于《中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集》期刊2014-11-08）
宁蓬勃[4]（2013）在《猪瘟病毒石门株与C株感染宿主细胞差异表达基因及其在病毒致病中的作用》一文中研究指出猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的猪的一种高度接触性传染病。在过去的几十年中，我国通过采取兔化弱毒疫苗免疫接种与扑杀相结合等措施，有效地控制了猪瘟的流行，但近年来我国猪瘟疫情又有所抬头，尤其是慢性猪瘟和非典型猪瘟成为该病的主要发生形式，给猪瘟防控工作造成了新的困难。虽然近年来对CSFV致病机理的研究取得一定进展，但之前的研究工作中，主要是对全病毒或病毒的某个或某些基因对宿主细胞的一些致病作用及其机理进行研究，而缺乏对CSFV感染后宿主细胞转录水平调控应答的系统分析，不清楚哪些应答才是CSFV强毒株引起宿主细胞发生的致病性及病理性改变的关键所在。为此，本论文开展猪瘟病毒石门株与猪瘟病毒C株感染猪静脉血管内皮细胞（SUVEC）及巨噬细胞后宿主细胞基因表达的差异性研究，并通过对猪瘟病毒感染后宿主细胞mRNA转录组水平的基因调控应答特征分析，为阐明猪瘟病毒的致病机理提供有价值的科学依据。研究工作取得了以下结果：（1）建立了区分猪瘟病毒石门株与猪瘟病毒C株的高分辨率熔解曲线（HRM）检测方法。与以往PCR技术比较，该方法具有单管操作、无须设计特异性探针等优势，既可以实现对猪瘟病毒石门株与猪瘟病毒C株的单独定量检测，也可以实现对猪瘟病毒石门株与C株的鉴别检测，为致病机理研究中获得单纯病毒感染或无病毒感染的细胞样本提供了检测手段，也为猪瘟流行病学调查的大量临床样本筛查提供了可选择的检测方法。（2）应用高通量测序技术，对猪瘟病毒石门株感染24h与未感染病毒的SUVEC基因在转录水平的表达差异开展了比较研究，数据分析结果说明，猪瘟病毒石门株可能利用改变宿主细胞复制周期、抗凋亡、抗炎症等多种策略实现自身的复制增殖；并致使宿主细胞未能对之形成有效清除，最终造成猪体产生多组织器官的病变。进一步的分析显示，PDIA3、AXL基因在猪瘟病毒石门株感染早期发生上调，而NAMPT、PDGF基因在猪瘟病毒石门株感染早期发生下调，提示这些基因对于猪瘟病毒石门株的感染具有重要意义。（3）对猪瘟病毒石门株、C株感染SUVEC和未感染病毒对照组进行DGE检测数据库两两比较，采用GO和KEGG富集显着性分析体系，分析了猪瘟病毒石门株与C株感染SUVEC后72h转录组的应答差别，在mRNA水平提出了猪瘟病毒石门株感染猪血管内皮细胞的可能机制，即病毒通过对RNA剪接机制、蛋白合成与降解机制的调控，影响细胞正常的功能，特别是对细胞骨架结构、细胞黏附、细胞周期产生影响，从而实现病毒感染复制。GO基因功能分析和聚类分析结果显示，猪瘟病毒石门株感染SUVEC后72h，SRPX2、SOD2、HMGB1、TYMS基因转录受到抑制，而VEGFC和CAV1基因的表达发生上调。初步揭示了猪瘟病毒石门株引发急性猪瘟的分子机制。（4）DGE分析显示，VEGFC基因是猪瘟病毒石门株感染后SUVEC特异上调表达的基因，进一步验证猪瘟病毒石门株的感染确能引起VEGF-C在mRNA转录及蛋白合成水平的增高。初步揭示了猪瘟病毒石门株引起血管通透性增加而导致广泛性出血的发病机制。（5）采用DGE技术对猪瘟病毒石门株、猪瘟病毒C株感染巨噬细胞和未感染病毒对照组进行GO和KEGG分析，结果显示p53信号通路在猪瘟病毒石门株感染巨噬细胞的过程中具有重要作用。试验表明，猪瘟病毒石门株感染巨噬细胞后，促进了phospho-p53(Ser15)蛋白的磷酸化进程，p21蛋白表达升高，14-3-3蛋白表达降低。研究结果提示，猪瘟病毒石门株的感染激活巨噬细胞p53蛋白，上调p21蛋白并抑制14-3-3蛋白进行双向调控，最终导致细胞周期阻滞，为实现病毒自身复制、造成持续性感染创造了可能。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2013-10-01）
闫红岩[5]（2013）在《构建基因组分节段的猪瘟病毒石门株》一文中研究指出猪瘟是由猪瘟病毒感染引起的出血性疾病，主要特征包括病毒侵染血管的凝固，血小板的减少，免疫抑制,是严重危害畜牧业生产的烈性传染病之一,被国际动物卫生组织(OIE)列入A类法定传染病，目前对猪瘟的研究大多集中于新型疫苗的研发和诊断方法的探索，但对于CSFV致病机理的分子机制仍不清楚。猪瘟是一种高传染性和致死性疾病，猪瘟的病原物猪瘟病毒属于黄病毒科瘟病毒属，它是单股正链RNA病毒，全长约12.3kb，包括5′、3′非编码区和一个开放阅读框，CSFV基因组首先翻译成1个多聚蛋白前体．前体聚蛋白在宿主和病毒的蛋白酶共同作用下被切割成为12个具有独立功能的蛋白，其中就包括8种非结构蛋白，4种结构蛋白。我国主要有两株重要的猪瘟病毒标准株，一株是强毒的石门株，分离于1945年，拥有良好的免疫原性。另一株是兔化弱毒株，国外称为C株，猪瘟兔化弱毒（Hog cholera lapinized virus,HCLV）免疫原性强，遗传性稳定，无残余毒力，被公认是最安全有效的猪瘟弱毒疫苗，因此，C株可以作为研究二价或多价疫苗的有效载体。尽管C株的安全性和免疫效力非常好，但是由于缺乏可利用的鉴别诊断方法，从而使得C株与野毒的抗体难以区分，这非常不利于猪瘟的彻底根除。欧盟至今奉行不接种政策。逆转录遗传学的发展使人类对于正链RNA病毒的研究取得了重大突破。RNA体外转录是反向遗传技术的基础，但传统方法获得的正链RNA病毒全长CDNA克隆需要在体外转录成RNA才能进行转染实验，转录过程中易造成RNA降解，加之RNA的不均一等许多因素都会影响后续试验结果。且体外转录RNA与病毒自身RNA相比感染性较低。本研究以猪瘟病毒石门株为实验材料,在原猪瘟病毒石门株全长CDNA克隆的基础上在病毒全长基因组3′端引入了丁肝核酶核心序列（HDV）及T7终止子序列，获得重组质粒pMC18-CSFV-SM-HDV-T7，使在全长克隆的基础上后续的研究不仅局限在体内转录方面，还可用在体外转录，使其在病毒基因组水平及病毒致病性研究上的应用更加灵活。在本研究中,我们首次尝试对正链RNA病毒进行分节段改造，这样改造后的病毒基因组由单股变成了双股，从而在基因组水平上将野生病毒株与实验株进行有效区分，并且检测起来也比较方便。在此基础上对C株进行改造，获得一个基因组分节段的病毒疫苗，就可以在分子水平将自然感染猪群与C株免疫猪群有效区分，从而利于猪瘟的彻底根除。同时，该研究也将为确定猪瘟病毒包装信号序列奠定基础。(本文来源于《山东师范大学》期刊2013-05-26）
朱元源,韩焘,邹兴启,范学政,徐璐[6]（2013）在《猪瘟病毒石门重组标记毒株的构建与拯救》一文中研究指出【目的】中国控制猪瘟主要采用疫苗免疫,现有的猪瘟兔化弱毒疫苗有较好的免疫保护效果,但是不能从血清学上区分疫苗免疫猪与自然感染猪,猪瘟标记疫苗的研制与配套检测技术的开发可有效解决这一问题。【方法】利用猪瘟病毒低温诱变弱毒T株感染性克隆,将其全长结构蛋白基因替换为猪瘟病毒石门毒株全长结构蛋白基因,得到猪瘟石门重组病毒的全长感染性克隆pSMT;随后在pSMT E1蛋白的C端插入Flag抗原基因作为鉴别标记,构建猪瘟石门重组标记病毒的感染性克隆pSMT-Flag。经电转染法拯救出两株重组病毒vSMT和vSMT-Flag,通过SK6细胞进行病毒传代以获得重组病毒。【结果】多组酶切鉴定表明两株重组质粒成功构建,PCR扩增及测序、免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)表明重组病毒已成功拯救且能成功传代。【结论】该标记病毒能够与Flag单抗发生特异性反应,且不影响E2蛋白中和表位与猪瘟单抗的结合,因此该毒株为研制CSFV新型标记疫苗提供了思路。(本文来源于《中国农业科学》期刊2013年01期）
谢文绮,李得江,陈宁,廖迅,童超[7]（2012）在《猪瘟病毒石门株E2蛋白的单抗制备及抗原表位鉴定》一文中研究指出用猪瘟病毒石门株E2(SM-E2)的BC区原核表达蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单抗,测定其效价并鉴定抗原表位。结果表明,制备了1株持续、稳定分泌抗SM-E2的单克隆抗体2B10,效价在1∶600～1∶1 000之间。单抗2B10能与常规SDS-PAGE转膜的SM-E2蛋白发生反应,表明其识别的是线性表位,并且该单抗只能识别石门毒株,而不能与C株疫苗及2型流行毒株发生反应。点突变E2蛋白ELISA分析结果表明,该单抗不与707、709、711、713和714位突变蛋白发生反应,表明单抗2B10识别的线性表位为707I-X-P-X-G-X-G-G714。该单抗对猪瘟病毒抗原多样性分析和致病机制研究有一定的应用价值。(本文来源于《中国兽医科学》期刊2012年07期）
孙永科,孔令富,张晓敏,郑欢莉,林明星[8]（2012）在《非典型性猪瘟病毒云南株/石门株嵌合病毒的构建和拯救》一文中研究指出为研究猪瘟病毒(CSFV)云南株(YN株)突变位点在致非典型性猪瘟中的作用,本研究在CSFV石门株全长感染性克隆的基础上,利用分子克隆技术,将CSFV YN株的1 510位～1 532位、2 471位～2 658位、3 152位～3 176位和11 785位～11 816位突变位点基因序列替换CSFV石门株的相应基因序列,构建出嵌合的CSFV感染性克隆质粒pAC-SM-YN。全基因测序鉴定后,体外转录得到病毒RNA,经脂质体转染PK-15细胞方法拯救出了嵌合病毒vSM-YN。经直接荧光染色、对突变位点RT-PCR以及ELISA检测表明拯救嵌合病毒vSM-YN传代稳定。本研究为研究CSFV结构蛋白、病毒致病机理、新型疫苗,尤其是非典型猪瘟的致病机理奠定了基础。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2012年03期）
周向阳,万婧,廖迅,朱竹君,陈晓玮[9]（2012）在《猪瘟病毒石门株E2蛋白在杆状病毒系统中的表达》一文中研究指出以杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达猪瘟病毒(CSFV)石门株的E2蛋白,将CSFV石门株的E2囊膜糖蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得重组转移质粒pFastBacHTA-E2。转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒。传毒3代后对表达蛋白进行Western blot和间接免疫荧光试验检测。结果显示,E2蛋白获得高效表达,能被抗E2蛋白的单克隆抗体2B10和6×His-单克隆抗体特异性识别,表明CSFV石门株E2囊膜糖蛋白在Sf9昆虫细胞中得到成功表达,具有良好的抗原反应性。(本文来源于《动物医学进展》期刊2012年01期）
姜庆[10]（2011）在《比较猪瘟病毒兔化毒株和石门株5端非编码区对病毒翻译的影响》一文中研究指出猪瘟是猪的重要传染病之一,给养猪业造成严重的经济损失,被世界卫生组织列为A类动物烈性传染病之一,加强对猪瘟病毒研究显得尤为重要。控制猪瘟最有效的方法是注射疫苗,目前最常用的疫苗为减毒疫苗。中国C株在我国控制猪瘟传播上发挥重要作用,并被国外广泛应用,是公认的安全有效的疫苗。猪瘟病毒全基因组包括5端和3端非编码区,中间是一个大的阅读框,编码12种蛋白。5端非编码区包含一个内部核糖体进入位点(IRES),通过与宿主核糖体的配对,起始病毒的翻译。猪瘟病毒中国C株在猪细胞中的复制效率很低,其原因可能很复杂,具体机制尚不清楚,我们推测病毒滴度的高低与其翻译水平有一定的联系,而猪瘟病毒决定翻译的主要是5端非编码区上的IRES,因此我们比较石门株和C株对病毒翻译的影响。本实验室保存的质粒pEGFP-N3-FR,包含巨细胞病毒CMV强启动子控制下的Rluc报告基因及CSFV S株的IRES控制下的Fluc报告基因,以弱毒C株IRES取代强毒Shimen株的IRES,获得重组质粒pEGFP-N3-FR-C-5’-UTR。通过比较二者调控下的荧光素酶报告基因的表达情况,了解IRES对C株病毒翻译的影响。研究发现实验组pEGFP-N3-FR及pEGFP-N3-FR-C-5’-UTR的萤火虫荧光素酶活性差异不显着,表明兔化毒株的低翻译效率可能不是IRES差异造成的。猪瘟病毒反向遗传系统目前主要的方法还是体外转录,即转录由启动子起始,转录过程由终止子终止,产物mRNA转染到细胞中翻译蛋白。但由于产生的RNA易降解,不利于转染的进行。本研究设计细胞内转录系统,将T7 RNA聚合酶表达质粒转染PK-15细胞,避免了体外转录的操作。T7 RNA聚合酶能严格、特异地识别T7启动子,高效转录mRNA。本研究是以E coli. BL21基因组为模板,通过PCR获得T7 RNA聚合酶基因,经测序确定无移码突变后,最终克隆到真核表达载体pEGFP-N3启动子CMV的下游,获得含T7 RNA聚合酶的真核表达载体。并与含T7启动子控制下的的重组质粒同时转染到猪肾细胞PK-15中,通过检测GFP基因的表达情况,确定T7 RNA聚合酶的偶联表达。结果发现表达绿色荧光蛋白的细胞数目较低,可见视野内仅有几个细胞表达,已经证明T7 RNA聚合酶的偶联表达,建立T7 RNA聚合酶表达系统,为下一步CSFV体内转录打下基础。质粒的稳定性包括分离的稳定性和结构的稳定性。重组质粒在传代的过程中由于受外界条件的影响,易发生基因序列的突变,甚至是质粒的丢失。提高质粒的稳定性在遗传工程研究和生产中显得很重要。本研究将质粒pMC18-CSFV-C株全基因进行测序,与我们实验室以前测得的序列AY382481比对后,发现质粒上C株cDNA有若干个位点发生突变。说明质粒在保存及扩增的过程中发生了一定程度的突变。为了控制猪瘟的传播,了解全国乃至世界猪瘟的进化情况,掌握猪瘟流行的种群动态,对预防猪瘟有着不可替代的作用。另外,疫苗接种对预防猪瘟传播起了重要作用,但疫苗接种对猪瘟病毒群体进化的影响尚没有相关报道。本研究收集中国可利用的猪瘟病毒基因组序列,经过分析发现同源重组对猪瘟病毒遗传多样性发挥作用。猪瘟病毒种群动态分析显示疫苗组与非疫苗组种群进化速率及种群不同,说明接种对猪瘟病毒种群进化有影响。(本文来源于《山东师范大学》期刊2011-05-26）
猪瘟病毒石门株论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
猪瘟是猪的重要传染病,具有致死性及高度传染性等特点,其病原为猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV),为黄病毒科瘟病毒属成员,是有囊膜的单股正链RNA病毒。CSFV基因组长约12.3kb,基因组两端为非编码区,编码区为一个11697bp的开放性阅读框,编码长度为3898个氨基酸的多聚前体蛋白,在宿主细胞蛋白酶的作用下逐步裂解为8种非结构蛋白和4种结构蛋白,基因组内的顺序依次为Npro、Core、Erns、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、 NS5A和NS5B,其中Core、Erns、E1和E2为结构蛋白。对CSFV主要蛋白的功能研究已较为深入,在病毒复制及其与宿主细胞互作研究方面也取得了进展,这些研究成果得益于感染性克隆技术发展。以疫苗C株作为骨架进行新型猪瘟标记疫苗的开发是一大研究热点,但相对于强毒株,C株病毒本身在体外培养细胞中的生长较慢。我们发现以C株感染性克隆为基础拯救的重组病毒滴度较低,可能与其细胞适应性差有关。本研究拟在C株和强毒株石门株感染性克隆的基础上,通过对两个毒株不同蛋白区段进行相互置换,构建一系列重组嵌合病毒,以研究结构蛋白及非结构蛋白对猪瘟病毒细胞适应性的影响,解析影响猪瘟病毒在ST细胞和PK-15细胞中复制的重要蛋白,为从基因水平上对疫苗C株进行改造提供依据,也为进一步探索猪瘟病毒体外复制和组装机制奠定基础。1.重组c株商低代次毒株与石门株体外增殖能力差异比较在相同感染比条件下,无论是高代次还是低代次重组C株病毒(RecCpp40和RecCpp80)在细胞内的增殖能力均弱于石门株,但叁株病毒感染过程中基因组复制水平差异不明显(P>0.05)。感染后96h RecCpp80的子代病毒数量是RecCpp40的30倍以上(P<0.01)；感染后96h细胞外病毒粒子数比较结果显示,胞内病毒增殖能力与释放到胞外的病毒量成正比,石门株胞内增殖能力强,释放到胞外的病毒粒子数也显着高于重组C株病毒(P<0.05);石门毒株C株细胞间的扩散能力显着优于RecCpp80,特别是在覆盖琼脂糖的情况下,石门毒株的扩散能力受琼脂培养基的影响较小,在两种培养条件下均能形成大而弥散的病毒斑。因此,我们推测C株与石门株之间的细胞适应性差异主要与病毒在细胞内的增殖能力及其细胞间扩散能力相关。2.猪瘟病毒C株与石门株嵌合病毒构建及其细胞内增殖能力和兔体反应比较为了解析不同毒株体外增殖能力差异的分子基础,我们构建了石门株的感染性克隆,并以疫苗C株和石门株感染性克隆为基础构建了猪瘟病毒结构蛋白和非结构蛋白编码基因互换的感染性克隆,并成功拯救了石门株重组病毒和11个重组嵌合猪瘟病毒。体外生长特性比较结果显示,疫苗C株和石门株半长基因组的相互置换可提高C株病毒的体外增殖能力,其中置换有石门株非结构蛋白至非编码区半长的嵌合毒株与C株重组病毒RecCpp80相似。置换石门毒株NS2-NS4B的重组嵌合C株病毒体外增殖能力显着提高,而置换有C株NS2-NS4B区段嵌合石门毒株的体外增殖能力低于亲本石门重组病毒,说明非结构蛋白NS2-NS4B区段对猪瘟病毒的体外增殖具有重要作用。置换石门毒株NS4A-3 -UTR片段或NS5A-3 -UTR,不增强C株嵌合病毒的体外增殖能力。为了评价基因置换对疫苗C株兔体适应性的影响,将嵌合毒株进行了兔体接种实验。结果显示,分别含有C株前半长(结构蛋白)或后半长(非结构蛋白)基因的嵌合毒株均能够引起兔定型热反应,含有石门毒株NS2-NS4B基因区段的嵌合C株病毒亦能引起兔体温升高反应,但置换C株NS4A-3-UTR和NS2-NS4B区段的嵌合石门毒株则不诱导兔体发热反应。以上结果说明C株的两端非编码区以及结构蛋白区域与兔体适应性密切相关。3.猪瘟病毒NS2跨膜区在病毒增殖中的作用为了初步解析NS2蛋白在猪瘟病毒增殖中的作用,对NS2的N端6个跨膜结构(Transmembrane, TM)序列分别进行了PCR扩增后,构建了12个含有NS2不同区段融合表达GFP的真核表达重组质粒,转染ST细胞后比较了不同跨膜区融合蛋白的亚细胞定位。结果表明,NS2蛋白N端不同区段的跨膜结构均能在定位于内质网中,在细胞内呈现网状分布。以石门株感染性克隆为模板,对NS2的N端6段潜在跨膜结构进行单段缺失,或通过在跨膜区核心序列中央插入丙氨酸改变跨膜区构象,成功构建12个NS2不同突变的感染性克隆,体外转录RNA电转ST细胞以拯救重组病毒。结果显示,缺失任何一段NS2跨膜结构均导致病毒复制缺陷,不能产生子代病毒。在TMl正中插入丙氨酸后不影响子代病毒复制和组装,在TM3和TM6中相应的插入则导致病毒产生时间延后,在3-4代连续传代才能获得重组病毒；而在TM2,4,5中分别插入突变后,病毒RNA在细胞内呈低水平复制,且不产生重组病毒。上述结果说明NS2的跨膜区在猪瘟病毒复制和组装过程中具有重要作用,但作用的具体机制需要进一步研究。综上所述,我们以猪瘟病毒C株与石门株之间在体外培养细胞适应性差异为切入点,通过结构蛋白和非结构蛋白基因置换以及NS2蛋白跨膜区的缺失或丙氨酸插入,探明了非结构蛋白NS2-NS4B区以及NS2跨膜区对猪瘟病毒的增殖具有重要作用,疫苗C株基因组两端的非编码区以及结构蛋白区域介导兔体发热反应。研究结果为深入探索猪瘟病毒的增殖机制和猪瘟疫苗C株的改良奠定了良好基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
猪瘟病毒石门株论文参考文献
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