组蛋白H3K27me3去甲基化酶UTX在合子基因组激活中的作用机制研究

论文摘要

受精后,胚胎发生了自母源基因组向合子基因组的转变,即合子基因组激活（Zygotic genome activation,ZGA）。在此期间发生了包括H3K27me3在内的表观遗传修饰重塑过程。UTX（Ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat gene on the X chromosome）作为H3K27me3特异性去甲基化酶,在调控植入后胚胎发育、细胞重编程和细胞分化方面起重要作用。UTX是否调控植入前胚胎发育,特别是ZGA过程,到目前为止还未见报道。为了探究UTX在植入前胚胎发育中的影响,我们设计了3部分试验:首先,构建了双功能的pcs2-UTX过表达载体,并对其功能进行了体内外验证;同时又制备了Utx转基因小鼠（Utx+小鼠）模型,繁育至F3代。其次,利用Utx+小鼠胚胎（体内模型）和注射Utx-mRNA的胚胎（体外模型）,探索过表达Utx基因对胚胎发育的影响。最后,通过Utx干扰试验和胚胎发育挽救试验,找到了UTX在小鼠合子基因组激活过程中的靶向基因Zscan4d。主要结果如下:（1）将pcs2-UTX表达载体转染到小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEF）,IF和WB技术检测底物蛋白H3K27me3表达的结果显示,H3K27me3修饰显著降低。利用pcs2-UTX载体经体外转录获得了Utx-mRNA,注射于受精卵胞质,IF检测结果显示,底物蛋白H3K27me3的荧光强度显著减弱。利用原核注射制备了Utx转基因小鼠（Utx+小鼠）,F0代阳性率为28.6%,经连续配种繁殖,繁育至F3代。（2）为了解UTX对小鼠生殖能力的影响,我们对Utx+小鼠进行了相关的鉴定。转基因小鼠的产仔率和排卵率均显著低于同窝野生型小鼠,并发现转基因小鼠的卵巢体积和质量均小于同龄同窝野生小鼠。同样,我们发现转基因小鼠胚胎发育率显著低于同窝野生型小鼠。利用qPCR技术对转基因小鼠的胚胎进行了12个ZGA相关基因（MuERVL、Zscan4d、Tcstv1、Tcstv3、Cdc2、eIF-1a、Rif1、Rpl23、U2afbp-rs、Ube2a、Mt1a、Wee1）和4个母源效应基因（Lin28a、Stella、Gdf9、Brg1）的检测。其中Zscan4d、Tcstv3和Gdf9的表达显著上调。我们又通过模拟体内试验（Utx+小鼠）,对直接注射Utx-mRNA的胚胎进行了研究,发现MuERVL、Zscan4d、Tcstv1、Tcstv3和Lin28a的表达显著上调。此外,IF结果也显示,ZSCAN4D蛋白的荧光强度显著增强。综合上述两项结果发现,UTX主要靶向于Zscan4d基因。（3）为了进一步验证Utx基因在胚胎发育中的作用,设计并合成特异干扰UTX的siRNA,通过qPCR、IF和WB检测发现干扰效率为90%,并且发现干扰后的胚胎发育率均显著降低。我们对干扰Utx后的胚胎检测了12个ZGA和4个母源效应基因的表达情况。结果显示,Zscan4d、Tcstv1和Stella的表达显著降低。IF结果表明,ZSCAN4D蛋白的表达显著降低。以上结果再次验证了UTX靶向于Zscan4d基因的结论。（4）综合转基因小鼠、直接注射mRNA以及siRNA的结果,我们发现UTX影响Zscan4d的表达。ChIP-qPCR也显示,UTX直接结合Zscan4d基因的启动子区域。已有研究表明,Zscan4d是着床前胚胎端粒延伸的关键基因之一。为了进一步验证上述结果,我们构建了Zscan4d的体外转录载体pcs2-ZSCAN4D,并进一步的设计了“挽救（rescue）”试验。同时向受精卵中注射Utx的siRNA和Zscan4d的mRNA,可以部分缓解由干扰UTX后导致的胚胎发育异常的现象。没有完全“挽救”的原因可能Zscan4d是UTX的靶基因之一,即UTX调控的基因不仅仅是Zscan4d。本研究通过UTX转基因小鼠模型、mRNA过表达以及siRNA干扰等试验,主要揭示了组蛋白H3K27me3去甲基化酶UTX在植入前胚胎发育中的重要作用。我们发现异常的UTX表达会导致ZGA时间紊乱;UTX可以直接结合并激活ZGA事件中的关键基因Zscan4d而有利于植入前胚胎发育。

论文目录

摘要

ABSTRACT

缩略词表

第一章合子基因组激活与组蛋白去甲基化酶的研究进展

1 哺乳动物合子基因组激活

1.1 合子基因组激活的时间点

1.2 小鼠ZGA次波和主波

1.3 ZGA相关基因

1.3.1 小鼠内源性逆转录病毒-L

1.3.2 含锌指和SCAN结构域的蛋白4

1.3.3 2-细胞可变组成员1/3

1.3.4 真核翻译起始因子1a

2 ZGA期间表观遗传动态变化

2.1 全基因组DNA去甲基化

2.2 组蛋白翻译后修饰

2.2.1 组蛋白H3第4 位赖氨酸残基三甲基化（H3K4me3）

2.2.2 组蛋白H3第27 位赖氨酸残基三甲基化（H3K27me3）

2.3 组蛋白甲基转移酶与组蛋白去甲基化酶

3 组蛋白去甲基化酶的发现与分子机制

3.1 组蛋白去甲基化酶家族

3.1.1 LSD去甲基化酶

3.1.2 JMJC去甲基化酶

3.2 组蛋白去甲基化酶的生物学作用

3.3 组蛋白去甲基化酶的功能和机制

3.4 H3K27me3 去甲基化酶UTX的简介

3.4.1 H3K27me3 去甲基化酶UTX

3.4.2 UTX在细胞分化和胚胎发育中的作用

第二章 UTX在合子基因组激活中的作用机制研究

1 引言

1.1 UTX对 H3K27me3 修饰的影响

1.2 合子基因组激活对胚胎发育的影响

1.3 本研究的目的与意义

1.4 主要技术路线

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 胚胎培养液及配方

2.3 仪器及试剂

2.4 本研究所用引物

2.5 主要实验方法

2.5.1 转染小鼠胚胎成纤维细胞

2.5.2 实时定量PCR

2.5.3 免疫荧光

2.5.4 免疫印迹

2.5.5 Utx-m RNA体外转录

2.5.6 小鼠受精卵的收集

2.5.7 线性pcs2-UTX片段的准备

2.5.8 小鼠受精卵原核注射

2.5.9 过表达UTX小鼠的鉴定与繁殖

2.5.10 体重称量

2.5.11 生育率的统计

2.5.12 排卵数的统计

2.5.13 卵巢称重

2.5.14 小鼠植入前胚胎样品收集时间点

2.5.15 胚胎发育率的统计

2.5.16 卵巢切片免疫组化

2.5.17 Utx-siRNA的准备

2.5.18 ChIP-qPCR分析

2.5.19 荧光信号强度和灰度值分析

2.5.20 数据统计与分析

3 结果

3.1 构建pcs2-UTX表达载体的方案

3.2 pcs2-UTX表达载体的功能验证

3.2.1 pcs2-UTX在细胞水平上的功能检测

3.2.2 体外转录获得Utx-m RNA的功能检测

3.3 Utx转基因小鼠（Utx+小鼠）的制备

3.3.1 F0代Utx+小鼠的获得

3.3.2 Utx+小鼠繁殖结果

3.4 Utx+小鼠生殖能力的评估

3.5 Utx+小鼠胚胎发育的情况

3.6 UTX在植入前胚胎中的动态变化情况

3.7 外源Utx基因在卵母细胞和胚胎中的表达情况

3.8 探索Utx+小鼠胚胎发育异常的原因

3.9 UTX过表达对胚胎发育和MZT相关基因的影响

3.9.1 Utx-m RNA对胚胎发育的影响

3.9.2 Utx-m RNA对 MZT相关基因的影响

3.10 干扰UTX对胚胎发育的影响

3.10.1 Utx-siRNA干扰效率的检测

3.10.2 Utx-siRNA对胚胎发育的影响

3.10.3 Utx-siRNA对 MZT相关基因的影响

3.11 探索UTX与 Zscan4d的作用关系

3.12 胚胎发育挽救试验

3.12.1 Zscan4d-m RNA的获得以及功能验证

3.12.2 挽救试验对胚胎发育的影响

3.12.3 挽救试验对囊胚质量的影响

4 讨论

4.1 UTX过表达小鼠模型的制备

4.2 UTX对小鼠生殖能力和胚胎发育的影响

4.3 UTX在合子基因组激活中的作用

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间的学术成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 白力格

导师: 李光鹏

关键词: 胚胎发育,母源合子基因转变,合子基因组激活

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 内蒙古大学

基金: 国家科技重大专项高产优质转基因肉牛新品种培育课题(2016ZX08007-002)

分类号: Q344

DOI: 10.27224/d.cnki.gnmdu.2019.000078

总页数: 110

文件大小: 5221K

下载量: 97

组蛋白H3K27me3去甲基化酶UTX在合子基因组激活中的作用机制研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢