黄培信[1]2007年在《人表皮干细胞定位、分离培养与端粒酶表达的实验研究》文中研究指明一、研究目的(1)研究不同发育阶段人表皮干细胞定位与端粒酶表达特征,探讨这些特征对烧伤创面修复的临床意义。(2)研究人表皮干细胞的体外分离培养及鉴定方法,比较在体外培养条件下不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶活性表达差异,为表皮干细胞在皮肤组织工程中的应用奠定基础。二、研究方法第一部分表皮干细胞的定位与端粒酶表达检测取因创伤等原因致意外流产的胎儿皮肤和少儿、成年人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本,取材后立即用10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,4℃保存待测。所有标本经系列切片后,分别采用鼠抗人整合素β1(integrinβ1)、角蛋白19 (keratin19,K19)、p63转录因子(p63 transcription factor)、端粒酶逆转录酶催化亚基(telomerase reverse transcriptase catalytic subunit,TERT)单克隆抗体作为一抗,以免疫组织化学EnVision法检测皮肤组织中表皮干细胞标志物整合素β1、角蛋白19、p63转录因子和TERT的表达,200倍光镜下观察免疫组化结果,测定阳性表达率。第二部分表皮干细胞的分离培养、鉴定及端粒酶活性表达检测取因创伤等原因致意外流产的胎儿皮肤,用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,用Ⅳ型胶原快速粘附法分离、纯化人表皮干细胞,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液等组成的人表皮干细胞培养基进行体外培养。通过计算其克隆形成率、细胞周期测定及免疫细胞化学染色法β1整合素、K19、p63单抗检测等对培养细胞进行鉴定。均以角质细胞作对照。以免疫细胞化学染色法和图像分析法检测体外培养的胎儿皮肤、少儿皮肤和成年人皮肤表皮干细胞端粒酶活性表达。叁、研究结果第一部分胎儿皮肤、少儿皮肤和成年人皮肤表皮的基底部、毛囊周围细胞均可见β1整合素、K19、p63和TERT呈棕黄色阳性表达。胎儿表皮基底层细胞β1整合素、K19和p63均为强阳性;少儿表皮基底层细胞中大部分细胞表达β1整合素、K19和p63阳性细胞均匀分布;成年人表皮基底层β1整合素、K19和p63弱阳性表达,阳性细胞散在分布,且呈相对集中片状分布,阳性细胞表达强度较胎儿组、少儿组低。胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤端粒酶免疫组化染色均呈阳性,阳性细胞主要集中于表皮基底层。其中,胎儿表皮基底层阳性细胞表达强度较少儿表皮和成人表皮强,少儿次之,成人表皮表达最弱。胎儿皮肤、少儿皮肤与成年人皮肤β1整合素、K19、p63和TERT阳性表达率均随年龄增加而呈下降趋势,组间差异有非常显着性意义(P<0.01)。第二部分分离培养的人表皮干细胞呈明显克隆性生长,其克隆形成率明显高于对照组,组间差异有显着性意义(P<0.05)。细胞周期检测发现,人表皮干细胞G0/G1期细胞比例明显高于角质细胞组,组间差异有显着性意义(P<0.05)。免疫细胞化学检测显示,分离培养的人表皮干细胞β1整合素、K19和p63呈阳性表达,角质细胞对照组表达阴性。分离培养的人胎儿皮肤来源表皮干细胞、少儿皮肤来源表皮干细胞、成人皮肤来源表皮干细胞端粒酶活性表达均呈阳性。但表达强度不同,其表达强弱依次人胎儿皮肤来源表皮干细胞、少儿皮肤来源表皮干细胞、成人皮肤来源表皮干细胞。图像分析法检测各组细胞平均吸光度值和阳性面积值,结果显示:胎儿组、少儿组、成人组表皮干细胞平均吸光度值和阳性面积值均随年龄增加而逐渐降低,组间差异有显着性意义(P < 0. 05)。四、研究结论(1)胎儿皮肤、少儿皮肤和成人皮肤表皮干细胞主要位于表皮基底层,端粒酶表达阳性区域及信号强度与表皮干细胞的定位分布及阳性表达强度相一致。提示表皮干细胞的数量、端粒酶活性表达的强弱可能与不同发育阶段皮肤组织的修复能力差异密切相关。(2)本实验采用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮、用Ⅳ型胶原快速粘附法分离培养人表皮干细胞,细胞呈明显克隆性生长,G0/G1期细胞比例高,β1整合素、K19和p63免疫细胞化学染色均呈阳性表达。表明在本实验培养条件下分离培养的人表皮干细胞具有干细胞的生物学特性。(3)体外培养的人胎儿期、少儿期、成人期表皮干细胞均有端粒酶活性表达,其表达强弱依次为人胎儿皮肤来源表皮干细胞、少儿皮肤来源表皮干细胞、成人皮肤来源表皮干细胞。提示诱导和增强端粒酶活性表达对维持表皮干细胞在体外的自我更新和增殖能力可能具有重要意义。
揭彬[2]2003年在《人表皮干细胞的定位、分离培养及分化特性的研究》文中研究说明表皮干细胞(keratinocyte stem cell，KSC)具有强大的增殖再生能力，是表皮中各类细胞的起源细胞，在皮肤更新、伤口愈合、肿瘤形成等方面发挥着重要的作用。对表皮干细胞生物学特性的深入研究具有重要的意义。由于表皮干细胞数量少，而且在体外很容易分化而失去原来的生物学特性，所以干细胞的定位、分离培养及分化特性都是干细胞研究的重要课题。目的：1、观察不同来源的皮肤中表皮干细胞(KSC)的定位分布情况，并比较不同年龄的皮肤、正常皮肤与疤痕皮肤中KSC的分布及含量差异。2、研究干细胞的分离筛选方法，3、研究干细胞体外培养方法、条件，不同来源的滋养细胞的促干细胞克隆形成及生长的作用；4、研究干细胞在体外培养条件下的生长、分化特性。 方法：1. 取不同来源的皮肤(成人、胎儿、疤痕)，观察干细胞分子标志integrin(整合素)β1及终末分化标志involucrin(外皮蛋白)的表达情况；2. 原代表皮细胞培养：由包皮消化获得表皮细胞并传代培养。3. 滋养细胞的制备：用丝裂霉素C处理成纤维细胞，完全抑制其分裂增殖能力。4. 低密度单克隆培养：表皮细胞以低密度接种于滋养层上，培养12天后计算克隆形成率。将所含细胞数大于50、肉眼直径大于0.4mm的单个克隆挑取出来，分散成单细胞后接种培养，若一个克隆中95%以上的细胞能再次形成细胞数大于50的克隆，则该克隆为干细胞克隆，予继续传代培养。5. IV型胶原快速粘附法筛选表皮干细胞：将在20分钟以内粘附于胶原上的表皮细胞作为干细胞培养，12天后计算克隆形成率。以未加胶原粘附筛选的表皮细胞作为对照。6. KSC克隆的传代培养：将以低密度单克隆筛选法获得的干细胞克隆，以两种不同的方法分别进行传代培养。一种方法是每次传代时只挑取其中细胞数大于50、肉眼直径大于0.4mm的单个克隆进行传代培养；另一种方法是将KSC克隆的所有子代细胞混合消化成单细胞，低密度传代培养，12天后计算克隆形成率及免疫组化染色(抗integrinβ1及抗involucrin)，共观察5代。同时分别以3T3细胞、胎儿及小儿成纤维细胞作为滋养细胞，比较其促干细胞克隆形成及生长的作用。主要结果和结论：1. 不同来源的皮肤中干细胞的分布及含量差异：(1).正常成人皮肤中，干细胞特异性标志integrinβ1强阳性部位在真皮乳头尖上，散在或成团分布(干细胞巢)；在毛<WP=7>囊中位于其外跟鞘的膨大部分及球部；而在无毛的皮肤如手掌中则位于网状嵴的顶部；(2).胎儿皮肤中，基底细胞普遍为integrinβ1阳性细胞，呈多层排列，有干细胞巢，平均染色荧光强度显着高于于成人皮肤。说明胎儿皮肤中干细胞的含量可能较成人丰富；(3). 疤痕皮肤存在着明显的KSC分布异常，其基底层呈直线状，部分细胞染色阳性，干细胞呈单层分布，无“干细胞巢”。基底层的荧光强度曲线波动幅度较小，无正常皮肤所具有的典型的“M”形曲线特征。此外，疤痕皮肤平均荧光强度显着低于正常皮肤，说明疤痕皮肤中KSC的含量可能少于正常皮肤中KSC的量；(4). 成人疤痕皮肤中存在干细胞的增殖与分化异常。表皮细胞刚离开基底层即开始表达involucrin，与正常成人皮肤相比，疤痕表皮细胞提前进入终末分化。2. 表皮细胞生长特性：表皮细胞在体外呈复层生长，表现出迅速分化及生长加速的趋势。3. 原代表皮细胞克隆形成率(colony forming efficiency ，CFE)为5-10%。4. 胶原快速粘附法筛选干细胞的结果：与对照组相比，胶原组CFE显着升高，说明这是一种有效的筛选KSC的方法，但其CFE仅为16.2%-19.5%，另外80%以上的细胞不是克隆形成细胞(KSC)。表明此法是一种粗筛法，筛选的KSC细胞中有大量的TA细胞混杂。 5. KSC单克隆细胞传代培养的克隆再形成率：一个干细胞克隆分散成单细胞后接种，其克隆再形成率(CFE)为96.3%，每次传代时只挑取单个大的克隆接种培养，其CFE仍能保持在95%以上。而将所有子代细胞混合消化后传代培养，其总的CFE会逐渐下降，混合传代培养5代 ，其CFE分别为48.2%、37.2、33.4%、28.6%、27.4%。可见在体外培养条件下KSC克隆细胞逐渐分化，终末分化细胞逐渐增多，总的克隆形成率逐渐降低，但仍保留相当比例的克隆形成细胞。6. KSC的分化情况：KSC传代培养后子代细胞中可见叁种不同分化状态的克隆混合生长。其中干细胞克隆保留了干细胞特性，克隆中绝大部分细胞未分化(integrinβ1阳性)，可以持续传代，并进一步增殖分化出所有叁种类型的克隆；短暂增殖克隆具有短期的分裂增殖能力，部分细胞发生终末分化，只能分化出终末分化克隆，不能传代培养；而终末分化克隆中所有细胞均已进入终末分化(全部表达involucrin)，不具有克隆再形成能力。KSC在体外培养、传代的过程中会逐渐分化，干细胞克隆所占的比例逐渐减少，分化克隆的比例逐渐增加，并相应的表现出KSC子代细胞的总的CFE渐次降低。但每次传代时若只是将干细胞克隆单独挑取出来分散成单细胞后传代培养，其CFE仍能保持在95%以上并能持续传代。7. 不同滋养细胞的比较：用胎儿或小儿成纤维细胞作为滋养细胞，其促干细胞克隆形成及生长的作用与3T3滋养细胞的作用相似。<WP=8>8．应用低密度单克隆筛选法可成功地分离?
常洁[3]2007年在《猪表皮干细胞体外分离、培养和建系研究》文中进行了进一步梳理皮肤的表皮终生处于增殖、分化和脱落的不断更新之中，这正是由于其中表皮于细胞(Epidermal Stem Gells，ESCs)不断增殖分化所致。表皮干细胞是一种在体内具有无限更新能力，且能分化形成全层表皮的细胞，在体外培养具有长期生长潜能。开展分离纯化表皮干细胞建系研究，为表皮干细胞应用于医学临床的组织工程和人类重大疾病的细胞治疗打下技术基础。本研究以五指山实验用小型猪(Wu Zhi Shan Pigs，WZSP)近交系的耳组织为材料，分别从不同日龄猪、不同胶原、条件培养基和表皮生长因子等方面对ESCs分离培养的影响进行了研究，旨在探索ESCs的最佳分离培养条件，并在该条件下建立叁个表皮干细胞系，对所培养的ESCs进行了染色及免疫组化鉴定。得出研究结果如下：1．不同因素对猪表皮干细胞分离培养的影响研究采集4日龄、1月龄、3月龄、12月龄猪耳组织分离表皮干细胞，分别计算各组细胞的贴率。结果表明，随着实验猪日龄的增长，表皮干细胞的贴壁率逐渐降低，其中4日龄组贴壁率为12.68±1.11％，1月龄组为9.76±0.68％，根据ESCs所占表皮细胞约10％的比例，这两组最适宜作为分离纯化表皮干细胞的材料。将分离得到的表皮细胞分为两组，一组接种于Ⅰ型胶原包被的六孔板中，另一组接种与Ⅳ型胶原包被的六孔板中，15min后洗去未贴壁细胞，计算两组细胞的贴壁率。结果表明，Ⅰ型胶原组贴壁率为28.76±1.71％，Ⅳ型胶原组贴壁率为11.16±1.43％，由此可见，Ⅰ型胶原不适宜作为筛选表皮干细胞的基质。将分离纯化出的表皮干细胞分为两组，一组采用条件培养基培养，另一组采用DMEM／F12(1∶1)+15％血清培养。结果表明，条件培养基培养组细胞生长状况良好，呈克隆状生长，且传几代之后也不易发生分化，而有血清培养基培养组细胞生长速度非常缓慢，且从第二天开始就出现了分化现象，以后分化细胞逐渐增多，不能够形成克隆状。因此，在没有饲养层的条件下，表皮干细胞的培养必须添加条件培养基。分离纯化出的表皮干细胞分为四组，分别用含0ng／ml，10ng／ml，20ng／ml和30ng／ml表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)的培养液培养，绘制每组细胞的生长曲线。结果表明，10ng／ml、20ng／ml和30ng／ml浓度的EGF下ESCs生长曲线没有明显的差别(P＞0.05)，而不含EGF的培养液细胞增殖速度显着低于其他各组(P＜0.05)。2．猪表皮干细胞的建系研究采集WZSP实验用近交系耳组织，通过中性蛋白酶消化获得表皮，再通过0.25％胰酶+0.02％EDTA消化制成单个表皮细胞悬液，接种在Ⅳ型胶原包被的培养瓶内，采用条件培养基(DMEM／F12(1∶1)+10％条件培养液+5μg／mL insulin+20ng／mL EGF+20ng／mL IGF-Ⅰ+0.5μg／mL氢化可的松)培养，0.25％胰酶消化传代。表皮干细胞能够快速黏附在Ⅳ型胶原上，呈克隆状生长，一般传代间隔为7天左右。已建立叁个表皮干细胞系，均已传至20代以上。3．猪表皮干细胞的鉴定及分化研究取生长良好的第10代表皮干细胞进行AKP染色鉴定，结果呈阳性。K19和β1整合素免疫组化染色亦均呈阳性。证明所分离得到的细胞为表皮干细胞。将消化传代ESCs接种在铺明胶的培养瓶中培养3周左右，可逐渐分化成表皮膜片。
韩雅婷[4]2006年在《Nanog基因转染表皮干细胞及对其生物学特性影响的研究》文中研究说明基因敲除或导入是研究基因功能的主要手段,其为干细胞多能性维持的分子机制研究提供了大量信息。Nanog基因在胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)系中过量表达可以独立于LIF/Stat3途径维持内细胞团和ESCs的多能性,在3T3细胞系中强迫表达可以提高3T3细胞增殖能力。而表皮干细胞是一种具有很强自我更新能力并可不断产生功能性细胞以维持表皮稳态的成体干细胞。近年来,表皮干细胞在组织工程、细胞治疗上都显示出巨大的应用潜力,其多能性也日益引起人们关注,尽管如此,其多能性和自我更新能力仍远弱于ESCs。实验拟在分离出能于体外大量扩增的表皮干细胞群并鉴定之后,将ESCs多能性关键基因Nanog导入表皮干细胞并观察其对表皮干细胞生物学特性的影响。实验内容和结果如下:1.采取山羊耳部皮肤组织,通过对比酶消化培养法与组织块培养法两种原代细胞获取方法,有血清培养液与无血清培养液两种表皮干细胞培养液,以Ⅳ型胶原差速筛选表皮干细胞,显示酶消化培养法比组织块培养法获取细胞效率更高,且很少有成纤维细胞污染,适合于表皮干细胞的原代分离和继代培养。有血清培养液比无血清培养液更能促进山羊表皮干细胞贴壁成活,再经过Ⅳ型胶原差速筛选所获得的山羊表皮干细胞能够于体外连续传代且大量扩增。在冷冻保存复苏后,仍保持较高活力,适合做Nanog基因转染的靶标细胞。2.通过形态观察,表皮干细胞特异性分子标志免疫细胞化学染色,生长曲线和克隆形成率检测,对分离得到的表皮干细胞进行鉴定。实验分离的表皮干细胞体积小,细胞呈球形、致密,在显微镜下折光性强、胞体透亮,具极强的增殖能力,呈片状克隆生长,绝大多数表达β1整联蛋白、p63、α6整联蛋白,很少表达CK-14,不表达CD71,符合目前所知的表皮干细胞特性的标志。根据其第3、5、7代的生长曲线发现随着代数增高,细胞活力逐渐减弱。其第1、3、5代之间克隆形成率虽然也在下降,但差异不显着,初步认定所获细胞为表皮干细胞,可以用于目的基因转染。3.构建真核表达载体,测定抗生素对表皮干细胞的最小致死量,以脂质体法将pEGFP-Nanog导入山羊表皮干细胞,抗生素筛选阳性克隆,经荧光镜检和RT-PCR鉴定,发现目的基因在表皮干细胞中表达。对转染阳性表皮干细胞进行ESCs特异性标志的免疫细胞化学染色鉴定和克隆形成率检测,发现其表达SSEA-1,SSEA-4和端粒酶且克隆形成率相对较高,明显区别于两组对照。体外培养能够自发分化为神经样细胞,Oct-4阳性,显示Nanog可以促进表皮干细胞表现部分ESCs的生物学特性。
唐红英[5]2005年在《整合素β1对人表皮干细胞增殖与分化的影响》文中研究说明表皮干细胞(keratinocyte stem cell,KSC)位于表皮基底层,具有强大的增殖潜能,可分化形成全层表皮,并具有产生皮肤附件的作用,是潜在的多能干细胞。由于表皮干细胞数量少,而且体外培养很容易分化,所以对培养KSC的生物学特性进行深入研究具有重要的意义。探究如何在体外培养获得足够数量的KSC用于研究及移植、如何在体内外诱导KSC定向分化是KSC研究的又一重要课题,解决这些问题的关键在于研究KSC增殖与分化的调控机制。 本室先期已对不同来源皮肤中的KSC的定位分布进行了研究,对KSC进行了初步的分离培养。本研究主要探讨分离纯化人KSC的方法,观察KSC在体外培养条件下的生长及分化特性。针对目的基因整合素β1(integrin β1)构建siRNA表达质粒并鉴定,探讨下调KSC中整合素β1的表达对KSC增殖与分化的影响。 将人表皮细胞接种在Ⅳ型胶原包被的培养瓶中粘附10min,取粘附的类KSC以低密度接种于滋养层上,培养14d后挑选KSC克隆分散培养,观察其克隆再形成率,通过免疫细胞荧光染色法检测培养KSC中intergin β1及involucrin的表达水平,分析其细胞周期。将一个KSC克隆的所有子代细胞消化后接种,连续传代,培养14d后计算克隆形成率(CFE),观察KSC子代细胞的总体分化情况。 针对目的基因integrin β1选择了两个RNAi作用靶点,构建到pSilencer3.1/H1-Hygro载体上,通过酶切及测序鉴定重组阳性质粒。将低密度接种的KSC克隆挑选出来分散后接种,待细胞长至60%左右汇合时转染,用不同比例脂质体转染试剂Dotap介导转染不同剂量报告基因EGFP,优化转染条件。重组阳性质粒转染人KSC,通过定量western blot、半定量RT-PCR检测对目的基因的抑制效率,筛选出最有效的RNAi作用靶点,将其重组质粒命名为siIntegrin β1。 重组质粒siImegrin β1转染人KSC48～72h后,提取细胞总蛋白及总RNA,通过定量western blot、半定量RT-PCR检测对目的基因的抑制效率;并对RNAi后KSC行细胞周期分析。挑选RNAi后48～72h的KSC克隆分散后接种于滋养层上,培养14d
周树萍[6]2014年在《人成熟期增生性瘢痕皮肤与正常皮肤来源的表皮干细胞生物学特性的研究》文中指出研究背景皮肤（Skin）是人体最大的器官，作为人体第一道天然屏障，由表皮、真皮、皮下组织及其附属器组成。表皮干细胞(Epidermal Stem Cells,ESCs)作为皮肤及其附属器发生的源泉，具有维持皮肤新陈代谢和正常生理功能的作用[1-2]。瘢痕(Scar)是皮肤创伤愈合过程中必然的和必需的产物。当皮肤出现创伤时，ESCs具有促进创面再上皮化的能力，主动参与创面修复从而加速创面愈合。其促进创面愈合的机制可能为：①当皮肤组织受到损伤时，伴随着修复信号的启动，ESCs增殖能力增强，并加速分化为相应的细胞并向表皮上层迁移，主动地参与损伤修复，促进创面愈合；②当损伤创缘毛囊内的毛囊干细胞接到损伤修复的指令，能够立即启动毛囊隆突部的毛囊干细胞，主动的参与修复[3]。近些年来，随着对表皮干细胞特有的生物学特性研究的深入，人们开始考虑从细胞生物学角度考虑运用表皮干细胞为临床治疗提供新的策略。但其研究的表皮干细胞(ESCs)主要来源于正常皮肤（Normal Skin，NS）,而有关成熟期增生性瘢痕(Hypertrophic Scar,HS)表皮干细胞的生物学特性的研究尚无报道。且在整形手术中，经常有大量的瘢痕皮肤被切除丢弃，这就造成了本可再利用的宝贵资源的浪费。因此，本实验就成熟期增生性瘢痕（瘢痕组）表皮干细胞(HS-ESCs)的生物学特性进行研究，并与正常皮肤（对照组）表皮干细胞(NS-ESCs)进行对比研究，为HS-ESCs的应用提供研究基础。目的1．对HS-ESCs与NS-ESCs的生物特性进行对比研究，明确HS-ESCs的生物学特性。2．通过明确HS-ESCs的生物学特性，为增生性瘢痕的治疗找到一个全新的预防和治疗的方向；3．为HS-ESCs的科学研究和临床应用研究提供前期的研究基础。材料与方法1．取人成熟期HS和NS，通过HE染色，对比成熟期增生性瘢痕和正常皮肤的组织结构。2．取人成熟期HS和NS，通过免疫组织化学检测角蛋白19、整合素β1在成熟期HS和NS中的表达情况，确定成熟期HS中是否存在ESCs。3．取人成熟期HS和NS，采用两步酶消化法分离表皮细胞，Ⅳ胶原快速粘附分选纯化ESCs，贴壁培养，观察细胞形态结构。4．取原代培养的ESCs，应用CCK-8检测HS-ESCs和NS-ESCs的生长特点，确定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生长特点。5．取原代培养的ESCs，利用免疫细胞化学技术，检测角蛋白19、整合素β1及核蛋白p63在HS-ESCs和NS-ESCs的表达情况，确定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物学特性。6．取原代培养的ESCs，利用流式细胞技术，检测角蛋白19、整合素β1及CD49f在HS-ESCs和NS-ESCs的表达情况，并确定原代培养的成熟性HS-ESCs的细胞比例。7．取原代培养的ESCs，利用Western-Blot技术，检测角蛋白19、整合素β1及p63蛋白在HS-ESCs和NS-ESCs的表达情况，确定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物学特性。8．取原代培养的ESCs，利用real-time PCR技术检测Oct4基因和Nanog基因在HS-ESCs和NS-ESCs的表达情况，确定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物学特性。结果1．通过HE染色，成熟期HS与NS的表皮层细胞排列整齐，层次分明。通过免疫组织化学检测CK19、整合素β1在成熟期HS和NS中均呈阳性表达，且两者间表达情况没有统计学差异（P>0.05），可以推断成熟期HS存在ESCs。2．原代培养细胞观察其形态，HS-ESCs和NS-ESCs均呈水滴状，椭圆形，呈铺路石样排列。CCK-8检测原代培养的ESCs的增殖能力，第1-2天细胞增殖较慢，3-5天呈对数增殖，6-7天趋于平缓，两组间增殖能力没有统计学差异（P>0.05）。3．免疫细胞化学技术检测角蛋白19、整合素β1及p63的表达情况，两组间没有统计学差异（P>0.05）；利用流式细胞技术检测角蛋白19、整合素β1及CD49f的表达情况，两组间阳性细胞百分比见存在统计学差异（P﹤0.05）；WesternBlot检测CK19、整合素β1及p63蛋白的表达情况，两组间没有统计学差异（P>0.05）；real-time RT-PCR技术检测Nanog基因和Oct4基因的表达情况，两组间没有统计学差异（P>0.05）。结论1．在成熟期的增生性瘢痕中存在着ESCs；2．通过两步酶消化法，Ⅳ胶原快速分选能够从成熟期的增生性瘢痕得到ESCs，且其具有与正常皮肤的ESCs相同的生物学特性，但是成熟期的增生性瘢痕中ESCs数量较正常皮肤的ESCs少。3．成熟期增生性瘢痕来源的ESCs具有正常皮肤来源的ESCs相同的生物学特性，完全可以替代正常皮肤来源的ESCs应用于科学研究中，如组织工程研究人工皮肤等提供皮肤细胞种子等；应用于临床应用研究中，如作为皮肤细胞的种子和皮肤更新的源泉，应用于临床修复难愈性创面或者大面积皮肤缺损的治疗等，不仅避免了含有大量宝贵ESCs的资源浪费，也减轻了从正常皮肤提取ESCs带给患者的伤害。
高云鹤[7]2009年在《人表皮干细胞的分离、培养和鉴定》文中进行了进一步梳理表皮干细胞(Epidermal stem cells,ESCs)是各种表皮细胞的祖细胞,来源于胚胎的外胚层,具有双向分化潜能。一方面可向下迁移分化形成表皮基底层,进而生成毛囊;另一方面则可向上迁移,并最终分化为各种表皮细胞,对皮肤损伤及毛囊的生长起关键作用。随着分子生物学、细胞生物学、组织工程学及生物工程学等学科的发展,表皮干细胞凭借其特有的生物学优势在基因治疗、细胞治疗中越来越受到重视,但表皮干细胞数量较少,只占基底细胞总数的1%-10%,且表皮干细胞还没有确定的特异性分子标志物,所以成功地分离培养表皮干细胞是至关重要的一步。本实验进一步探讨以上问题,为获取足够的表皮干细胞以及为确定表皮干细胞的分子标记物奠定了基础。
廖明德[8]2009年在《人表皮干细胞复合裸鼠脱细胞真皮支架构建组织工程皮肤及移植的实验研究》文中指出目的:用组织工程学原理,通过体外分离扩增人表皮干细胞作为种子细胞,复合自己制备的异种(裸鼠)脱细胞真皮支架材料,探讨体外构建活性组织工程皮肤的可行性。将该组织工程皮肤移植于实验动物创面,检测和了解该组织工程皮肤的结构和功能。方法:用中性蛋白酶消化法,分离小儿包皮的表皮,制成单细胞悬液, IV型胶原快速粘附10-15min (370C),分别取快速粘附细胞和未黏附的细胞培养。用K-SFM培养基,补充10%的干细胞培养专用胎牛血清(FBS)。用免疫组织化学测定角蛋白15(CK15)、角蛋白19(CK19)和β1整合素(β1-integrin)和用流式细胞仪检测CD71等指标,对进表皮干细胞行鉴定。以胰蛋白酶法制备(裸鼠)脱细胞真皮支架,并进行组织学观察。将分离培养传代的表皮干细胞接种于铺好IV型胶原的脱细胞真皮表面,置入干细胞培养体系培养后,再行气液界面培养构建组织工程皮肤。HE染色切片观察组织工程皮肤结构。将组织工程皮肤移植于实验动物创面,以单纯脱细胞真皮移植作对照。肉眼观察移植后的创面情况,对移植后的皮肤取材行组织学观察及免疫组织化学鼠抗人广谱角蛋白染色确定组织来源。结果:1.表皮干细胞能被IV型胶原快速黏附;2.黏附的细胞在培养皿中后很快贴壁,第3-4d形成一些小集落,其后细胞逐渐增殖,至第7d左右逐渐有大集落形成。而未黏附的细胞集落形成早1-2d,集落形成数明显少于实验组。黏附细胞免疫组织化学染色阳性率CK15为50.80%+1.81、CK19为51.40%+2.22、和β1-integrin为51.40%+1.90,CD71阳性率约1.91%+0.21。黏附细胞具有表皮干细胞特性,阳性率与文献报道的差别不大。3、制备的脱细胞真皮支架呈乳白色,柔软有弹性,光镜下见表皮去除,真皮内无其他细胞成分,胶原纤维结构保存完好,排列有序。4、表皮干细胞能快速黏附到由IV型胶原包被的脱细胞真皮支架上,迅速贴壁生长,无排斥反应。联合培养约两周后,可融合形成含1-2层细胞的复合皮。5、活性复合皮移植于实验动物的创面后,创面愈合良好,未见排斥反应,创面收缩不明显; 4周后,移植皮肤取材切片HE染色,光镜下见创面愈合,皮层含2-3层细胞,胶原排列整齐,未见皮肤附属结构。组织工程皮肤鼠抗人广谱角蛋白染色为阳性反应,对照组染色阴性,鼠皮广谱角蛋白染色阴性,说明移植皮肤的皮肤结构来源于实验用的人体种子细胞,表皮干细胞向表皮细胞分化。脱细胞真皮组无表皮结构形成,表面逐渐干燥、变硬,创面收缩,3周后创面愈合。组织取材HE染色未见表皮层结构形成,为红染的疤痕样组织,鼠抗人广谱角蛋白染色为阴性反应。结论:1、表皮干细胞能被IV型胶原快速黏附,利用这一特性,可以用来筛选表皮干细胞,并在K-SFM培养体系中分裂增殖,产生大量的子代细胞,可作为皮肤组织工程的种子细胞。2、胰蛋白酶法制备的异体脱细胞真皮,能去除表皮层及真皮内各种细胞成分,胶原纤维结构保存完好,可作为组织工程用脱细胞真皮支架材料。3、扩增、传代的第二代表皮干细胞能快速黏附在预铺好IV型胶原的脱细胞真皮上,在表皮干细胞培养体系中生长,联合气液界面培养,能构建活性复层结构的人工皮肤。4、构建的活性组织工程皮肤能修复实验动物创面,4周后的组织学检测显示,表皮干细胞分化为表皮细胞,组织内未见有皮肤附属结构形成。
李海胜[9]2017年在《P311在表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景:烧伤、创伤、手术、糖尿病等引起的皮肤创面是常见的临床问题之一。如何有效促进创面愈合、避免瘢痕形成是治疗皮肤创面的关键。但由于对创面愈合和瘢痕形成的机制不甚清楚,导致创面和瘢痕的治疗效果十分有限。目前认为,肌成纤维细胞在创面愈合和瘢痕形成中发挥关键作用:肌成纤维细胞产生的强大收缩力可以促进创面的快速闭合,但是如果肌成纤维细胞活性持续升高,则会导致瘢痕形成。皮肤创面愈合过程中,局部的成纤维细胞、骨髓和外周血中的纤维细胞、血管周细胞、血管平滑肌细胞等是经典的肌成纤维细胞主要来源。表皮细胞主要通过分泌TGFβ1、b FGF、IL 1β、TNFα等因子来调控成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。我们推测,表皮干细胞(Epidermal stem cells,Ep SCs)可能具有转分化为肌成纤维细胞或肌成纤维样细胞(Myofibroblast-like cells,MFLCs)的潜能,主要依据包括:(1)创面再上皮化过程中存在着上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的行为特点。创面再上皮化时,创缘的Ep SCs逐渐失去紧密连接和顶底极性,溶解基底膜,发生细胞骨架重排,获得间质细胞的特性,从而具备较强的迁移能力。(2)角质形成细胞具有转分化为肌成纤维细胞的潜能,而Ep SCs可以分化为角质形成细胞,并且是创面再上皮化的主要功能细胞。在TGFβ1、TNFα、IL 1β和FBS刺激下,表皮中的角质形成细胞可以直接转分化为成纤维细胞或肌成纤维细胞。人角质形成细胞具有向脂肪细胞、平滑肌细胞和神经细胞分化的潜能,甚至在连续传代过程中就可有能发生EMT。(3)研究表明,创缘的表皮细胞可能是早期创面收缩力的主要来源,其收缩作用甚至早于创缘和肉芽组织中的肌成纤维细胞。(4)创面局部缺氧环境和大量的细胞因子(如TGFβ1、IL1β、TNFα)也可以诱导EMT。P311,又称为神经元再生相关蛋白(Neuronal regeneration related protein,NREP)、戊四唑17(Pentylenetetrazol 17,PTZ17)、神经元蛋白3.1(Neuronal protein 3.1)等,是一种约8k Da的功能未知的胞浆蛋白,因为含有叁个PEST结构域和多个赖氨酸残基,极易被泛素蛋白酶和基质金属蛋白酶降解,P311蛋白在细胞内的半衰期仅约5分钟。目前研究表明,P311参与了神经再生、肺泡发育、肿瘤细胞侵袭、血压稳态维持、创面愈合和瘢痕形成。本课题组和他人结果表明,P311高表达于皮肤创面新生表皮的Ep SCs、肉芽组织的肌成纤维细胞和增生性瘢痕中,并且P311敲除小鼠的皮肤缺损创面愈合速度减慢。P311还可以促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化和Ep SCs迁移。因此,P311在肌成纤维细胞生成和Ep SCs调控中发挥重要作用。研究发现,P311是TGFβ1/Smad信号通路的重要调控因子:P311可以通过调控TGFβ1的自我诱导、TGFβ1的翻译等调控TGFβ1表达,进而调控下游Smad信号通路。而TGFβ1/Smad信号通路是创面愈合和EMT的关键调控机制之一。因此,我们提出如下科学假说:P311通过TGFβ1/Smad信号通路调控创面愈合过程中表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化(Epidermal stem cell to myofibroblast-like cell transdifferentiation,Ep My T)。本研究主要分为以下叁个方面:P311在Ep My T中的具体作用,P311通过TGFβ1/Smad信号通路调控Ep My T,P311调控TGFβ1的可能分子机制。方法:1.P311在表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化中的作用。1.1 P311在体外小鼠和人原代表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化中的作用。利用两步消化法、IV型胶原差速贴壁法和KSFM无血清培养基,从人包皮和新生小鼠中分离培养原代Ep SCs,并利用流式细胞术进行鉴定。利用腺病毒转染技术使Ep SCs高表达P311,利用流式细胞术和实时定量PCR检测转染效率。利用免疫荧光染色、实时定量PCR和Western blot检测P311高表达后Ep SCs中表皮干细胞标志E-cadherin和β1 integrin、肌成纤维细胞标志Vimentin和α-SMA的表达水平,利用Western blot检测I型胶原和MMP2表达,利用凝胶收缩实验观察Ep SCs收缩能力,利用划痕实验观察Ep SCs迁移能力。1.2 P311在体内小鼠和人烧伤创面Ep My T中的作用。利用恒温烫伤仪制作小鼠背部浅II°烫伤模型,大体和HE染色观察P311敲除小鼠和野生型小鼠的伤口愈合和再上皮化规律,免疫组化染色观察表皮中Vimentin和α-SMA的表达情况,实时定量PCR和Western blot检测创面Ep My T相关标志物的表达水平。利用免疫组化染色和连续切片、免疫荧光染色复合免疫组化染色等技术观察烧伤患者表皮中P311、Vimentin和α-SMA的表达以及共定位情况。1.3烧伤创面微环境对Ep SCs内P311和α-SMA表达的影响。利用实时定量PCR检测IL1β、TNFα、IL6和缺氧等创面微环境对Ep SCs内P311和α-SMA m RNA表达的影响。2.P311通过TGFβ1/Smad信号通路调控Ep My T。2.1 P311对TGFβ1/Smad通路的调控作用。利用ELISA、实时定量PCR和Western blot检测高表达或敲除P311对TGFβ1m RNA、TGFβ1蛋白合成和分泌的影响。利用Western blot检测高表达或敲除P311对Smad 2和Smad 3蛋白表达和磷酸化的影响。2.2 TβRI/II抑制剂LY2109761、Smad3 si RNA和外源性TGFβ1对P311引起的Ep My T的调控作用。利用免疫荧光染色和Western blot检测TβRI/II抑制剂LY2109761对P311引起的Ep My T的阻断作用。利用Western blot检测Smad3 si RNA对P311引起的Ep My T的阻断作用。利用Western blot检测外源性TGFβ1对P311敲除小鼠Ep SCs转分化能力的恢复作用。3.P311调控TGFβ1表达的分子机制。3.1 P311调控TGFβ1表达的主要阶段。利用TGFβ1启动子报告基因载体、亚硫酸氢盐测序法、放线菌素D刺激复合实时定量PCR法、TGFβ1非翻译区(Untranslated region,UTR)报告基因载体等检测P311对TGFβ1启动子活性、启动子甲基化、m RNA稳定性和UTR活性的影响。3.2 P311调控TGFβ1 UTR活性的可能机制。Genebank下载所有物种P311和TGFβ1氨基酸和m RNA序列,利用DNAMAN软件进行P311和TGFβ1多序列比对、同源性分析和进化树绘制,利用DNASTAR分析TGFβ1各区段长度和GC含量,利用RPISeq和Lnc Pro预测人P311蛋白和人TGFβ15’-UTR和3’-UTR各调控区域的相互作用可能性,利用BINDN+、RNABINDRPLUS和SNBRFinder预测P311蛋白的可能RNA结合位点。3.3 P311可能通过e IF6间接调控TGFβ1的蛋白表达。利用Western blot检测Ep SCs中高表达或敲除P311对e IF6表达的影响、敲降或沉默e IF6对TGFβ1蛋白表达的影响。结果:1.P311在体外小鼠和人原代表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化中的作用。1.1成功分离培养并转染小鼠和人原代Ep SCs。培养的Ep SCs呈克隆样生长,每个细胞呈立方形,并且95%以上的细胞为CD49f+CD71—Ep SCs。腺病毒转染48小时后,95%以上Ep SCs表达GFP,P311 m RNA含量明显升高。1.2 P311促进小鼠表皮干细胞向肌成纤维样细胞,而不是肌成纤维细胞转分化。P311腺病毒转染72小时后,小鼠Ep SCs体积变大、呈长梭形和扁平状,α-SMA和Vimentin阳性细胞比例升高、E-cadherin阳性细胞比例下降,细胞骨架由网状皮质排列重排为应力丝结构,α-SMA蛋白和m RNA水平分别升高为空载体组的2.69倍(P<0.05)和1.56倍(P<0.01),Vimentin蛋白水平升高为空载体组的1.72倍(P<0.05),E-cadherin和β1integrin蛋白水平分别降低为空载体组的32%和68%(P<0.05)。P311组Ep SCs迁移指数升高到空载体组的6.29倍(P<0.01),I型胶原和MMP2蛋白水平分别升高到空载体组的11.21倍和1.45倍(P<0.05),但P311组和空载体组胶原凝胶均未出现明显收缩。1.3 P311促进人表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化。P311高表达后,人Ep SCs内α-SMA+细胞比例显着升高(35%vs 3%,P<0.01),E-cadherin阳性细胞比例显着降低(22%vs 63%,P<0.01)。同时,α-SMA蛋白水平升高为空载体组的2.09倍(P<0.05),E-cadherin和β1integrin蛋白水平分别降低为空载体组的57.68%和32.87%(P<0.05)。2.P311在人和小鼠烧伤创面Ep My T中的可能作用。2.1 P311敲除小鼠烧伤创面愈合和再上皮化速度减慢。大体观察发现,P311敲除小鼠伤口绝对面积和面积百分比在伤后2天、4~7天均显着高于P311野生型小鼠。HE染色发现,伤后4天和7天P311敲除小鼠伤口再上皮化速度显着慢于P311野生型小鼠。伤后7天,P311敲除小鼠伤口的表皮间距显着宽于P311野生型小鼠(9.87 mm vs 6.82 mm,P<0.05),新生表皮长度显着短于野生型小鼠(1.48 mm vs 2.14 mm,P<0.05)。2.2 P311敲除小鼠烧伤创面中Ep My T水平可能下降。免疫组化染色发现,P311敲除小鼠新生表皮中Vimentin+细胞数目低于P311野生型小鼠,而未观察到表皮α-SMA的特异性表达。P311敲除小鼠创面内Vimentin、TGFβ1、TWIST1和Snail2 m RNA水平均显着低于P311野生型小鼠。并且,P311敲除小鼠创面内β1 integrin蛋白水平显着高于P311野生型小鼠。P311敲除小鼠正常皮肤和烧伤创面中Vimentin、LAP-TGFβ1和活性TGFβ1蛋白水平显着低于P311野生型小鼠。2.3 P311在人烧伤创面Ep My T中的可能作用。烧伤创面表皮中α-SMA、Vimentin、P311阳性细胞均多于正常皮肤,共染发现人烧伤创面表皮中存在着P311+α-SMA+细胞和P311+Vimentin+细胞。3.烧伤创面微环境对Ep SCs内P311和α-SMA m RNA表达的影响。IL1β和TNFα使Ep SCs内P311 m RNA水平升高40倍以上(P<0.01),缺氧使其升高7.58倍(P<0.01),IL6使其升高4.05倍(P<0.05)。并且,IL1β、TNFα、IL6和缺氧均引起Ep SCs内α-SMA m RNA水平明显升高(P<0.05)。4.P311对TGFβ1/Smad通路的调控作用。4.1 P311对TGFβ1表达的调控作用。P311组Ep SCs内LAP-TGFβ1和活性TGFβ1蛋白的水平分别升高到空载体组的4.21和6.89倍(P<0.01),TGFβ1 m RNA水平下降至空载体组的78.81%(P<0.01),TβRI和TβRII m RNA水平分别升高到空载体组的1.72倍(P<0.05)和2.22倍(P<0.01)。P311敲除小鼠Ep SCs的培养上清内TGFβ1总蛋白水平降至P311野生型小鼠Ep SCs的51.15%(P<0.05)。4.2 P311促进Smad2和Smad3蛋白的磷酸化。P311组Ep SCs内p Smad2和p Smad3比例分别升高为空载体组的2.51倍和2.80倍(P<0.01)。外源性TGFβ1刺激下,P311敲除小鼠Ep SCs内p Smad2和p Smad3比例分别降至P311野生型小鼠Ep SCs的52.17%和65.71%(P<0.05)。但敲除或高表达P311对Smad2和Smad3总蛋白水平无显着影响。5.TβRI/II抑制剂LY2109761阻断P311引起的Ep My T。LY2109761可以显着抑制P311引起的p Smad2和p Smad3表达升高。LY2109761可以使P311高表达Ep SCs失去肌成纤维细胞样形态。并且,LY2109761将P311组α-SMA+细胞比例从39.99%降至7.93%,将E-cadherin+细胞比例从8.37%升至43.43%(P<0.01)。同时,LY2109761可显着抑制P311组Ep SCs内升高的α-SMA和Vimentin蛋白水平,提高P311组Ep SCs内降低的β1integrin和E-cadherin蛋白水平(P<0.01)。此外,LY2109761可显着降低P311组Ep SCs内I型胶原和MMP2蛋白水平。6.Smad3 si RNA阻断P311引起的Ep My T。Smad3 si RNA可使Smad3蛋白水平降低为P311组的40.64%(P<0.05),几乎完全抑制p Smad3的表达(P<0.01)。P311+Smad3 si RNA组Ep SCs内α-SMA水平显着低于P311组和P311+mock si RNA组(P<0.01),E-cadherin水平显着高于P311组和P311+mock si RNA组(P<0.01),但与空载体组无显着差异。7.外源性TGFβ1可以恢复P311敲除小鼠Ep My T的能力。TGFβ1刺激后,P311敲除小鼠和野生型小鼠Ep SCs内α-SMA蛋白水平均显着升高。并且,TGFβ1刺激后的P311敲除小鼠Ep SCs内α-SMA蛋白水平与TGFβ1未刺激的P311野生型小鼠Ep SCs内α-SMA蛋白水平无显着差异。8.P311通过促进启动子甲基化和提高UTR活性调控TGFβ1表达。P311对TGFβ1启动子活性无显着影响,但可以增加TGFβ1启动子的甲基化位点。m RNA稳定性结果发现,P311组TGFβ1 m RNA的降解速率略低于空载体组(斜率:-0.0805 vs-0.112),但二者无统计学差异(P=0.4531)。并且,P311组TGFβ1 5’-UTR、3’-UTR’和3’/5’-UTR的活性均显着高于空载体组。9.P311调控TGFβ1 UTR活性的可能机制。14个物种间TGFβ1的氨基酸和ORF区域相似率均在80%以上,而5’-UTR和3’-UTR区域的总相似率分别仅为30.45%和15.18%。人和小鼠TGFβ1 5’-UTR的长度分别为889bp和867bp,GC含量分别为71.6%和65.9%;3’-UTR长度分别为521 bp和134bp,GC含量分别为57.8%和76.9%。P311结合于TGFβ1 5’-UTR中63~121和422~615的抑制区域、77~106的茎环区域和3’-UTR的可能性大于50%。进一步分析发现,29R、31P、33P、34K、35E、36V、37N、38R、39K可能是P311结合于RNA的主要位点。10.P311可能通过e IF6间接调控TGFβ1蛋白表达。P311高表达引起Ep SCs内e IF6蛋白表达下降,而P311敲除引起e IF6蛋白表达升高。e IF6敲降或沉默使Ep SCs内活性TGFβ1和LAP-TGFβ1的水平明显升高。结论:本研究首次证实,P311是一种新的表皮干细胞向肌成纤维样细胞转分化的调控因子,并且TGFβ1/Smad通路在其中发挥重要的调控作用。P311通过增强TGFβ1启动子甲基化抑制TGFβ1转录,通过结合并激活TGFβ1 5’-UTR和3’-UTR促进TGFβ1翻译。烧伤创面局部的炎性因子和缺氧微环境可诱导表皮干细胞P311的表达。敲除P311可导致烧伤创面愈合延迟。因此,研究结果不仅可以表明表皮干细胞可能是皮肤创面愈合中肌成纤维细胞的另一重要来源,更为重要的是,发现了一种新的皮肤创面愈合机制,即:炎性因子和缺氧-P311-TGFβ1-Smad2/3-Ep My T-MMP2和I型胶原分泌增多-迁移能力增强-创面愈合加快。研究结果丰富和完善了P311的生物学功能和烧伤创面愈合机理,同时为创面愈合的基础研究和临床治疗提供新靶点和新线索。
李丹[10]2007年在《创面愈合中SDF-1的表达对表皮干细胞迁移作用的机制研究》文中提出皮肤作为人体最大的器官,外层的表皮终身不断自我更新。这种更新由表皮基底层具有再生能力的角质形成细胞分裂、增殖、分化来完成。皮肤角质形成细胞主要包括表皮干细胞(epidermal stem cell,ESC)、短暂扩增细胞(transit Amplifying cell,TA cell)以及终末分化细胞(postmiotic diffetrentiating cell,PMD cell)。其中,位于表皮基底层的表皮干细胞持续增殖分化以取代外层终末分化细胞,从而在维持组织结构的更新、细胞内环境的稳定,尤其在创伤后创面修复过程中起着至关重要的作用。付小兵等,通过建立动物创伤模型,观察到创面愈合过程中,随着时间的推移创缘周围尤其是棘层或颗粒层出现多个散在的β1-整合素(β1-intergin)及K19阳性表达的细胞,且越接近创面这些阳性细胞越密集;此种阳性细胞被认为是表皮干细胞。目前,关于这种表皮干细胞在创缘周围数量逐渐增多并且密集分布的具体机制并不十分清楚。创伤愈合早期,创周组织大量渗液,这些渗液中富含细胞因子、细胞外基质及内毒素等成分。这些细胞因子在创伤愈合过程中具有重要作用,它们可以调节创伤修复过程中的多种细胞反应,影响细胞增殖、迁移、细胞外基质合成和释放等。因此我们推测很可能是由创周组织分泌液中的某些细胞因子成分及其位于细胞表面或胞体内的受体共同介导了表皮干细胞的分布变化及数量改变,而这种改变很可能就是趋化因子及其受体介导的趋化效应。为了对表皮干细胞的在创缘周围所表现出的分布及数量改变的机制进行初步探索,本实验首先通过建立大鼠创伤模型,运用免疫组织化学方法对创伤后不同时相点表皮干细胞的组织学分布进行定位;ELISA检测趋化因子SDF-1在创周组织中的表达情况,并观察创伤条件下表皮干细胞在创缘的分布变化趋势与SDF-1表达情况的相关性。其次,通过选择两种经典的细胞表面标志物——β1-intergin及角蛋白19(K19),对体外培养获得的表皮干细胞进行鉴定;并运用免疫荧光化学方法和流式细胞仪技术对体外培养的表皮干细胞表达趋化因子受体CXCR4的情况进行了检测。最后,利用Transwell培养体系,观察从烧伤患者创面预先收集的创面分泌液对表皮干细胞的体外趋化作用,并对其作用机理进行初步探讨。具体研究方法及结果如下:1、创伤后不同时相点大鼠表皮干细胞的组织学分布定位采用免疫组织化学方法,结果显示伴随创面愈合进程,表皮干细胞的定位分布不象正常皮肤那样呈单层片状、散在分布于表皮基底层,而是由单层逐渐增加为双层乃至多层,特征性的改变是棘层或颗粒层出现多个散在的β1-intergin、K19和BrdU滞留剂标记阳性细胞,且越接近创面这些阳性细胞更加密集,其数量随着创面的缩小渐逐增加,至创面愈合、上皮化,这些阳性细胞仍然存在。组织形态学上表现为新生表皮组织较正常组织明显增厚。2、创缘周围组织SDF-1的表达情况检测酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测创缘周围组织匀浆上清中SDF-1的表达情况。以正常组织匀浆上清作为对照组。创缘周围组织中SDF-1在伤后24h天开始逐渐表达,其表达量随着创面愈合进程呈上升趋势,于创伤后第7天达到各检测时相点的最高值;对照组中SDF-1呈微量表达,伴随创面愈合进程组间各组SDF-1变化未见显着差异。3、人表皮干细胞的分离培养及鉴定获取5～15岁行包皮环切术的年轻患者术后的包皮组织,利用中性蛋白酶和胰酶两步分离法以及表皮干细胞对Ⅳ型胶原的快速黏附对细胞进行筛选,筛选出的干细胞在Ⅳ型胶原上生长良好,细胞形态均一,呈“铺路石状”,细胞小而圆,核浆比例大,表现出原始细胞的形态特征,具有较高的克隆形成率、表皮干细胞表面标记物K19、β1-integrin呈阳性表达,说明通过该方法较为成功的培养出人表皮干细胞。4、人表皮干细胞表达趋化因子受体CXCR4情况的检测免疫荧光化学检测体外培养表皮干细胞表达趋化因子受体CXCR4的情况;结果显示:①细胞胞膜及胞浆内FITC荧光染色呈阳性;②流式细胞仪检测表皮干细胞表达趋化因子受体CXCR4的阳性百分率约为43.5%。5、创面分泌液的收集及其对表皮干细胞体外趋化作用的实验研究均取自本院烧伤研究所烧伤患者创面分泌液(n=6),采用无菌操作,10 ml注射器抽取创面分泌液或痂下积液,收集离心取上清,滤纸过滤后微型过滤器抽滤除菌,-70℃无菌保存备用。利用Transwell培养体系进行体外趋化实验结果显示,创面收集液组从微孔膜上层迁移至下层的细胞数约为(87±9.12),明显多于CXCR4受体拈抗组(21±2.71)和K-SFM对照组(15±3.28)(P＜0.05)。受体拮抗组稍多于K-SFM对照组,但无显着差异(P＞0.05)。通过以上实验结果我们可以初步得出结论:1、创伤条件下SD大鼠表皮干细胞分布发生改变,不仅位于于表皮基底层,且在创缘周围呈密集分布并伴有数量增多的趋势。2、SD大鼠创缘周围组织中SDF-1大量表达,伴随创面愈合进程呈逐渐升高的趋势直至创面愈合;而创面对侧正常皮肤组织中SDF-1呈微量表达,在创面愈合过程中表达量未见明显变化。3、表皮干细胞表达趋化因子受体CXCR4。4、创面分泌液对表皮干细胞具有较为明显的体外趋化作用,该趋化效应在不排除其它信号通道共同作用的情况下,主要由SDF-1/CXCR4所介导。
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