无抗黑曲霉表达系统构建及脂肪酶的表达

论文摘要

黑曲霉作为一种重要的工业生产菌株,已逐步开发成为一种重要的酶表达系统。在本研究中,首先选择一株低蛋白背景且潮霉素敏感菌株为表达宿主,并对农杆菌介导转化法和PEG-原生质体转化法进行条件优化,然后以脂肪酶为模式酶在黑曲霉中进行同源/异源脂肪酶的表达。通过转录和转录后水平改造提高了黑曲霉脂肪酶ANL的表达量,并进行了酶学性质研究。最后初步开展了CRISPR/cas9技术在黑曲霉表达系统中的应用,构建了尿嘧啶缺陷型菌株。主要结果如下:（1）对农杆菌介导转化和PEG-原生质体转化两种方法进行了条件优化。优化后农杆菌介导转化的条件是不萌发的新鲜孢子与OD600培养至0.9-1.0的农杆菌以1:1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200μmol·L-1的IM平板上,23oC避光培养48 h后进行转膜。最佳转化效率大约为每106个孢子获得60±5个转化子,并且阳性率保持在90%以上。原生质体制备条件为:107个?mL-1黑曲霉孢子接种PDA浸提液,30oC,200 r·min-1培养24 h,收集菌丝体,按质量体积比1:10加入裂解酶液(0.8 mol·L-1MgSO4,1%纤维素酶,0.5%蜗牛酶,0.25%溶菌酶),37oC,120 r·min-1酶解2.5 h后收集原生质体,获得原生质体个数约6.8×105个?mL-1,原生质体再生率约63±2.5%。（2）将同源及异源蛋白在黑曲霉中进行表达,异源华根霉脂肪酶RCL在黑曲霉CICC2169中未能表达,同源黑曲霉脂肪酶ANL可以表达但表达量较低。启动子转录水平分析,诱导型启动子glaA转录水平相比于野生型提高50.35倍,而组成型启动子gpdA转录水平相比于野生型提高994.86倍。尝试3种方式来提高ANL的表达水平,包括补充内含子（提高mRNA的稳定性）、添加kozak序列（增强翻译效率）、不同信号肽（增强蛋白胞外分泌效率）。在均是glaA为信号肽的前提下,改造之前初始转化子检测不到酶活力,单补充内含子的转化子酶活约为75.80 U?mL-1,单添加kozak序列的转化子酶活约为61.33 U?mL-1,信号肽的影响效果为cbhⅠsignal>ANL signal>glaA signal。整合三种策略,表达最好的转化子为kocbhS-ANL1000,最高酶活达到314.67 U?mL-1。在含有kozak序列的前提下,具有glaA、ANL、cbhⅠ信号肽的补充内含子转化子比相应的不含内含子转化子脂肪酶发酵活力分别提高了1.64倍、1.94倍、3.61倍。酶学性质研究表明ANL最适pH为3.0,最适温度为45oC。（3）将CRISPR/cas9基因编辑技术在黑曲霉中应用,将CRISPR/cas9质粒通过原生质体转化法向黑曲霉转化并筛选转化子。sgRNA靶向pyrG基因,筛选转化子获得尿嘧啶缺陷型菌株（?pyrG）,通过测序确定突变位点,确定是位于sgRNA区域内,打靶效率约25%。sgRNA靶向hyg基因,尝试通过CRISPR靶向hyg基因进行破坏,但是未获得阳性转化子。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 立题依据

1.2 国内外研究进展

1.2.1 黑曲霉表达系统中的蛋白表达

1.2.2 黑曲霉中常用转化方法

1.2.3 黑曲霉中常用筛选标记

1.2.4 黑曲霉中提高表达量的方法

1.2.5 尿嘧啶营养缺陷型?pyrG菌株介绍

1.2.6 CRISPR技术在丝状真菌中应用简介

1.3 课题研究的主要目标和内容

1.3.1 课题研究思路

1.3.2 课题主要内容

1.3.3 课题来源

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 主要培养基与溶液

2.1.3 主要试剂与仪器

2.2 实验方法

2.2.1 农杆菌介导转化黑曲霉方法确立及条件优化

2.2.2 PEG-原生质体转化黑曲霉方法确立及条件优化

2.2.3 组成型及诱导型启动子脂肪酶（RCL、ANL）双元载体的构建

2.2.4 转化子鉴定、表达检测及脂肪酶酶活测定

2.2.5 黑曲霉中提高表达量改造质粒的构建

2.2.6 脂肪酶纯化、鉴定及酶学性质分析

2.2.7 尿嘧啶营养缺陷型黑曲霉菌株构建及回补质粒构建

2.2.8 hyg基因破坏转化子的构建及筛选

第三章结果与讨论

3.1 黑曲霉抗性敏感度检测及潮霉素筛选标记质粒的构建

3.1.1 黑曲霉抗性敏感度检测

3.1.2 潮霉素筛选质粒构建

3.2 农杆菌介导转化黑曲霉转化方法建立及条件优化

3.2.1 方法确立

3.2.2 条件优化

3.3 PEG-原生质体转化黑曲霉方法建立及条件优化

3.3.1 方法确立

3.3.2 条件优化

3.4 同源及异源脂肪酶在黑曲霉中的表达

3.4.1 华根霉脂肪酶RCL组成型及诱导型表达载体构建

3.4.2 黑曲霉脂肪酶ANL组成型及诱导型表达载体构建

3.4.3 转化子鉴定及脂肪酶表达初步检测

3.4.4 黑曲霉脂肪酶转化子ANL基因转录水平检测

3.5 黑曲霉脂肪酶ANL表达量的优化

3.5.1 ANL内含子的影响

3.5.2 kozak序列的影响

3.5.3 信号肽序列优化

3.5.4 发酵条件优化

3.6 黑曲霉脂肪酶ANL的表达鉴定、纯化及酶学性质研究

3.6.1 黑曲霉脂肪酶ANL分离纯化

3.6.2 黑曲霉脂肪酶ANL鉴定

3.6.3 酶学性质研究

3.7 不同黑曲霉转化子的脂肪酶表达活力比较

3.8 黑曲霉表达系统的基因操作工具构建

3.8.1 基于CRISPR/Cas9 技术进行尿嘧啶营养缺陷型黑曲霉菌株构建

3.8.2 基于CRISPR/Cas9 技术突变hyg抗性基因

主要结论与展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱思远

导师: 喻晓蔚

关键词: 黑曲霉,脂肪酶,提高表达量,酶学性质

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 江南大学

基金: 国家自然科学基金面上项目(31671799)

分类号: TS201.3

总页数: 69

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无抗黑曲霉表达系统构建及脂肪酶的表达

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