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非洲猪瘟病毒免疫抑制基因的筛选及RPA检测方法的初步建立

2020-12-08阅读(342)

非洲猪瘟病毒免疫抑制基因的筛选及RPA检测方法的初步建立

论文摘要

非洲猪瘟（Africa swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（Africa swine fever virus,ASFV）引起家猪和野猪的一种急性、热性和高传染性的疾病。自1921年首次发现非洲猪瘟疫情,该病已在全球数十个国家流行。2018年8月1日,我国辽宁省沈阳市首次报道ASF疫情,经基因进化树分析发现该毒株属于基因II型,与Georgia 2007/1毒株属于一个进化分支。当前疫情已在河南、江苏、浙江、安徽、黑龙江、内蒙古、吉林、天津、香港等32个省/直辖市/特别行政区蔓延流行,造成极大经济损失,我国生猪业也面临严峻考验。非洲猪瘟病毒基因组中约30%开放阅读框存在多个拷贝,即多基因家族（Multigene families,MGFs）。实验室前期研究表明,MGF360家族成员12L、13L、14L可能抑制IFN所介导的天然免疫应答,是基因缺失疫苗研制的主要靶标之一,因此针对抑制基因建立快速准确的检测方法非常重要。研究首先根据ASFV Georgia 2007/1分离株参考序列合成MGF360-12L、-13L、-14L基因,并克隆至pcDNA3.1真核载体,将重组质粒转染至PK15及293T细胞,通过荧光定量PCR检测基因对IFN-β（Interferon-β）表达的抑制作用,发现12L、13L的抑制作用较强。随后以pcDNA3.1-12L、-13L重组载体为模板,分别设计4组引物,选取特异性引物进行重组酶聚合酶（RPA）检测方法的初步建立。结果表明,所建立的12L基础RPA方法可在35℃、30 min时实现对目的片段的稳定扩增,而13L-RPA可在39℃恒温反应20 min完成扩增;该方法的敏感性可分别达到103和102个拷贝,同普通PCR方法检测限一致;此外,该RPA方法仅特异性扩增ASFV MGF360的12L或13L基因,对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组没有扩增。使用ASFV基因组为阳性样品进行扩增发现,将基因组稀释后,12L-RPA、13L-RPA仍能检测到目的基因的存在,表明该检测方法具有一定的临床价值。分别选择pGEX6p-1、pET-21a、pET-28a、pET-32a大肠杆菌原核表达载体进行免疫抑制蛋白12L和13L的表达。表达条件经优化后,表达产物均为包涵体形式,实验发现以pET-21a为载体表达的包涵体蛋白溶解效果最好,纯化后的蛋白浓度可达200-500μg/mL。综上,研究基于ASFV MGF360-12L、-13L基因序列,初步建立了RPA检测方法,可对病毒MGF360-12L、-13L基因实现快速、特异性扩增,为后续12L、13L基因缺失疫苗的鉴别诊断提供一定的技术支持。同时克隆表达并成功纯化12L、13L蛋白,为后续多克隆抗体的制备、间接ELISA检测方法的建立及相关蛋白的功能研究进行了前期储备。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 英文缩略表
  • 第一章 引言
  •   1.1 非洲猪瘟
  •     1.1.1 非洲猪瘟的流行与分布
  •     1.1.2 易感动物与传播途径
  •   1.2 非洲猪瘟病毒
  •     1.2.1 病毒形态结构及分类
  •     1.2.2 多基因家族
  •     1.2.3 病毒其他蛋白及其功能
  •     1.2.4 病毒培养特性及理化特性
  •   1.3 非洲猪瘟疫苗的研究进展
  •   1.4 非洲猪瘟的诊断方法
  •   1.5 重组酶聚合酶扩增技术（RPA）
  •     1.5.1 扩增原理
  •     1.5.2 几种常见核酸扩增方法的比较
  •     1.5.3 应用
  •   1.6 研究目的与意义
  • 第二章 ASFV MGF360 重要免疫抑制基因的筛选
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 菌株、载体和细胞
  •     2.1.2 主要试剂与耗材
  •     2.1.3 主要仪器与设备
  •     2.1.4 主要溶液配制
  •   2.2 方法
  •     2.2.1 ASFV MGF360-12L、-13L、-14L基因合成
  •     2.2.2 pcDNA3.1 重组质粒的构建与鉴定
  •     2.2.3 重组质粒转染细胞
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 12 L、13L、14L基因片段的扩增
  •     2.3.2 pcDNA3.1 重组质粒的鉴定
  •     2.3.3 293 T、PK15 细胞的培养
  •     2.3.4 STING、c GAS比例的优化
  •     2.3.5 免疫抑制基因MGF360-12L、-13L、-14L的筛选
  •   2.4 讨论
  • 第三章 ASFV MGF360-12L、-13L基因基础RPA检测方法的初步建立
  •   3.1 材料
  •     3.1.1 载体、病毒株和临床样品
  •     3.1.2 主要试剂与耗材
  •     3.1.3 主要仪器与设备
  •   3.2 方法
  •     3.2.1 标准质粒拷贝数的确定
  •     3.2.2 12 L、13L基因基础RPA、PCR及荧光定量PCR的引物设计
  •     3.2.3 基础RPA检测方法的建立及条件优化
  •     3.2.4 基础RPA检测方法的灵敏性实验
  •     3.2.5 RPA检测方法的特异性实验
  •     3.2.6 RPA检测方法的稳定性实验
  •     3.2.7 RPA检测方法初步临床应用
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 标准质粒拷贝数的计算
  •     3.3.2 RPA检测方法引物的筛选
  •     3.3.3 RPA检测方法反应条件的优化
  •     3.3.4 RPA检测方法灵敏性检测
  •     3.3.5 RPA检测方法特异性检测
  •     3.3.6 RPA检测方法稳定性试验
  •     3.3.7 RPA检测方法初步临床应用
  •   3.4 讨论
  • 第四章 ASFV MGF360 免疫抑制蛋白12L、13L的原核表达与纯化
  •   4.1 材料
  •     4.1.1 菌株与载体
  •     4.1.2 主要试剂与耗材
  •     4.1.3 主要仪器与设备
  •     4.1.4 主要溶液配制
  •   4.2 方法
  •     4.2.1 12 L、13L基因原核表达载体的构建
  •     4.2.2 12 L、13L蛋白的诱导表达
  •     4.2.3 重组蛋白的纯化
  •     4.2.4 重组蛋白的浓缩与内毒素去除
  •     4.2.5 重组蛋白的浓度测定
  •     4.2.6 纯化蛋白的鉴定
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 原核重组质粒的酶切鉴定
  •     4.3.2 重组蛋白的表达
  •     4.3.3 重组蛋白的纯化与鉴定
  •     4.3.4 重组蛋白浓度的测定
  •   4.4 讨论
  • 第五章 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 吴映彤

    导师: 朱鸿飞

    关键词: 非洲猪瘟病毒,基因,重组酶聚合酶扩增,原核表达

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    基金: 国家重点研发计划项目(项目编号:2017YFD0502302)

    分类号: S852.651

    总页数: 66

    文件大小: 3957K

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