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铁摄取调节子与亚铁鳌合酶基因表达对大肠杆菌血红素合成的调控

2020-12-09阅读(558)

铁摄取调节子与亚铁鳌合酶基因表达对大肠杆菌血红素合成的调控

论文摘要

血红素(heme)是一类中间螯合铁离子的卟啉化合物,参与细胞的氧气运输、电子传递等生物功能。增加其生物合成量可以提高以血红素为辅基的过氧化物酶的酶活力;血红素可作为色素添加剂和补铁剂被用于食品医药行业。因此,血红素合成在食品医药行业及以血红素为辅基的重组蛋白的生产中具有一定的应用价值,但目前血红素代谢调控的机制尚不清楚。本研究以大肠杆菌(Escherichia coli)为研究对象,以铁摄取调节子基因fur与亚铁鳌合酶基因hemH为调控目标,通过fur的过表达与缺失,以及hemH的过表达,探究铁离子以及fur和hemH表达水平对血红素合成代谢的影响。主要研究内容与结果如下:(1)fur过表达对大肠杆菌血红素合成的调控。通过构建含有fur过表达的同源重组菌株Eco/pEF,发现fur过表达对菌体的生长有抑制作用,同时胞内的铁离子减少,并且血红素含量比原始菌株下降了3.55倍,虽然fur过表达上调了gltX、hemL、hemB的表达,分别是原始菌株的4.93倍、2.55倍、4.61倍,但由于hemA下调使合成血红素的前体物质ALA速率低,导致血红素合成下降。在限铁条件下,fur对血红素的合成有一定的促进作用,血红素含量比原始菌株提高了2.22倍,fur使基因hemB、hemL、hemH的转录水平分别上调了5.59倍、2.60倍与2.40倍,促进了血红素的合成。(2)fur缺失对大肠杆菌血红素合成的调控。通过构建fur基因缺失菌株Eco△fur,发现fur缺失不影响菌体生长,但血红素含量比原始菌株下降了3.83倍,fur的缺失使hemL、hemE、hemH的表达分别下调了6.37倍、6.43倍、1.68倍,菌株中卟啉物质并没有明显的积累。在限铁条件下菌株的生长受到抑制,fur缺失后血红素的合成量进一步减少,hemL、hemE、hemH的表达水平分别下调了11.06倍、5.41倍、1.75倍,血红素前体物质原卟啉Ⅸ有所积累。(3)过表达hemH对大肠杆菌血红素合成的调控。通过构建过表达hemH的重组菌株Eco/pEH,发现血红素合成量并没有提高,限铁条件下血红素合成相对LB培养条件下提高了3.83倍。hemH的过表达使hemB与hemF分别下调了8.01倍和3.13倍;限铁条件下hemG的表达水平上调3.56倍。通过代谢组学分析,发现相关差异代谢物及差异途径的变化使血红素合成途径加强,从而使重组菌株Eco/pEH血红素含量在限铁条件下相对较高。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 血红素概述
  •     1.1.1 血红素结构特征及其应用
  •     1.1.2 血红素的生物合成途径
  •     1.1.3 铁在血红素合成中的作用
  •   1.2 铁摄取调节子Fur蛋白的调控功能及机制
  •     1.2.1 Fur蛋白作为转录因子的调控机制
  •     1.2.2 Fur蛋白参与铁的转运储存调控
  •     1.2.3 Fur蛋白与血红素之间的相互作用
  •   1.3 亚铁鳌合酶的生理功能及表达调控
  •   1.4 本课题的立题依据与主要研究内容
  •     1.4.1 立题依据与研究意义
  •     1.4.2 主要研究内容
  • 第二章 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 菌株与质粒
  •     2.1.2 主要试剂
  •     2.1.3 主要仪器设备
  •     2.1.4 培养基及缓冲液
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 铁摄取调节子基因过表达方法
  •     2.2.2 铁摄取调节子基因的敲除
  •     2.2.3 生长曲线的测定
  •     2.2.4 血红素浓度的检测
  •     2.2.5 5 -氨基乙酰丙酸浓度的检测
  •     2.2.6 卟啉物质的高效液相色谱检测
  •     2.2.7 ICP-MS法胞内铁含量的测定
  •     2.2.8 qRT-PCR实验及分析方法
  •     2.2.9 血红素关键酶基因过表达重组菌的差异代谢分析
  • 第三章 结果与讨论
  •   3.1 铁摄取调节子基因的过表达对血红素合成的影响
  •     3.1.1 铁摄取调节子基因过表达重组菌的构建
  •     3.1.2 铁摄取调节子基因过表达对重组菌生长及胞内铁离子浓度影响
  •     3.1.3 铁摄取调节子基因过表达对血红素合成及基因转录水平的影响
  •     3.1.4 小结
  •   3.2 铁摄取调节子基因缺失对血红素合成的影响
  •     3.2.1 铁摄取调节子基因的敲除
  •     3.2.2 铁摄取调节子基因缺失对菌体生长的影响
  •     3.2.3 铁摄取调节子基因缺失对血红素合成的影响
  •     3.2.4 铁摄取调节子基因缺失对血红素合成途径基因转录水平的影响
  •     3.2.5 小结
  •   3.3 过表达亚铁鳌合酶基因对血红素合成的调控
  •     3.3.1 过表达亚铁螯合酶基因重组菌蛋白检测
  •     3.3.2 过表达亚铁鳌合酶基因对血红素合成的影响
  •     3.3.3 血红素合成途径中关键基因的转录水平分析
  •     3.3.4 过表达亚铁鳌合酶基因重组菌的差异代谢分析
  •     3.3.5 小结
  • 主要结论与展望
  •   主要结论
  •   展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 附录 ：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李蒙蒙

    导师: 唐蕾

    关键词: 血红素,亚铁鳌合酶,铁离子,大肠杆菌

    来源: 江南大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 江南大学

    分类号: Q78

    总页数: 55

    文件大小: 3025K

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