林凡旭[1]2003年在《家蝇抗药性治理策略及其酶学性质的研究》文中提出家蝇(Musca domestica L．)属双翊目(Diptera)芒角亚目(Aristoccra)[一说环裂亚目(Aristocera)]蝇科(Muscidae)，是世界性卫生害虫，由于家蝇与人类接触密切及喜在室内活动的习性，成为人们研究和关注的对象。研究家蝇的抗药性防治策略，是制定防治对策的科学依据。 本研究着重研究了杀虫剂混配和加入增效剂对福州福建农林大学生防所相对敏感家蝇种群毒力的影响，对酶量、pH、反应时间、反应温度对家蝇的乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶的影响做了一些量化工作。结果表明： 1．用点滴法、药膜法、喷雾法这叁种毒力测定方法分别测定了几种杀虫剂对生防所家蝇种群的毒力，结果显示，生防所所养之家蝇种群为相对敏感种群。 用喷雾法测定了福州福建农林大学家蝇种群对高效氯氰菊酯的抗药性，发现福建农林大学家蝇种群的抗性倍数是5.26倍，对高效氯氰菊酯的抗药性程度属于低水平抗性。 以敏感种群家蝇成虫为试虫，以喷雾法研究了增效醚对高效氯氰菊酯的增效作用，PB对高效氯氰菊酯的增效作用属于相加作用。PB对高效氯氰菊酯的增效作用符合方程y=-0.0156x~2+0.1623x+1.2098(r=0.8862)，以PB和其它几种杀虫剂的比例为5：1时，对敏感家蝇种群成虫的毒力增效倍数为胺菊酯2.51倍、氯菊酯1.40倍、右旋反式丙烯菊酯0.50倍、右旋丙炔菊酯1.67倍、80％DDV乳油1.38倍，各杀虫剂与PB混配均表现为相加作用。 以敏感家蝇种群为试虫测定了胺菊酯和高效氯氰菊酯的联合毒力，其毒力增效倍数符合方程y=-0.0491x~2+0.3752x+0.0208(r=0.9211)。 2．羧酸酯酶在底物浓度不变的条件下，酶量在0～400ul范围内酶活力随酶量增加迅速上升酶活力上升，呈线性关系增长。 当酶量大于400ul后，随着酶量的增加酶活力上升变得平缓；乙酰胆碱酯酶在底物浓度不变的条件下，在12.5ul-1000ul范围内，随着乙酰胆碱酯酶酶量的增加，酶活力呈线性关系上升。 pH值变化对羧酸酯酶比活力的影响符合方程式：y=-1.6632x~2+22.897x-76.477(r=0.9754)；福建农林人学硕_卜学位论文家蝇抗药性治理策略及其酶学性质的研究第2奴 PH值变化对乙酞胆碱醋酶比活力的影响符合方程式:y=一0.0299x，+0.5958x一2，3656(r=0.9930)。 时间长度变化对梭酸酷酶比活力的影响符合方程式:y=一0.00!sx，+0.1226x+0.1871(r=0.9650); 时间长度变化对乙酞胆碱酣酶比活力的影响符合方程式:y=一0.001 lx2一卜0.0809x+0.1462(r=0.9797)。 温度变化对竣酸醋酶比活力的影响符合方程式:y=一0.oo62x2十0.4302x-4 .7425(r== 0.9962); 温度变化对乙酸胆碱酷酶比活力的影响符合方程式:y二一0.004】xZ一卜0.2886x·3.5946(r=0.9928)。 DDv对乙酞胆碱酷酶的Is0及‘随温度变化符合方程y二0.0 1 96x2-1 .ogssx+15.421(r=0.9505)及y=一o.ool6xZ+o.oss7x一0.905(r=0.919一)。
王东[2]2010年在《棉铃虫（Helicoverpa armigera）对多杀菌素的抗性机理及多杀菌素对其胁迫效应研究》文中提出棉铃虫Helicoverpa armigera (Hubner)是北方棉区重要害虫,即使Bt棉的广泛种植依然不能使我们忽视其重要的害虫地位。目前,棉铃虫已经对多种药剂产生抗性,也为该虫的防治带来重重困难。多杀菌素是由土壤放线菌。刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵后产生的胞内次级代谢产物。自1997年注册登记以来,如今已经在37个国家150多种作物上用于鳞翅目等害虫的防治。其独特的作用机理获得了广大用户的好评,也使之成为抗性治理策略中的潜力药剂。为了探讨棉铃虫对多杀菌素的抗性发展规律、抗性风险及抗性机理,我们筛选了抗多杀菌素的棉铃虫品系并进行了相关的研究。研究结果如下：1、抗多杀菌素棉铃虫品系的室内筛选及抗性风险评估以泰安田间种群为起始种群,用多杀菌素进行抗性选育。在筛选前期(1.7代),抗性发展缓慢,仅达到原来的3.4倍。从第9代开始抗性迅速增长,经过15代的筛选后,抗性达到24.1倍,属于中抗水平；经过多杀菌素筛选后,棉铃虫对毒死蜱、灭多威、氰戊菊酯、阿维菌素和虫螨腈的敏感性并没有显着变化(LD99水平),表明多杀菌素与所测定的五种药剂没有产生交互抗性；对多杀菌素抗性和敏感品系进行生物学研究发现,抗性品系种群存活率下降50%左右,种群发育时间延长4-5天,单雌产卵量仅为敏感品系的一半,净增殖率(Ro)和内禀增长率(‰)分别为敏感品系的25.35%和65%。本研究结果表明,棉铃虫对多杀菌素的抗性发展比较缓慢,但仍具有产生中等抗性的风险。交互抗性问题并不能显着影响多杀菌素对棉铃虫的防效,多杀菌素仍是治理抗性棉铃虫的合理有效的轮用药剂。多杀菌素在棉铃虫种群上会产生抗性代价,在多杀菌素缺失的情况下,这有利于抗性种群的敏感性恢复。因此,田间实行药剂轮用,间断性暂停多杀菌素的使用,对延缓多杀菌素抗性有着重要意义。2、棉铃虫对多杀菌素的抗性机理研究以多杀菌素抗性和敏感品系为研究对象,采用增效试验、酶学测定及基因分析方法,发现PBO和TPP都能够明显降低棉铃虫对多杀菌素的抗性,抗性比分别降低到原来的31.8%和68.0%,而增效剂DEM对抗多杀菌素试虫的抗药性没有显着影响；抗性试虫细胞色素P450氧脱甲基活性是敏感试虫的8.26倍,羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶分别为1.02和1.04倍；CYP6AEl4基因在抗性品系中过量表达,是相对敏感品系的7.73倍,其次是CYP9A12、CYP9A18、CYP6B2和CYP6B7基因在抗性品系中的表达量是敏感品系的2.45-3.53倍,CYP6AE12在两个品系中的表达量几乎一致,而CYP9A14和CYP6B6在抗性品系中的表达量降低,仅为敏感品系的0.87和0.70倍。这些结果表明细胞色素P450氧脱甲基酶的活性增强是棉铃虫对多杀菌素产生抗性的重要机制。进一步而言,CYP6AE14基因是多杀菌素抗性形成的关键基因,CYP9A12、CYP9A18、CYP6B2和CYP6B7也很可能是作为辅助因子推动抗性的发展。因此,在田间适当选用PBO作为增效剂可以提高多杀菌素对棉铃虫的毒力,延缓其抗性的发展。3、多杀菌素对棉铃虫生长发育及其解毒酶活性的影响通过测定棉铃虫在多杀菌素作用下的生物学特征、解毒酶活性及解毒酶基因转录方面的变化,从而更好地理解抗性代价的形成、抗性发生的原因和发展特性。研究发现,试验浓度下的多杀菌素对棉铃虫不仅仅具有致死效应(增加幼虫死亡率；降低化蛹率、羽化率及孵化率)还具有亚致死效应(降低虫重、蛹重；延长幼虫期、预蛹期、蛹期；缩短成虫期；降低单雌产卵量),通过这些影响来改变棉铃虫种群密度及发展动态。在试验浓度下,多杀菌素能够明显诱导棉铃虫P450氧脱甲基酶活性增强,这种诱导效应与浓度呈正相关。在处理48 h后,多杀菌素最高可以诱导P450氧脱甲基酶比活力达到原来的5.8倍。然而,在相同的浓度下,多杀菌素对羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶的比活力都没有明显的影响。通过接触试验发现,多杀菌素可以显着诱导CYP6AE14的表达,处理组是对照组的4.15倍。其次是CYP6B2、CYP6B7、CYP9A12和CYP9A18基因,也分别被诱导3.32、2.79、2.6和2.07倍。CYP9A14和CYP6B6基因没有被诱导增加,反而被抑制。以上结果都表明,单次诱导和多次筛选后对种群生物学特性、酶学特性及基因表达的影响趋势是一致的,存在着一定的关系,这说明诱导在抗性形成的过程中起到一定的作用,是抗性形成的一种方式。从量上来看,多次筛选后的改变并不是单次诱导简单的相加,在失去药剂的情况下,这种诱导效应很可能会恢复到正常水平,这也证实了棉铃虫对多杀菌素的抗性发展缓慢的原因。4、次生物质与多杀菌素联合作用在试验浓度下,与次生物质(棉酚、单宁、槲皮素)或Bt没有显着改变多杀菌素对棉铃虫生物学特性的影响(如降低化蛹率、蛹重；延长幼虫期、蛹期；降低繁殖力)。这些结果表明,寄主植物中次生物质和Bt对多杀菌素亚致死效应的影响不大。从生物学的角度来看,次生物质对多杀菌素的影响可以忽略,但这并不代表田间使用时我们可以忽略次生物质。许多研究表明,次生物质可以通过改变昆虫体内的某些机理进而影响杀虫剂的防治效果。
陈志永[3]2007年在《桔全爪螨Panonychus citri （McGregor）对辛硫磷的抗性及AChE cDNA片段克隆》文中指出本研究以桔全爪螨为对象，综合运用农药生物测定、抗性选育、生化分析、分子生物学等技术，在室内对其进行辛硫磷抗性选育的基础上，对产生抗性的品系进行抗药性生理生化机制研究，旨在延长有机磷类杀螨剂的使用时间，为该螨抗药性的治理提供有效的策略。此外，利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术对桔全爪螨AChE cDNA片段进行扩增，并克隆测序，为获取桔全爪螨AChE基因全序列进而研究其变构AChE介导抗性的分子机制奠定基础。经过近两年的研究工作，获得了以下主要研究结果：1桔全爪螨对辛硫磷的抗性选育室内对桔全爪螨进行辛硫磷的抗性选育。随着抗性选育代数的增加，抗性指数逐渐增高。选育到第14代(F_(14))，抗性指数达18.6倍。抗性选育过程中LD-p回归方程的斜率有变小的趋势，表明桔全爪螨群体中抗性个体不稳定，群体发生了异质性变化，抗性有进一步增强的潜力。2桔全爪螨辛硫磷抗性机理研究2．1桔全爪螨辛硫磷抗性与乙酰胆碱酯酶(AChE)的关系采用酶标仪技术对桔全爪螨辛硫磷敏感和抗性品系体内的AChE活性进行了测定，结果显示抗性品系和敏感品系体内的AChE比活力分别为4.3435和1.1399μmol／μg·mg／pro，差异达显着水平。而且抗性品系的Km值显着增大，Vm显着减小，表明该酶发生了质变，导致酶和底物的结合能力显着降低，桔全爪螨对辛硫磷存在着明显的靶标抗性。离体抑制作用测定结果表明，随着辛硫磷浓度升高，辛硫磷对桔全爪螨敏感和抗性品系AChE活性的抑制作用愈加明显，且对酶活性的抑制率与药剂浓度间存在明显的线性关系。2．2桔全爪螨辛硫磷抗性与羧酸酯酶(CarE)的关系对桔全爪螨辛硫磷敏感和抗性品系体内的CarE活性测定结果表明，敏感品系和抗性品系的CarE比活力分别为1.1399和4.3435μmol／μg·mg／pro，差异达显着水平。抗性品系的Km显着的高于抗性品系，说明该品系CarE对底物的亲和力下降。离体抑制作用测定结果表明，随着辛硫磷的浓度升高，辛硫磷对敏感品系和抗性品系体内CarE的抑制率均增加，且对敏感品系的抑制作用比抗性品系显。表明CarE活性的增强是桔全爪螨对辛硫磷产生抗药性的因素之一。2．3桔全爪螨对辛硫磷抗性与磷酸酯酶的关系对桔全爪螨辛硫磷敏感和抗性品系体内磷酸酯酶活性的测定结果表明，抗性品系和敏感品系酸性磷酸酯酶比活力分别为3.85105和5.5680μmol／mg·pro／30min，差异达显着水平；碱性磷酸酯酶的活性分别为3.0145和3.0968μmol／mg·pro／30min，差异不显着。表明桔全爪螨对辛硫磷抗性的形成与酸性磷酸酯酶活性增强有关，而与碱性磷酸酯酶的关联不大。2．4桔全爪螨对辛硫磷抗性与叁种保护酶的关系对桔全爪螨辛硫磷敏感和抗性品系体内叁种保护酶进行了比较。抗性品系和敏感品系体内超氧化物歧化酶SOD的比活力分别为0.1714和0.0810μnit／10mite／15min；过氧化酶POD的比活力分别为1.1367和0.8517mmol H_2O_2／mg．pro／min。抗性品系体内的SOD和POD比活力均显着高于敏感品系；抗性品系和敏感品系体内过氧化氢酶CAT的比活力分别为0.3098和0.3104μnit／mg．pro／min，差异不显着。说明桔全爪螨对辛硫磷的抗性与SOD和POD相关，而与CAT关联不大。2．5桔全爪螨对辛硫磷抗性与谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)的关系对桔全爪螨辛硫磷敏感和抗性品系体内GSTs活性的测定结果表明，抗性品系和敏感品系体内GSTs的比活力分别为0.5570和0.3751μmol／min·mg／pro，差异达显着水平。以GSH为底物，抗性品系K_m值显着大于敏感品系，而以CDNB为底物时抗性品系K_m值显着小于敏感品系。说明与敏感品系相比抗性品系对底物GSH的亲和力减弱，而对CDNB的亲和力增强。表明GSTs与桔全爪螨对辛硫磷的抗性有一定的相关性。2．6桔全爪螨对辛硫磷抗性与多功能氧化酶(MFO)的关系比较桔全爪螨辛硫磷敏感和抗性品系体内MFO的酶学特性及辛硫磷和增效醚(PBO)对该酶的抑制作用，结果表明，抗性品系和敏感品系体内MFO的比活力分别为17.82和4.324(30min·mgpro)，差异达显着水平。抗性品系的K_m显着高于敏感品系。辛硫磷对敏感品系MFO的抑制效果显着强于抗性品系，且MFO活性抑制率与药剂抑制浓度之间呈显着的线性关系。以PBO作用于桔全爪螨，敏感品系和抗性品系MFO的活力均受到抑制，但对抗性品系的抑制效果强于敏感品系。说明桔全爪螨对辛硫磷的抗性形成与MFO活力的增强相关。3桔全爪螨乙酰胆碱酯酶的cDNA片段的克隆采用RT-PCR技术克隆获得了桔全爪螨AChE的1个151bp的片段，推导的氨基酸序列为：EMWNPNTNISEDCLYLNIWVPQRLRIRHHGDKPPQERPKVPVLVWIYGGG。同源性比较结果表明该序列与其他生物AChE相应氨基酸序列的同源性较高，而且该序列还含有AChE多个保守的特征性序列，说明该片段编码桔全爪螨AChE的部分氨基酸序列。
李飞[4]2003年在《棉蚜的杀虫剂神经靶标分子生物学研究》文中研究说明由于神经系统在维持生命中的特殊功能，人类以神经系统为作用靶标，开发了大量的速效性杀虫剂。当前广泛应用的有机磷类、氨基甲酸酯类、沙蚕毒素、新型烟碱类和拟除虫菊酯类杀虫剂，均以昆虫神经系统内的乙酰胆碱酯酶(AChE)、乙酰胆碱受体(AChR)和钠离子通道为作用靶标。因此，开展杀虫剂神经靶标的分子生物学研究，深入了解杀虫剂毒理，明确抗药性形成的分子机制，对开展抗性的分子检测、抗性治理以及开发新型高选择性杀虫剂都具有十分重要的意义。 棉蚜(Aphis gossypii Glover)是世界性分布的重大农业害虫，由于其生殖周期短、繁殖量大，一旦条件适宜，在短期内便能爆发危害。因此，对于棉蚜的防治，其它农业防治技术和生物防治技术较难奏效，生产上主要依赖于化学防治。这种对农药的依赖性，不仅使棉蚜成为抗药性发生最严重的农业害虫之一，同时，其抗药性的发展也直接威胁到能否进行可持续控制的问题。为了更深入地了解棉蚜抗药性形成的分子机制，更好地开展棉蚜抗性的检测和治理，弄清棉蚜神经靶标的分子结构以及与非靶标生物的进化差异，为开发新型高选择性杀虫剂和负交互抗性杀虫剂，保证棉蚜的可持续控制，本文对其神经系统靶标进行了较为系统的研究。 1 棉蚜标准试虫饲养方法及不同寄主对棉蚜影响的研究 本研究首先根据棉蚜的生活习性摸索出一种新的棉蚜饲养新方法——笼罩法，并就不同寄主对棉蚜的影响进行了研究。结果发现，棉花、木槿和南瓜等寄主作物对棉蚜AChE和羧酸酯酶均有不同程度的影响，其中取食棉花的棉蚜AChE对乙酰胆碱亲和能力最大，取食木槿的羧酸酯酶活力最高。对有机磷类农药的敏感性也随之发生了变化，其中以取食木槿上的棉蚜敏感性下降最为显着。在此基础上，本研究建立了棉蚜的笼罩棉苗饲养法。该方法省时省力，不仅能减少试虫饲养的工作量，还能保证试虫的质量和可比性，能够满足室内不间断地隔离饲养多个棉蚜品系的要求，为进行长期研究并获得可靠资料奠定了基础。 2 棉蚜品系的建立及有机磷抗性与AChE不敏感性关系的确定 引进英国洛桑试验站171B棉蚜品系为敏感品系，采集中国北京、安阳、莱阳、南京和泰安等不同地区的棉蚜，分离5个抗性水平不同的抗性品系。利用浸叶法生物测定结果表明，不同地区品系对杀虫剂的抗性依次为：安阳＞北京＞南京、莱阳＞泰安。进一步的生化研究表明，安阳和北京品系棉蚜AchE对杀虫剂的敏感性显着下降(I_(50)棉蚜的杀虫剂神经靶标分子生物学研究增加50多倍)，莱阳品系次之，南京和泰安品系接近于敏感品系.安阳和北京品系AChE的蛛值显着下降，表明酶发生了质的变化。不同地区杭性品系的醋酶(全醋酶和菠酸醋酶)活性均显着升高.其中安阳品系拨酸醋酶几值达2460.4 p mol·L一，，而北京品系仅为84.4 p Iuol·L一，，显示该2品系欺酸醋酶发生了质的变化。分析认为，低杭水平的泰安品系以代谢杭性为主，靶标杭性为辅;中杭水平的南京和莱阳品系，，.是由于解毒代谢酶的活性增强，抑或由于靶标的敏感性下降所致;而高杭水平的安押和北京品系，是由代谢杭性和靶标杭性共同作用导致的.3 AchE的分子生物学研究3.1蛋白纯化 利用普普卡因胺亲和层析法建立了棉蚜AChE分离纯化技术，分离纯化了棉蚜敏感品系和杭性品系的AChE，其纯化倍数分别为35，100和33，680倍，回收率分别为30.3%和”.8呱.纯化后AChE在非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳(P AGB)中呈现3条带型，在变性聚丙烯疏胺凝胶电泳(SDS一P人GE)中为1条带，表明纯化后AChE已达电泳级纯度.以甲胺磷和杭蚜威分别对粗酶和纯化酶作抑制性试验，敏感品系粗酶的几。甲胺磷为0.6491 Iuluol·L一，、杭蚜威为1.203 Inlnol·L一，;纯化酶Is。甲胺磷为0.5471Inmol·L一，、杭蚜威为0.8613 nuuol·L一‘;粗酶/纯酶的差异分别为1.19和1.40倍。抗性品系粗酶的几。甲胺磷为2似.叫mmol .L--l、抗蚜威为28.26mm。1·L一，;纯忆酶Is0甲胺磷为34.22 mlnol·L一，、抗蚜威为2.41 nunol·L一‘;粗酶/纯酶的差异分别达到6.43和n.73倍.结果表明，纯化后棉蚜AChE的敏感性显着升高，其中杭性品系棉蚜AChE的敏感性上升幅度明显高于敏感品系。作者分析认为，粗酶体系中非AChE成分的存在对人。有显着影响，而杭性品系的这种影响更为显着.3.2 AChE基因克隆 采用RT一PCR技术和RACE策略，从棉蚜中克隆出2个ace基因。a oel基因全长为2，371 bp，开放阅读框为2，031 bp，编码676个氨基酸(GeneBank登录号:AF502082);aeeZ基因全长序歹，l为2，1 30 bp，开放阅读框为1，995 bp，编码664个氨基翻CeneBank登录号:AF502081)。acel和aceZ基因所编码的氨基酸序列之间的相似性仅达48%，但acel基因与已克隆的麦二叉蚜ace基因(AF321574)之间的相似性达95先 .aceZ基因与已报道的桃蚜ace(AF287”1)之间的相似性达92%.序列分析表明，滋el和aceZ基因具有AChE家族所有的保守性特征。此外，还发现了棉蚜ace基因5’端的选择性剪接现象. 尽管在AChE毒理学研究中，研究者一直怀疑昆虫中有不同的AChE存在，但始终没
豆威[5]2009年在《书虱谷胱甘肽S-转移酶的纯化及生化毒理学特性研究》文中进行了进一步梳理书虱隶属于啮目Psocoptera、书虱科Liposcelididae、书虱属Liposcelis,是储藏物中常见的害虫。书虱属昆虫在世界各地广为分布,目前已知种类123种,我国共记载有27种。作为储粮生态中的害虫优势种群,嗜卷书虱Liposcelis bostrychophila Badonnel和嗜虫书虱L.entomophila(Enderlein)经常混合发生,造成严重的经济损失,而且对化学药剂的抗性发展很快,已经引起了全世界储藏物工作者的高度重视。蛋白质分离和纯化是进行蛋白质结构和功能研究的基础。采用蛋白质纯化的方法分离参与抗药性产生的酶,明确其生物化学特性及其与抗药性的关系,对于害虫抗药性治理具有重要的意义。谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases,GSTs,EC 2.5.1.18)是一类多功能的超基因家族酶,广泛分布于哺乳动物、昆虫、植物以及微生物等生物体内。这类酶能催化内源还原性谷胱甘肽(GSH)与各种有害的亲电性底物相结合,增加后者的可溶性从而有利于其从细胞内排出,进而保护生物体内的核酸和蛋白质免受亲电基团攻击。同时,它也参与激素的胞内运输、合成,清除外源化合物所产生的有害的氧自由基以及保护细胞免遭氧化压力胁迫。本学位论文在教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-04-0854)和教育部高等学校博士点专项基金(200806350009)的资助下,利用亲和层析法对嗜卷书虱和嗜虫书虱的GSTs进行分离纯化的基础上,对纯化产物的生化毒理学特性进行了较为全面的解析,研究结果为揭示GSTs介导的书虱适应环境胁迫的机理提供了生化毒理学依据,同时丰富和发展了储藏物害虫抗性机理研究的科学理论体系。主要研究结果总结如下:1嗜卷书虱不同品系GSTs的纯化及生化毒理学特性解析采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法纯化了嗜卷书虱3个品系(SS,敏感品系;DDVP-R,敌敌畏抗性品系;PH_3-R,磷化氢抗性品系)的GSTs,纯化产物达电泳级纯度。经SDS-PAGE电泳检测,纯化后GSTs的蛋白分子量约为23 kDa。利用Edman降解法对纯化产物N端前15个氨基酸测序获得的短肽为:APKYKYL TYPFNSILTGLGL,该序列与Sigma类昆虫GSTs N端氨基酸序列高度一致,表明纯化获得的GSTs属于昆虫Sigma类。嗜卷书虱3个品系GSTs的纯化倍数在62-91倍之间,回收率介于27-41%。利用微量滴度酶标板法对纯化后的GSTs的生化特性分析表明,与SS品系相比,DDVP-R和PH_3-R品系的GSTs活性显着提高(P＜0.05),而两抗性品系间相比较差异未达显着水平(P＞0.05)。进一步的动力学比较研究发现,以CDNB为底物时,DDVP-R品系的K_m值最高;而以GSH为底物时,两抗性品系K_m值较低,说明DDVP和PH_3的胁迫选择造成GSTs对内源性化合物GSH获得了较高的亲和能力;对V_(max)而言,两抗性品系的V_(max)值均高于敏感品系,说明其催化能力提高。嗜卷书虱3个品系GSTs活力随pH值变化的趋势大体相同,其中SS品系GSTs的最适pH范围较广,介于pH7.0-pH8.0之间,而两抗性品系的最适范围介于pH 7.0-pH 7.5之间。酶促反应最适温度研究发现,SS和PH_3-R品系在35℃时GSTs活力最高,而DDVP-R品系则在40℃时GSTs的活力最高。杀虫剂对嗜卷书虱3个品系GSTs的离体作用研究表明,供试的杀虫剂中丁硫克百威对嗜卷书虱3个品系的GSTs的抑制作用明显,3品系间相比较PH_3-R品系GSTs对丁硫克百威的抑制作用敏感度低,抑制中浓度I_(50)分别为SS和DDVP-R品系的3.9和4.7倍。毒死蜱和高效氯氰菊酯对嗜卷书虱的GSTs仅有部分的抑制作用,毒死蜱在低浓度时还表现为一定的激活作用。利尿酸、姜黄素和四溴磺酚钠对嗜卷书虱纯化后的GSTs均有显着的离体抑制作用。其中,姜黄素的抑制作用最强,其I_(50)达纳摩尔数量级。综合分析,SS品系与两抗性品系相比对上述抑制剂更为敏感,两抗性品系GSTs对各抑制剂的敏感性存在一定的差异。2嗜卷书虱不同发育阶段GSTs的纯化及生化毒理学特性解析采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法纯化了嗜卷书虱3个发育阶段(1-2龄低龄若虫、3-4龄高龄若虫和成虫)的GSTs。结果表明,低龄若虫GSTs的纯化倍数最高,达102倍,但回收率仅为28%;高龄若虫GSTs的纯化倍数最低,仅为63倍,但回收率高达61%;成虫GSTs的纯化倍数介于低龄和高龄若虫之间,其GSTs的比活力最高,且显着高于低龄若虫(P＜0.05)。以GSH和CDNB为底物的动力学特性分析发现,低龄若虫GSTs的K_m值最低,而成虫GSTs对两底物均表现最高的催化反应速度V_(max),表明成虫期GSTs对底物的催化能力显着高于若虫期。毒死蜱对嗜卷书虱不发育阶段GSTs纯化后的离体作用结果表明,该药剂对GSTs有一定的抑制作用,但在低浓度时表现为一定的激活作用,随着浓度的升高,抑制作用逐渐显现。在测试的5个浓度下,毒死蜱对GSTs的最高抑制率仅为39%。5种典型化合物(利尿酸、姜黄素、双硫仑、马来酸二乙酯和四溴磺酚钠)对嗜卷书虱各发育阶段GSTs均有显着的离体抑制作用,其中GSTs对双硫仑的耐受性最强,该抑制剂的离体I_(50)达毫摩尔数量级。综合分析发现,除高龄若虫对利尿酸最不敏感外,嗜卷书虱成虫对其它抑制剂均表现为最不敏感。此外,研究了金属离子(Zn~(2+)、Hg~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)和Ca~(2+))对嗜卷书虱GSTs活性的影响。结果表明,5种金属离子对嗜卷书虱GSTs均有显着的抑制作用。嗜卷书虱各发育阶段的GSTs对Ca~(2+)最不敏感,I_(50)达纳摩尔数量级;Hg~(2+)对嗜卷书虱GSTs的离体抑制作用最为显着,但各虫态间I_(50)值无显着性差异(P＞0.05)。3嗜卷书虱不同地理种群GSTs的纯化及生化毒理学特性解析采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法纯化了嗜卷书虱3个地理种群(四川广汉、四川简阳和实验室保存种群)的GSTs。结果表明,经亲和层析后,实验室种群GSTs的纯化倍数高达121倍,回收率亦最高,达52%;四川广汉种群纯化倍数和回收率分别为58和33%;简阳种群的纯化倍数最低,仅为40倍,回收率仅为16%。总蛋白和活力测定结果显示,实验室种群GSTs纯化产物的总蛋白含量和酶活力显着高于其余两个种群(P＜0.05),但其它种群之间各参数均无显着性差异(P＞0.05)。分别以CDNB和GSH为底物,利用双倒数作图法获得了嗜卷书虱3个种群GSTs纯化后的动力学参数。比较分析K_m值发现,实验室种群对2种底物的亲和力最低,简阳种群对底物GSH的亲和力最高,而广汉种群对底物CDNB的亲和力最高;就V_(max)而言,实验室种群对底物GSH和CDNB均表现出最高的催化活性,且显着高于简阳种群与广汉种群(P＜0.05)。杀虫剂的离体抑制作用测定结果表明,广汉种群对丁硫克百威最为敏感,简阳种群其次,实验室种群对该药剂的离体抑制作用最不敏感。高效氯氰菊酯对嗜卷书虱不同种群纯化后的GSTs有部分的抑制作用,且各种群受到的离体作用类似。利尿酸、姜黄素、马来酸二乙酯和四溴磺酚钠对嗜卷书虱3个种群均表现为显着的抑制作用,其中广汉种群GSTs对各种抑制剂的作用最为敏感。各金属离子对嗜卷书虱3个种群的作用结果显示,GSTs对Ca~(2+)最不敏感,其中实验室种群与其它两种群相比更不敏感,其I_(50)值最高;Hg~(2+)对GSTs离体抑制作用最为强烈,各种群间I_(50)值无显着性差异(P＞0.05);Mn~(2+)和Ca~(2+)对各种群GSTs的离体作用较为相似,其中广汉种群对这2种金属离子的抑制作用最为敏感,而实验室种群最不敏感。4嗜虫书虱不同地理种群GSTs的纯化及生化毒理学特性解析采用Glutathionc Sepharose 4B亲和层析法纯化了嗜虫书虱4个地理种群(河南开封、四川广汉、重庆北碚和湖北武汉)的GSTs。结果表明,嗜虫书虱河南开封种群GSTs的纯化倍数最高,达162倍,但回收率较低,仅为29%;四川广汉种群GSTs的纯化倍数最低,仅57倍,回收率为43%;重庆北碚种群GSTs的回收率最高,达47%,纯化倍数达93倍;湖北武汉种群GSTs的回收率最低,仅为25%。应用微量滴度酶标板法的生化特性分析结果表明,河南开封种群与武汉种群GSTs对底物具有较高的催化活性,且两者之间无显着性差异(P＞0.05),但河南开封种群的GSTs对两底物表现最低的亲和力。嗜虫书虱不同种群GSTs的最适pH研究发现,四川广汉种群的最适范围介于pH 6.5-pH 7.0之间,而其它3个种群的最适范围介于pH 7-pH 7.5之间。酶促反应最适温度研究发现,重庆北碚种群在40℃时GSTs活力最高,而其它3个种群则在35℃时GSTs的活力最高。利尿酸、姜黄素、马来酸二乙酯和四溴磺酚钠对嗜虫书虱4个种群GSTs均有显着的离体抑制作用。综合分析发现,河南开封种群对各种抑制剂的作用最不敏感,四川广汉种群对利尿酸和马来酸二乙酯最为敏感,而重庆北碚种群对姜黄素和四溴磺酚钠最为敏感。
蒋红波[6]2010年在《嗜卷书虱P450基因的分子生物学特性及其异源表达研究》文中认为书虱(psocids)属于虱啮目Psopotera、书虱科Liposcelididae、书虱属Liposcelis,是一类重要的储藏物害虫,大量发生时可造成严重的经济损失,且对化学药剂的抗性发展很快,已经引起了全世界储藏物工作者的高度重视。然而与其它农业害虫相比,以往对该类害虫包括其它储藏物害虫的研究主要集中在应用研究层面,较少涉及基础或应用基础研究领域。昆虫细胞色素P450是昆虫体内一种重要的代谢酶,在昆虫的生命活动中具有重要的生理功能。其中细胞色素P450对杀虫剂的代谢作用增强是大多数昆虫产生抗药性的主要机制之一,这一机制也常被认为是最为重要的一个抗性机制,而且由于其催化底物的多样性,细胞色素P450极有可能介导昆虫的交互抗性。本学位论文在国家自然科学基金(30871631)、教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-04-0854)以及西南大学研究生创新基金优秀博士生项目(kb2008001)的资助下,以目前世界范围内危害严重的嗜卷书虱Liposcelis bostrychophila Badonnel为对象,瞄准昆虫P450功能研究的这一热点问题,率先开展了嗜卷书虱P450基因分子生物学特性及异源表达方面的研究,旨在认识嗜卷书虱细胞色素P450的生理功能、了解P450与书虱抗性形成与发展的相互关系、鉴定书虱抗性相关P450基因以及揭示其介导书虱抗药性的分子机制。通过近4年的研究,取得了如下研究结果：1嗜卷书虱Housekeeping基因的克隆及内参基因的筛选1.1 Housekeeping基因的克隆及序列分析结合反转录PCR(reverse transcriptase-PCR,RT-PCR)与cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)等技术,首次成功地从嗜卷书虱体内分离克隆获得了4个不同的Housekeeping基因Lbp-Actin1、Lbβ-Actin2、Lba-Tubulin及LbGapdh的cDNA全序列,GenBank登录号分别为FJ196622、FJ447483、FJ595242及FJ595241.通过序列分析,明确了4个Housekeeping基因的开放阅读框,并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用Protparam、Scanprosite、PSORT、TMHMM、SignalP 3.0以及ProtFun等生物信息学软件分析了上述Housekeeping基因编码蛋白质的理化性质、保守基序、细胞内的定位、跨膜结构、信号肽序列以及潜在的生理功能。使用Mega 4.01软件应用Neighbor Joining方法构建了其相应的系统发育树并明确了与其它物种相应Housekeeping基因的遗传距离。此外,应用蛋白质叁维结构同源模拟工具SWISS-MODEL,成功地构建了各自的叁维结构模型。研究结果丰富了嗜卷书虱的遗传信息,并且为将来深入探讨啮目昆虫的进化关系提供了可能的分子标记。1.2内参基因的筛选研究表明,在实时定量PCR(qPCR)中选用不同的内参基因可能会对基因表达转录分析的结果产生重要影响。然而在昆虫学的相关研究中,内参基因筛选这个重要的问题却常被忽视。本研究在成功建立嗜卷书虱5个候选内参基因(Lbβ-Actin1、Lbβ-Actin2、Lba-Tubulin、LbGapdh及18S rRNA)qPCR反应体系的基础上,利用NormFinder和geNorm分析软件综合评估了这5个候选内参基因在嗜卷书虱不同发育阶段、不同品系以及溴氰菊酯诱导条件下mRNA表达的稳定性,筛选出了适用于不同试验条件的嗜卷书虱基因表达转录分析的内参基因Lbp-Actin1。进一步利用绝对定量方法分析了嗜卷书虱经药剂诱导其体内Lbβ-Actin1 mRNA表达量的时间动态(8、12、24、36及48 h),验证了其作为嗜卷书虱基因表达转录分析中内参基因的稳定性。同时以最稳定的Lbβ-Actinl及最不稳定的18S rRNA分别作为内参对嗜卷书虱CYP6CE2在不同发育阶段、药剂诱导前后的相对表达量进行比较分析,结果发现无论是在不同的发育阶段,还是在药剂诱导的情况下以18S rRNA作为内参时CYP6CE2的表达模式均与以Lbp-Actin1作为内参基因时的表达模式差异极大,进一步证实了前人关于核糖体基因不适宜用作内参基因的推测,充分证明了基因表达转录分析中内参基因的选用对定量分析的结果具有重要的影响。2嗜卷书虱P450基因的克隆及其表达模式解析2.1 P450基因的克隆及序列分析结合RT-PCR与RACE等技术,首次成功地从嗜卷书虱体内分离克隆了5个全新的P450基因CYP6CE、CYP6CE2、CYP4CB1、CYP4CC1及CYP4CD1的cDNA全序列,GenBank登录号分别为EF421245、EF421246、EU979550、EU979549和EU979551。通过序列分析明确了上述5个P450基因的开放阅读框,并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用Protparam、Scanprosite、PSORT、TMHMM、SignalP3.0以及ProtFun等生物信息学软件分析了推导蛋白质的理化性质、保守基序、细胞内的定位、跨膜结构、信号肽序列以及潜在的生理功能。序列分析结果表明克隆获得的5个细胞色素P450基因均为细胞微粒体型P450,极有可能在嗜卷书虱体内参与外源化合物的代谢。在GenBank中选取了近40条已发布且功能己知的P450基因(主要为第四家族和第六家族成员)编码的氨基酸序列,使用Mega 4.01软件应用Neighbor Joining方法构建了系统发育树并明确了与其它物种P450基因的遗传距离。结果表明CYP6CE1、CYP6CE2与多个抗性相关的CYP6家族成员具有较高的同源性,据此推测CYP6CE1、CYP6CE2可能参与嗜卷书虱抗药性的形成。此外,应用蛋白质叁维结构同源模拟工具SWISS-MODEL成功地构建了CYP6CE1及CYP6CE2的叁维结构模型。然而,由于在蛋白质晶体结构数据库中还未有与CYP4CB1、CYP4CC1及CYP4CD1同源性达到20%以上的蛋白,因此无法对嗜卷书虱这3个细胞色素P450蛋白的叁维结构进行模拟。2.2 P450在不同发育阶段的表达模式利用嗜卷书虱在27.5℃的条件下完成各个不同发育阶段所需要不同时间的这一生物学特性,通过时间上的控制,获得了处于不同发育阶段(卵、一龄、二龄、叁龄、四龄若虫以及成虫)的书虱用于总RNA的提取。进而通过制作标准曲线、计算引物的扩增效率以及分析扩增产物的熔解曲线,成功建立了嗜卷书虱CYP6CE1、CYP6CE2、CYP4CB1、CYP4CC1和CYP4CD1等5个P450基因的qPCR反应体系。以Lbp-Actin1基因作为内参,对5个P450基因在嗜卷书虱不同发育阶段的mRNA表达水平进行了相对定量分析。结果表明,嗜卷书虱3个CYP4家族的P450基因均在成虫期表达量最高。其中,CYP4CB1在嗜卷书虱二龄若虫体内的相对表达量显着低于其它龄期,在成虫期表达量最高,其余4个龄期内的表达均无显着差异。CYP4CC1的相对表达量在成虫体内最高,在卵和二龄若虫中较低。其中成虫期表达量约为卵期的7倍,二龄若虫期表达量约为卵期的0.5倍,而其余3个龄期的相对表达量波动幅度不大均在2左右。CYP4CD1在卵期的表达量最低,成虫期的表达量约为卵期的7倍,其余各龄期间的相对表达量近乎恒定,维持在卵期表达量的2倍左右,且无显着差异。2.3 P450在药剂诱导后的表达模式在生物测定明确了嗜卷书虱对溴氰菊酯、甲基对氧磷和涕灭威毒力的基础上,建立了两种不同的诱导体系：即低剂量(LC10)长时间持续诱导和较高剂量(LC50)短时间诱导体系。利用qPCR技术,以Lbβ-Actin1为内参基因,分析了嗜卷书虱5个P450基因在低剂量(LC10)溴氰菊酯诱导前后其mRNA表达量的变化,明确了嗜卷书虱5个P450基因分别对低剂量溴氰菊酯的诱导反应。结果表明,低剂量(LC10)溴氰菊酯诱导可显着提高嗜卷书虱体内CYP6CE1、CYP6CE2、CYP4CB1、CYP4CC1基因的相对表达量。其中,CYP6CE1表达量上升最高大约为对照组的2.8倍；CYP6CE2、CYP4CB1、CYP4CC1相对表达量上升了2倍左右；然而,CYP4CD1的相对表达量经低剂量溴氰菊酯诱导后却显着地下降。此外,利用较高剂量(LC50)的溴氰菊酯、甲基对氧磷、涕灭威处理嗜卷书虱30 min后,采用qPCR技术分析了上述P450基因经药剂诱导后其mRNA表达的时间动态(8、12、24、36及48 h)。qPCR结果表明CYP6CE1、CYP6CE2、CYP4CB1及CYP4CC1可被溴氰菊酯、甲基对氧磷显着的诱导。其中,溴氰菊酯诱导后36 h CYP6CE1、CYP6CE2、CYP4CB1及CYP4CC1的相对表达量达到最高分别为对照的2.l、1.5、3.0以及1.8倍；甲基对氧磷诱导后24 h这4个P450基因的相对表达量达到最高峰分别为对照的3.9、1.5、6.6及2.6倍。涕灭威对嗜卷书虱4个可被溴氰菊酯、甲基对氧磷诱导的P450基因均无显着的诱导作用,而CYP4CD1的表达量在涕灭威的诱导后36 h达到高峰为对照的4.7倍。由此可见,CYP4CD1可能与其它4个P450基因具有不同的生理功能：CYP6CE1、CYP6CE2、CYP4CB1及CYP4CC1极有可能参与了溴氰菊酯、甲基对氧磷在嗜卷书虱体内的代谢过程,而CYP4CD1可能参与了涕灭威在嗜卷书虱体内的代谢过程。2.4 P450在不同品系中的表达模式利用qPCR技术,以Lbp-Actin1为内参基因,分析了嗜卷书虱5个P450基因在实验室选育并保存的嗜卷书虱DDVP、PH3抗性品系及敏感品系中的表达模式。结果表明,除CYP4CC1外其它4个P450基因在2个抗性品系中均有不同程度的过量表达,但上调表达的幅度不高(均未超过2倍),这一现象暗示这4个P450基因极有可能共同参与嗜卷书虱抗性的形成。由此可见,书虱抗性形成并非由单一的基因或酶类介导,而是其体内多种酶类协同作用的结果。3嗜卷书虱P450基因的原核表达基因异源表达技术是基因工程技术的核心,是功能基因组学研究中明确基因功能的一个基础研究。本研究采用Gateway(?)支术成功构建了嗜卷书虱CYP6CE1和Lbβ-Actin1基于pDestl7的原核表达载体,经Western Blot检测证实大肠杆菌中表达的重组蛋白就是CYP6CE1-pDestl7和Lbβ-Actinl-pDestl 7的重组蛋白,从而实现了这2个基因在大肠杆菌体内的异源表达。同时利用BamHI和Xhol的双酶切以及DNA重组技术构建了嗜卷书虱CYP6CE1、CYP4CB1、CYP4CC1及CYP4CD1基于pET4317.1a(+)的原核表达载体。为了提高P450基因异源表达产物的产量和产物的分离纯化等,通过对PCR上游引物5，的改造实现了对细胞色素P450蛋白的N端修饰。包括去除信号肽序列,将起始密码子ATG之后的第二个密码子替换为GCT,在该密码子之后引入4个连续的CAT编码组氨酸的标签等。最后,利用BamHI和XbaI的双酶切以及DNA重组技术,成功构建了嗜卷书虱CYP6CE1、CYP4CB1、CYP4CC1及CYP4CD1基于pCW的原核表达载体。异源表达的实现为将来深入研究表达产物的生化及毒理学特性奠定了坚实的基础。4嗜卷书虱CYP6CE1等位基因多态性P450等位基因的点突变对其蛋白结构、底物识别、催化活性及功能具有重要影响。本研究采用RT-PCR技术从嗜卷书虱敏感品系和2个抗性品系体内分离克隆了3个CYP6CE1的等位基因CYP6CE1v1、CYP6CE1v2和CYP6CE1v3(GenBank登录号分别为EF421245、EU266572及EU266573)。序列比对发现CYP6CE1v2与CYP6CE1v3核苷酸序列中有15个多态性位点及其所在的位置。序列分析明确了CYP6CE1v2的15处多态性位点仅导致了其编码的蛋白质1处氨基酸替换,而CYP6CE1v3编码的蛋白质却发生了5处氨基酸替换。利用Protparam软件对CYP6CE1v1-3所编码蛋白质的基本参数进行预测,发现CYP6CE1v2与CYP6CE1v1编码的蛋白质在性质上差异不大,但与CYP6CE1v3编码的蛋白质在性质上存在明显差异。进一步使用蛋白质叁维结构同源模拟工具SWISS-MODEL对上述3个等位基因编码蛋白质的叁维结构进行模拟,在理论上证实了CYP6CE1v3编码蛋白的3处氨基酸替换均对其叁维结构产生一定的影响。综上所述,本研究克隆获得了嗜卷书虱体内的4个持家基因cDNA全序列,丰富了嗜卷书虱的遗传信息,并且为将来深入探讨啮目昆虫的进化关系提供了可能的分子标记；分离获得了5个细胞色素P450新基因的cDNA全序列,为深入研究嗜卷书虱P450酶系统的功能奠定了坚实的基础；利用分子生物学最新研究成果筛选出了基因表达转录分析中稳定表达的内参基因,搭建了书虱基因表达转录分析的研究平台；并在此基础上,利用实时定量PCR技术全面解析了这5个细胞色素P450基因在嗜卷书虱不同发育阶段、不同品系以及药剂诱导后的表达模式；此外,还进行了细胞色素P450的原核表达和重组蛋白离体研究。研究成果将促进对嗜卷书虱细胞色素P450基因生理功能的认识,为嗜卷书虱抗性相关P450基因的鉴定提供理论依据,并对阐释细胞色素P450介导嗜卷书虱代谢抗性的分子生物学机制具有重要的理论意义。
李晓芳[7]2007年在《朱砂叶螨抗性机理初步研究及酯酶cDNA克隆与序列分析》文中提出朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是我国分布广泛，在棉花及多种蔬菜作物上为害严重而又难于防治的一种害螨。自80年代后期开始，其抗药性水平上升极快，特别是在我国棉花产区，由于用药次数比较多，抗药性的发生状况更为严重。据统计，朱砂叶螨至少对25种杀虫杀螨剂产生抗性。长期以来对害螨的防治主要依赖于使用有机合成杀虫杀螨剂，目前在其常发区已经呈现抗药谱广，抗性水平高的特点。国内外学者对螨类抗性机制的研究大都局限于生物化学水平，而对螨类抗性的分子生物学机制却知之甚少，这无疑影响了人们对螨类抗性本质的认识和螨类抗性治理措施的制订。本文以分布广、食性杂、危害大的重要农业害螨—朱砂叶螨为研究对象，对其进行酯酶同工酶研究和酯酶酶活性研究，结果表明酯酶活性增强与朱砂叶螨对阿维菌素产生抗性有关，耐高温品系对阿维菌素产生的抗药性可能与乙酰胆碱酯酶的活性增强有关，同时在此基础上，对朱砂叶螨酯酶基因进行了克隆和序列分析，结果如下：1朱砂叶螨不同品系酯酶同工酶的研究同工酶是指那些生物功能相同或相近，但其蛋白质分子组成不同的酶类。酶带占整个酶谱的密度比例反映了该酶在整个酯酶体系中活性的相对强弱，密度比例越大，表明该酯酶的活性越强。在本实验中，敏感品系有4条酶带分别为：0.42％、54.39％、25.09％和20.10％；耐高温品系有3条酶带分别为：6.71％、63.46％和29.83％；抗阿维菌素品系有5条酶带分别为：5.35％、45.71％、29.44％、0.68％和18.81％。2朱砂叶螨不同品系羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶酶活性研究近来大量研究证明，昆虫体内解毒酶活力的增强是昆虫抗药性最主要的原因。本实验朱砂叶螨不同品系酶源蛋白含量测定结果为：耐高温品系(Rh)蛋白含量＞敏感(S)品系＞阿维菌素抗性品系(AbR)，并均有显着差异。朱砂叶螨各品系羧酸酯酶活力和比活力由高到低依次都为：AbR＞S＞Rh，此结果表明，朱砂叶螨对阿维菌素产生抗性可能与羧酸酯酶活性增加有关，另外，结合AbR品系蛋白含量减少的结果，AbR品系羧酯酶活力反而比S品系的高，表明AbR品系羧酸酯酶极有可能已发生质变，而不是停留在量变的水平。在乙酰胆碱的活性研究中发现，Rh品系的朱砂叶螨对阿维菌素的耐药性可能与乙酰胆碱的活性增加有关，还有待进一步研究。3朱砂叶螨酯酶基因cDNA的克隆及序列分析本文通过酯酶家族酯酶基因保守序列设计的简并引物和RT-PCR技术扩增获得朱砂叶螨酯酶基因的cDNA片段，序列分析表明该片段与其他昆虫的酯酶基因具有很高的相似性。其中与斜纹夜蛾(Spodoptera litura)的氨基酸同源性最高，达到89.7％，与埃及伊蚊(Aedes aegypti)、微小牛蜱(Boophilus microplus)、果蝇(Drosophila melanogaster)和家蝇(Musca domestica)的同源性分别为84％、83.2％、83％和80.9％。据此，可推断此为朱砂叶螨酯酶基因。本研究获得的朱砂叶螨酯酶基因序列为进一步筛选cDNA文库获取全长基因提供了前提条件，也为进一步明确朱砂叶螨的抗性分子机制打下了基础。
王晓娜[8]2011年在《桔小实蝇AChE的分离纯化及生化毒理学特性研究》文中研究指明本学位论文以桔小实蝇Bactrocera dorsalis为研究对象,采用局部点滴法测定了桔小实蝇不同地理种群对马拉硫磷、高效氯氰菊酯和阿维菌素3种常用杀虫剂的敏感性；在此基础上,采用普鲁卡因胺(Procainamide)亲和层析法,成功分离纯化了桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段体内的乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase, AChE),并从昆虫生理生化角度系统分析了桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段AChE的生化毒理学特性。研究工作得到了国家973计划前期研究专项(2009CB125903)和重庆市杰出青年科学基金项目(CSTC2009BA1042)的资助,经过2年多的研究,获得的主要结果如下：1桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段AChE的纯化采用普鲁卡因胺亲和层析法成功地从桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段虫体内分离纯化了AChE。各地理种群的纯化倍数均达到500倍以上。其中,桔小实蝇东莞种群AChE的纯化倍数最高(561倍),昆明种群次之(546倍),广州种群(510倍)和海口种群(509倍)的纯化倍数相对最低；东莞、昆明、广州和海口种群的AChE回收率分别为53.2%、43.9%、57.1%和57.3%。桔小实蝇不同发育阶段AChE的纯化指数亦不相同。其中,3龄幼虫AChE的纯化倍数最高(584倍),蛹期次之(530倍),成虫最低(505倍),3龄幼虫、蛹和成虫期AChE的回收率分别为56.3%、53.3%和48.5%。纯化后的酶液经SDS-PAGE检测,均显示单一条带,分子量均为58 KD,达到电泳纯水平。2桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段AChE生化毒理学特性研究2.1生物测定采用局部点滴法测定了桔小实蝇东莞、广州、海口和昆明4个地理种群对马拉硫磷、阿维菌素和高效氯氰菊酯的敏感性。生物测定结果表明,桔小实蝇4个地理种群对马拉硫磷的敏感性差异显着,其中东莞种群对该药剂相对最不敏感,其次依次为广州、海口和昆明种群；东莞、广州和海口种群对阿维菌素的敏感性无显着性差异,但与昆明种群间差异显着；除广州和海口种群对高效氯氰菊酯的敏感性无显着性差异外,其它种群对高效氯氰菊酯的敏感性均有显着性差异。3种药剂间相比较,桔小实蝇对马拉硫磷最不敏感,对阿维菌素相对最敏感。因此,推测在实际田间药剂防治中,阿维菌素对桔小实蝇的防治效果可能会优于马拉硫磷和高效氯氰菊酯。2.2桔小实蝇不同地理种群AChE生化毒理学特性研究通过对纯化后的AChE酶促反应的最适温度和最适pH进行测定发现,桔小实蝇4个地理种群AChE均在pH 7.4时活力达到峰值,4个地理种群理论最适pH分别为：东莞种群7.38、广州种群7.39、海口种群7.44、昆明种群7.45；不同地理种群AChE在温度为37℃时活力最高,理论最适温度分别为：东莞种群36.0℃、广州种群36.6℃、海口种群36.8℃、昆明种群36.3℃。比较桔小实蝇不同地理种群AChE的动力学参数发现,4个地理种群的米氏常数(K_m)和最大反应速率(Vmax)差异显着。其中东莞种群K_m相对最高,Vmax相对最低,说明东莞种群AChE对底物的亲和力最弱,对底物的水解能力最差。离体抑制结果表明,6种抑制剂(毒扁豆碱、乙基对氧磷、残杀威、BW284C51、涕灭威和毒死蜱)对桔小实蝇不同地理种群AChE均有良好的抑制效果。比较抑制中浓度I_(50)和双分子速率常数K_i发现,桔小实蝇各种群均对毒扁豆碱的抑制作用最敏感,而毒死蜱的抑制效果最差。东莞种群相对其它3个种群对抑制剂的抑制作用最不敏感。2.3桔小实蝇不同发育阶段AChE生化毒理学特性研究对纯化后的AChE酶促反应的最适温度和最适pH进行测定发现,桔小实蝇不同发育阶段AChE在pH 7.4时活力最高,其理论最适pH分别为：3龄幼虫期为7.39、蛹期为7.35、成虫期为7.45。各发育阶段AChE均约在37℃时活力最高,理论最适温度分别为：3龄幼虫期36.5℃、蛹期37.0℃、成虫期36.8℃。比较桔小实蝇不同发育阶段AChE的动力学参数发现,3个发育阶段的米氏常数和最大反应速率差异显着。其中成虫期K_m相对最高,Vmax相对最低,说明桔小实蝇成虫对底物的亲和力最弱,水解能力最差；幼虫期K_m相对最低,Vmax相对最高,说明桔小实蝇幼虫对底物的亲和力最强,水解能力也最强。离体抑制结果发现,6种抑制剂(毒扁豆碱、乙基对氧磷、残杀威、BW284C51、涕灭威和毒死蜱)对桔小实蝇不同发育阶段AChE均具有良好的抑制效果。通过比较抑制中浓度I_(50)和双分子速率常数K_i发现,桔小实蝇不同发育阶段的AChE均对毒扁豆碱的抑制作用最敏感,而毒死蜱的抑制效果最差。3个发育阶段相比较,成虫期AChE对抑制剂的抑制作用最不敏感。综合来看,桔小实蝇不同地理种群和不同发育阶段AChE生化和毒理学特性存在差异的原因可能与各种群和各发育阶段AChE对药剂的敏感性差异有关,而这与各地施药水平及各发育阶段的靶标调控机制密不可分。
刘秋磊[9]2015年在《多杀菌素抗性西花蓟马转录组测序及nAChRα5和α7亚基的克隆分析》文中研究指明西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是一种世界性的园艺作物上的主要害虫,可为害蔬菜、花卉和果树等多种作物。目前对于西花蓟马的防治包括生物防治、物理防治以及广泛使用的农药防治等多种方法,其中药剂防治最为普遍。但由于西花蓟马发育周期短、繁殖力强、具有单双倍体繁殖系统,以及杂食性的特点,西花蓟马可通过多种途径对杀虫剂产生抗药性,成为抗药性最为严重的害虫之一。国外已有西花蓟马对防治其最有效的药剂——多杀菌素产生了极高水平抗性的报道,国内西花蓟马对多杀菌素的敏感性也呈下降趋势。根据已有文献,不同多杀菌素抗性西花蓟马种群的抗性机理存在明显差异,研究本地区西花蓟马对多杀菌素的抗性机制对西花蓟马的抗性治理具有十分重要的意义。本文研究了西花蓟马在低温下的生长发育及繁殖状况,对多杀菌素敏感和抗性西花蓟马的转录组进行了测序,并根据RNA-seq结果对西花蓟马烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α5和α7亚基进行了克隆和分析。上述研究可进一步了解西花蓟马的生物学特性、阐明西花蓟马对多杀菌素的抗性机制,为西花蓟马的有效防治提供理论依据。常年用多杀菌素处理的豆角饲喂该杀虫剂的抗性种群,通过不断的汰选,抗性种群对多杀菌素的LC50>3,000mg/L,抗性倍数稳定在10,000倍以上,达到了极高抗性水平。敏感种群不接触任何药剂,两种群隔离饲养,为后续研究奠定了试虫基础。通过对5℃和10℃环境下西花蓟马生长发育和繁殖等状况的观察研究,发现西花蓟马具有较高的低温耐受性,在5℃下西花蓟马无法完成生命周期,卵无法正常孵化,1龄若虫可以发育到2龄,但2龄若虫不能继续发育至蛹;蛹能够发育至成虫但成虫不能产卵;10℃下西花蓟马能够完成生活史,但是发育历期显着延长。结果表明,低温导致西花蓟马的发育速度减慢,后代数量骤减,但西花蓟马转移至室温环境后,能够恢复正常生长,说明其具有很强的低温耐受性。对多杀菌素敏感和抗性种群进行RNA-seq,得到了西花蓟马的68,358个unigenes基因,其中与杀虫剂抗性相关的20类基因共1655个unigenes,能够与NCBI-NR库中已公布基因比对上的基因565个,在目前尚无西花蓟马基因组数据的情况下,这无疑很大程度地丰富了西花蓟马的基因数据信息;经差异基因分析,发现两种群间差异表达基因2,618个,其中抗性种群内表达上调的基因1,231个,表达下降的基因1,387个;发现抗性种群中与SOD相关的基因过表达,上调倍数247倍;抗性种群的细胞色素P450s的上调倍数也高于本家族其他基因的下调倍数。经过对RNA-seq数据的qPCR验证,证明RNA-seq得到的差异表达基因是可靠的,可用于指导对西花蓟马多杀菌素抗性的产生机制进行研究。在转录组测序的基础上,克隆获得了西花蓟马nAChRα5亚基和nAChRα7亚基基因CDS全长,经同源比对确定这两个基因为西花蓟马该受体的α5和α7基因;它们的表达量在两种群间均无显着差异。nAChRα7在两种群间无序列差异,而nAChRα5在抗性种群中存在A–E五种转录本,在敏感种群中只有A一种形式。D型和E型的N端与A型相比较短,B型较A型存在SGRSSIARCKN的肽段插入,C型转录本在TM3、TM4之间缺失了19个氨基酸残基(从405位的P到423位的E),敏感和抗性种群间转录本的差异可能与抗性有关,其作用需进一步研究。
石力[10]2017年在《朱砂叶螨抗甲氰菊酯P450基因鉴定及其转录调控研究》文中研究说明朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种危害多种经济作物的重要农业害螨。随着化学农药的大量、不科学使用以及害螨自身的特点,朱砂叶螨的抗药性问题日益加剧,对目前市场上的大部分杀螨剂都产生了一定程度的抗药性,从而给农业生产带来了巨大的损失。甲氰菊酯是一种常用的具有杀虫、杀螨活性的拟除虫菊酯类农药。研究表明朱砂叶螨、二斑叶螨以及柑橘全爪螨等都已经对其产生了较高水平的抗药性。细胞色素P450酶系是昆虫(螨)体内一类关键解毒酶系,可以代谢多种内、外源化合物,在昆虫(螨)对杀虫(螨)剂的解毒代谢过程中起着十分重要的作用。目前,对于细胞色素P450介导朱砂叶螨甲氰菊酯抗性机制的报道相对较少,且多集中在生化水平层面。因此,对细胞色素P450酶系进行整体研究,并从转录水平上认识P450基因表达的调控机制,对于进一步明确其介导的代谢抗性机理,全面揭示朱砂叶螨代谢抗性机制具有重要意义,在实践上对于制定朱砂叶螨抗药性的治理策略亦具有非常重要的指导意义。本学位论文的主要研究结果总结如下:1.甲氰菊酯对朱砂叶螨敏感和甲氰菊酯抗性品系的毒力测定采用药膜法测定出甲氰菊酯对朱砂叶螨敏感品系(SS)和甲氰菊酯抗性品系(FeR)的致死中浓度分别为606.98 mg/L和61581.93 mg/L,表明目前室内筛选的抗性品系对甲氰菊酯的抗性已达101倍的高抗水平。经P450酶系特异性抑制剂PBO处理后,抗性倍数下降至75倍,也就是说PBO抑制了26倍的甲氰菊酯抗性,这初步说明P450酶系在朱砂叶螨甲氰菊酯的抗性形成中具有重要作用。2.朱砂叶螨与甲氰菊酯抗性相关的P450及其功能相关基因的筛选、克隆及序列分析从本课题组之前的表达谱测序以及基因芯片数据中获得了6条在甲氰菊酯抗性品系中过表达的P450 Unigenes片段。通过qPCR验证表明6条P450基因在朱砂叶螨甲氰菊酯抗性品系中的表达量都显着高于敏感品系,与表达谱测序和基因芯片数据结果一致,其上调倍数为1.96-5.92倍。对细胞色素P450还原酶基因进行qPCR分析,发现其在朱砂叶螨甲氰菊酯抗性品系中上调表达4.12倍。这些结果初步表明6条过表达的P450基因和1条细胞色素P450还原酶基因都与朱砂叶螨对甲氰菊酯的抗性产生有关。基于朱砂叶螨转录组数据和二斑叶螨基因组数据,通过RT-PCR技术,成功克隆出朱砂叶螨6条P450基因和1条P450还原酶基因c DNA全长序列,其中6条P450基因命名以及Gene Bank登录号分别为CYP384A1(KT851973)、CYP389B1(KF770839)、CYP391A1(KT851972)、CYP392A26(KF770838)、CYP392A28(KT851975)和CYP392D11(KT851974)。这6条P450基因的开放阅读框长度范围为1488 bp-1671 bp,预测蛋白分子量大小在56.79 k Da-64.03 k Da之间。将朱砂叶螨P450还原酶基因命名为TcCPR,Gen Bank登录号为KP710970。TcCPR基因完整开放阅读框包含2004个碱基,编码667个氨基酸残基,其预测蛋白分子量大小为75.47 k Da。生物信息学分析结果表明6条P450基因均为微粒体型P450,均包含一系列P450特征区域,例如螺旋C区、螺旋I区、螺旋K区、meander区域和血红素结合区。系统发育分析发现CYP392A26、CYP392A28和CYP392D11属于Clan 2,CYP384A1属于Clan 3,而CYP389B1和CYP391A1属于Clan 4。同样对TcCPR生物信息学特性分析发现其存在跨膜结构域和信号肽,氨基酸序列含有FMN、FAD及NADPH保守功能区域,与二斑叶螨Tu CPR基因的亲缘关系最近,而与昆虫纲CPR基因的亲缘关系稍远。3.朱砂叶螨P450基因和TcCPR基因的表达模式解析通过qPCR对朱砂叶螨6条P450基因在不同发育阶段的m RNA水平进行检测,结果表明不同的P450基因在不同发育阶段的表达具有特异性。药剂胁迫诱导实验发现被甲氰菊酯胁迫6 h、12 h和24 h后,P450基因的表达量在敏感品系中总体变化差异不大,但是在甲氰菊酯抗性品系中都能被显着诱导上调表达,且表达水平变化具有一定的时间效应。这些结果表明朱砂叶螨6条P450基因与甲氰菊酯抗性形成有关,且在抗性品系中对甲氰菊酯的胁迫诱导更加敏感。TcCPR基因在朱砂叶螨不同发育阶段的表达模式与多数朱砂叶螨P450基因具有较高的一致性,在幼螨、若螨和成螨中表达量较高,而在卵中最低,在叁种螨态的表达量分别是卵期的5.40倍、4.47倍和4.75倍,反映出TcCPR与P450间的协同一致性。经甲氰菊酯诱导6 h、12h和24 h后TcCPR基因的表达水平升高,但敏感品系中差异不大(低于1.5倍),而在甲氰菊酯抗性品系中差异显着,其表达量分别是对照的3.70倍、3.95倍和4.61倍,再次表明P450酶系,包括TcCPR基因,在抗性品系中对甲氰菊酯的胁迫诱导反应更强烈。4.朱砂叶螨P450基因和TcCPR基因RNAi研究采用基于“叶碟饲喂法”的RNAi技术对朱砂叶螨在FeR中过表达的6条P450基因进行研究,结果发现饲喂单条P450基因ds RNA(1000 ng/μL)后,CYP384A1、CYP389B1、CYP391A1、CYP392A26、CYP392A28和CYP392D11的沉默效率达到55.27%-74.19%,朱砂叶螨P450s酶活性显着降低1.21-2.29倍,在甲氰菊酯LC30和LC50两个浓度下的死亡率分别增加8.39%-15.78%和7.88%-17.49%。当同时饲喂6条P450基因ds RNA混合物后,6条P450基因沉默效率为35.93%-65.64%,朱砂叶螨P450s酶活性显着降低4.0倍,在甲氰菊酯LC30和LC50两个浓度下的死亡率分别增加30.73%和33.17%。六条P450基因的RNAi实验表明6条P450基因都不同程度地参与了朱砂叶螨对甲氰菊酯的抗药性形成,且6条基因存在明显的协同增效现象。同样,对TcCPR基因实施RNAi后,其在朱砂叶螨SS和FeR中的沉默效率分别达到52.5%和41.0%,FeR中的P450s酶活性显着降低4.0倍,在甲氰菊酯LC30和LC50两个浓度下的死亡率分别增加21.60%和26.20%,但SS对甲氰菊酯的敏感性并没有显着的变化。此外,抑制TcCPR基因的表达后,6条P450基因m RNA的表达水平并没有明显改变。这些结果表明,一方面TcCPR基因可影响P450s酶活性,另一方面朱砂叶螨FeR中P450/CPR对甲氰菊酯胁迫更敏感,在朱砂叶螨对甲氰菊酯的抗性形成中发挥了重要作用。5.朱砂叶螨P450基因和TcCPR基因原核表达研究借助大肠杆菌表达系统对朱砂叶螨6条P450基因和1条CPR基因进行原核表达,以期获得体外重组蛋白并进行功能研究。最终6条P450基因和1条CPR基因都成功得到表达,但其中只有CYP384A1、CYP389B1、CYP392A28、CYP392D11和TcCPR基因获得了可溶性重组蛋白,并且只有CYP384A1、CYP389B1和TcCPR基因的表达产物可检测到蛋白活性。重组蛋白TcCPR活性为512.69±139.21 nmol/mg pro.min-1(细胞色素C为底物),CYP384A1和CYP389B1的脱甲基活性分别为3.74±0.29 nmol/mg pro.min-1和0.97±0.11 nmol/mg pro.min-1(对硝基苯甲醚为底物)。CYP384A1和CYP389B1都能够结合并分解甲氰菊酯:甲氰菊酯对CYP384A1的抑制中浓度为181.3±18.8μM,10μg和20μg的CYP384A1对甲氰菊酯的分解率分别为30.83±3.87%和40.75±3.50%;甲氰菊酯对CYP389B1的抑制中浓度为259.3±116.1μM,10μg和20μg的CYP389B1对甲氰菊酯的分解率分别为22.57±6.88%和30.62±3.16%。基因原核表达及功能验证实验表明,P450/CPR可直接分解甲氰菊酯,从而介导朱砂叶螨对甲氰菊酯产生抗药性。6.朱砂叶螨转录因子对甲氰菊酯抗性相关P450基因的调控研究克隆获得了朱砂叶螨的6条感受异源物质胁迫的转录因子c DNA全长,分别命名为CncC、Maf、HNF4、HR96、USP(RXR1)和USP(RXR2)。qPCR检测发现CncC、Maf和HNF4在FeR中表达量都显着高于SS,其上调倍数分别为394.83倍、3.03倍和4413.57倍,而HR96、USP(RXR1)和USP(RXR2)的m RNA表达量在SS和FeR中没有显着差异。通过RNAi沉默转录因子CncC后,CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28的m RNA表达量显着下调,P450s酶活性显着降低,甲氰菊酯胁迫后的死亡率显着提高了12.75%-20.40%;沉默转录因子Maf后,CYP389B1和CYP392A28的m RNA表达量显着下调,P450s酶活性显着降低,甲氰菊酯胁迫后的死亡率显着提高了19.50%-21.10%;HNF4被沉默后,P450基因表达、P450s活性以及对甲氰菊酯的敏感性都没有显着变化。转录因子RNAi研究结果表明CncC和Maf可以调控CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28的表达,从而导致朱砂叶螨对甲氰菊酯的敏感性发生改变。进一步通过荧光素酶报告系统对转录因子CncC和Maf与P450基因启动子的结合及调控关系进行分析,发现CncC和Maf都能影响CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28的启动子的荧光活性:其中CYP389B1和CYP392A28的启动子同时结合CncC和Maf后的荧光活性要显着大于单独结合CncC的活性,而CYP391A1的启动子单独结合CncC后的荧光活性要显着大于同时结合CncC和Maf的活性,但是叁条P450基因的启动子单独结合Maf后的荧光活性与对照没有显着差异。荧光素酶结合实验不但确证了RNAi实验结果(即CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28确实受到CncC和Maf的调控),而且进一步明确了转录因子和P450基因的调控关系:CncC和CncC-Maf都能调控CYP389B1和CYP392A28的表达,CYP391A1的表达主要受CncC的调控,而Maf不能单独调控P450基因的表达。
参考文献：
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[8]. 桔小实蝇AChE的分离纯化及生化毒理学特性研究[D]. 王晓娜. 西南大学. 2011
[9]. 多杀菌素抗性西花蓟马转录组测序及nAChRα5和α7亚基的克隆分析[D]. 刘秋磊. 中国农业科学院. 2015
[10]. 朱砂叶螨抗甲氰菊酯P450基因鉴定及其转录调控研究[D]. 石力. 西南大学. 2017
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