论文摘要
磷脂酶D（PLD;EC 3.1.4.4）是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称,可以作用于多种磷脂及磷脂衍生物,作用位点为磷酸取代基间的酯键,产物为磷酸甘油酯和羟基化合物。PLD作为一种重要的工具酶,在食品和医药行业中具有极大的应用价值。PLD在生物体内具有广泛的分布,其中微生物来源的PLD是研究的热点。目前,在PLD开发领域,研究的PLD主要集中在陆地微生物来源,而对于海洋微生物来源的报道尚处于空白状态。海洋中所蕴含的丰富微生物资源为我们提供了广阔的开发空间,研究开发新型的海洋微生物来源的PLD具有重要价值和意义。本论文以来源于海洋副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的磷脂酶D（VpPLD）（GenBank:EXJ48329.1）为研究对象,利用大肠杆菌重组表达系统同时构建了三种带有（His）6-Tag的重组VpPLD酶蛋白（VpPLD-WT-（His）6,（His）6-VpPLD-WT,（His）6-VpPLD-WT-（His）6）,并对构建的三个野生型VpPLD酶学性质进行了表征。分析比较了（His）6-Tag位置对重组酶蛋白界面吸附性质和水解性质的影响。结果表明:相比于在C-末端,（His）6-Tag在酶蛋白序列N-末端时所表达的重组蛋白VpPLD更倾向于停留在空气-水界面上。（His）6-Tag位于VpPLD的N-末端时,所表达的重组蛋白对于二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）和二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）单分子膜亲和力更强,而（His）6-Tag位于VpPLD的C-末端时,表达的重组蛋白则对DMPS和二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）单分子膜表现出较强的亲和力。当（His）6-Tag位于VpPLD的C-末端时,改变了VpPLD对不同酰基链长磷脂底物水解的选择性,使其更偏向于水解DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）和二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）。而当（His）6-Tag位于VpPLD的N-末端或C,N两末端时,则改变了VpPLD对不同极性头部磷脂底物的选择性,使其更偏向于水解DMPC,DMPE和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）。通过对VpPLD序列进行比对分析,发现VpPLD的C,N-末端肽段区别于其它已经报道的PLD。为了探究VpPLD的C,N-末端肽段对重组蛋白酶学性质的影响,本论文设计构建了C,N-末端肽段缺失的VpPLD突变体。首先:基于单分子层技术,对C,N-末端肽段截短突变蛋白对不同磷脂分子膜的界面吸附性质进行了表征,结果发现:VpPLD的C-末端肽段（aa434-487;aa451-487;aa469-487）缺失并没有改变VpPLD对不同磷脂单层膜的结合选择性。删除β-折叠片结构（aa434-469）和螺旋结构（aa469-487）,酶蛋白对不同磷脂单分子膜的吸附动力学参数最大插入压力（MIP）值均增大,表明酶蛋白与各磷脂底物结合能力都增强。磷脂酶VpPLD中N末端loop结构（aa1-25）和螺旋结构（aa26-34）缺失改变了VpPLD对不同磷脂的结合偏好性,从原来偏好于结合DMPS/DMPC变为对DMPE的亲和力更强。其次:基于水杨酸铁法对所构建的各突变体对不同的磷脂底物的水解特性进行表征。结果显示:截短VpPLD的C-末端肽段（aa451-487;aa469-487）,改变了酶蛋白对磷脂底物的选择性,使突变体酶倾向于水解DOPC,DMPS和DMPC。截短VpPLD的N-末端肽段（aa1-34）后,酶蛋白对于DMPS表现出更高的选择性。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 魏瑞霞
导师: 王方华
关键词: 磷脂酶,副溶血弧菌,底物选择性,界面吸附
来源: 华南理工大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 华南理工大学
分类号: Q55
DOI: 10.27151/d.cnki.ghnlu.2019.001234
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