高闪闪[1]2017年在《奶山羊胎盘抗氧化多肽制备及其功能活性研究》文中认为奶山羊胎盘含有多种生物活性成分,具有抗衰老、免疫调节、抗炎镇痛等功效,以抗氧化活性最为突出。中国奶山羊存栏数超过1200万只,陕西省具有明显比较优势,羊胎盘有效利用具有很高商业开发价值。但目前羊胎盘利用率仍较低或几乎未被利用,因此对奶山羊胎盘进行综合研究,开发其相关产品具有较好的发展前景和重要意义。本论文以奶山羊胎盘为研究对象,采用生物工程技术和超滤相结合的方法制备奶山羊胎盘抗氧化活性肽,对其基本理化特性进行分析评价,同时对不同胎次奶山羊胎盘的抗氧化活性进行比较研究;利用动物试验进行体内抗氧化活性的评价,为其商业化开发提供技术支撑;并采用膜分离、色谱分离等技术对其组分进行分离与纯化,以期得到功能明确的奶山羊胎盘抗氧化多肽组分,为特医食品的开发提供基础研究。主要研究结论如下:(1)羊胎盘提取物(GPE)呈疏松多孔的海绵状,淡黄色,有腥味,易溶于水。试验表明:I、II、III胎次各胎盘提取物冷冻干燥后,多肽含量、DPPH·清除率、·OH清除率、可溶性蛋白(WSP)含量均表明II胎次最佳,质量最优。4oC条件下贮存GPE抗氧化活性优于25oC,4oC贮存63 d后第II胎GPE抗氧化活性保全率最高。(2)对其稳定性研究结果表明:金属离子能通过一定方式降低其抗氧化活性;温度及糖类对活性影响不尽相同,高温使抗氧化活性迅速丧失,但该条件下与还原糖结合能够抑制活性的降低;pH对活性影响:在接近弱酸性(pH=6)时GPE抗氧化活性最强,碱性环境有利于螯合Fe2+;GPE的干燥方式对活性亦有影响,与喷雾干燥相比,冷冻干燥效果佳,得到的产品溶解性好,生物活性保全率高。(3)体外模拟胃肠消化试验显示:(1)在模拟胃消化阶段,GPE经胃蛋白酶消化后其DPPH·清除率变化不明显,但Fe2+螯合能力显着下降,胃液中较低pH值、较小E/S能显着提高GPE多肽的抗氧化活性。(2)在模拟肠消化阶段,消化液经过胰蛋白酶进一步消化,螯合Fe2+能力增强,抗氧化活性有所回升,且E/S越大其抗氧化能力越强。(3)对两个消化阶段的消化液进行表面疏水性的测定,H0出现先升高后降低的趋势,与两消化阶段抗氧化活性变化趋势相呼应。(4)对GPE多肽喂养动物试验显示:(1)在整个试验周期内小鼠体重稳定增长,模型组小鼠增重与对照组、给药组相比差异不显着(P>0.05),表明GPE活性肽对小鼠生长、觅食、消化和代谢均不具有显着影响。(2)高剂量组能显着提高小鼠脾脏指数(P<0.05),对小鼠肾脏指数无影响。与模型组相比,各受试组能显着提高小鼠血清、心、肝、脑组织中T-SOD、T-AOC、CAT等指标的活力(P<0.05),显着降低MDA含量(P<0.05),减缓氧化应激引起的损伤。(5)以DPPH·清除能力、OH·清除能力、螯合Fe2+能力作为抗氧化活性综合评价指标,对GPE采用截留不同分子量的超滤膜进行逐级分纯,结果表明分子量Mr为5 K-3 K Da组和≤1 KDa组的抗氧化活性较强。这两个组分经葡聚糖Sephadex G-25分离层析后得到4个组分S1、S2、S3、S4,其中S1抗氧化活性最强。S1经葡聚糖Sephadex G-10进一步分离纯化后得到S1-1、S1-2两个组分,其中S1-2抗氧化活性最强,可作为商业化利用重点目标进一步研究。
师玉淼[2]2013年在《猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究》文中研究指明胎盘肽是人类功能性食品研究和开发的重要资源，猪胎盘是未被充分开发利用的资源，它含有人体所必需的多种氨基酸，像缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸等，它还具有调节内分泌、增强免疫、补血美容、增强记忆、抗应激等功效。充分探索其生物活性功能，开发具有特殊生物活性，如抗氧化性、降血压性等的功能性食品或生物制品，具有重要的理论和实践意义。本文以猪胎盘作为原料，采用胃蛋白酶水解制备猪胎盘功能性短肽，研究其生物活性，旨在为猪胎盘功能性肽的充分利用提供科学依据。主要研究结果如下：（1）采用正交试验，在单因素试验的基础上，得到最佳工艺酶为胃蛋白酶，最佳工艺条件为酶与底物比13%、pH2.5、温度30℃，在最佳工艺条件下制得的猪胎盘酶解液粗提物的还原力为1.3257，水解度为41.38%。（2）利用紫外可见分光光度计，测得猪胎盘酶解液的胎盘肽含量为17.37mg/mL；紫外扫描猪胎盘酶解液，得到其最大吸收峰为205nm。（3）采用SDS-PAGE验证不同分子量酶解液的正确性，对不同分子量的猪胎盘酶解液的DPPH自由基清除活性这一主要指标的测定，得知<3KD的猪胎盘酶解液的活性最好，其DPPH自由基清除活性的IC50值为9.97mg/mL。将其经过SephadexG-25和Sephadex G-10的分离纯化，得到了活性较高的峰B组分，其DPPH自由基清除活性和ACE抑制活性的IC50值分别为7.89mg/mL和12.69mg/mL。（4）以DPPH作为主要指标，对分离纯化后的猪胎盘酶解液经高温、低温、酸和碱处理，得到处理后的酶解液的DPPH自由基清除活性的IC50值分别为9.89mg/mL、9.5mg/mL、8.94mg/mL、9.63mg/mL，与未处理的猪胎盘酶解液的IC50值7.89mg/mL相比，经过高温、低温和酸碱处理后的猪胎盘酶解液的DPPH自由基清除活性均有小幅度降低，但变化幅度不大，说明酶解得到的猪胎盘肽的稳定性较好。
白玉[3]2003年在《人胎盘多肽的分离纯化及其活性的初步研究》文中研究表明本实验对人胎盘中的小分子多肽进行了的分离、纯化及部分性质研究；对人胎盘小分子多肽的粗提物进行了抗血栓药理活性的初步测试。 经匀浆、冻融、超滤、离子交换柱层析、Sephadex G-25凝胶柱层析等步骤从人胎盘中分离纯化得到四个纯化产物：B1-3、B2-2、B3-1、B4-2。经RP-HPLC鉴定，验证其纯度均在95％以上。经SDS-PAGE鉴定，其中的B3-1、B4-2均为单一条带，测定其分子量分别为：13774.7±350，7468.4±500。经等电聚焦电泳鉴定，其中的B3-1、B4-2均为单一条带，测定其等电点分别为5.9±0.5和4.8±0.5。本实验还测定了四种纯化产物的紫外吸收图谱，B2-2和B3-1在苯酚-硫酸法中反应呈阳性。 初步药理实验表明：人胎盘小分子多肽的粗提物在体内具有较为显着的抗凝血作用。
刘旺旺[4]2016年在《羊胎盘提取残留物高质化利用研究》文中提出羊胎盘含有多种生物活性物质,具有抗氧化、降血糖、抗菌抗病毒和提高机体免疫力等多种生理功效。我国羊胎盘资源丰富,但是对羊胎盘的利用率不足3%,因此,以羊胎盘为原料进行综合开发利用具有积极的现实意义和广阔的市场前景。本文以羊胎盘提取残留物高质化利用为目的,首先对提取水溶性物质后的羊胎盘残余物进行营养价值分析,然后采用产蛋白酶微生物黑曲霉、米曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌对其进行发酵酶解并对产物的生物活性进行研究,得到了抗氧化和免疫活性肽的最佳制备工艺并对产物的稳定性和各组分的含量与活性进行研究。主要结果如下:(1)羊胎盘提取水溶性物质后的残余物进行营养价值分析:羊胎盘提取残余物是一种优质的蛋白,其蛋白质功效比(PER值)为1.27,干基总蛋白含量为97.67%,其中氨基酸含量依次为:谷氨酸(10.24%)、甘氨酸(9.51%)、天门冬氨酸(6.56%)、精氨酸(5.65%)、亮氨酸(5.46%)、脯氨酸(5.41%)。氨基酸组成合理,其第一限制性氨基酸为异亮氨酸和缬氨酸,两者的氨基酸评分均为0.71。(2)采用4种产蛋白酶微生物发酵羊胎盘提取残余物制备具有抗氧化和免疫增殖活性的酶解产物。结果表明,四种微生物在各自适宜的发酵温度和发酵pH条件下以黑曲霉的多肽产率29.67%最多,依次是枯草芽孢杆菌27.58%,地衣芽孢杆菌26.04%,米曲霉24.3%;考察产物的生物活性,其中以黑曲霉发酵产物的抗氧化活性最高,枯草芽孢杆菌发酵产物的免疫细胞增殖活性最高。(3)黑曲霉发酵酶解羊胎盘提取残留物制备抗氧化肽的最优工艺条件为:接种量5%、发酵温度30℃、料液pH 5.6、碳源2.8%、发酵时间76.4 h,所得的发酵液DPPH·清除率83.78%,多肽得率为30.90%;枯草芽孢杆菌发酵羊胎盘提取残留物制备免疫活性肽的最优工艺即料液发酵温度37℃、pH 5.4、碳源1.7%、发酵时间43.5h,进行验证试验,测得酶解产物的刺激指数达到了24.38%,多肽得率27.89%。(4)研究发酵产物多肽的活性和体外的稳定性,分别研究了产物的量效关系,pH值的影响,干燥方式、体外模拟消化。抗氧化肽的自由基清除率随着浓度的升高逐渐增大,相同浓度下对自由基的清除能力要稍高于(谷胱甘肽)GSH的清除能力。免疫活性肽蛋白浓度在6.25-200μg/mL范围内对小鼠脾脏淋巴细胞具有明显的增殖作用,在低于100μg/mL浓度时,随着发酵液蛋白浓度的增加,刺激指数随之增加,在浓度100μg/mL浓度时淋巴细胞的增殖率达到23.25%。抗氧化肽在pH5-8范围内,活性较稳定,过酸或者过碱的环境中产物活性下降;干燥方法对产物的活性没有产生太大影响,黑曲霉酶解产物的活性保持分别为97.6%和91.7%,对枯草芽孢杆菌酶解产物免疫保持90%以上。模拟胃液、肠液中,发酵酶解产物的抗氧化活性保持率优于免疫活性;当胃液消化150 min时,产物对DPPH·清除率为50.88%,对·OH清除率为50.39%,其活性保持率分别为64.45%和58.46%;当肠液消化300 min时,其清除率保持分别为53.87%和63.18%,活性保持率分别为68.28%和73.13%,模拟胃液和肠液消化中免疫活性保持活性保持了44.61%和52.89%。(5)以抗氧化性和体外免疫性为考察指标,对产物各超滤组分的体外生物活性进行了分析探究。结果表明,具有较高抗氧化能力的组分YT-Ⅰ(<3 KDa)、YT-Ⅱ(3 KDa-10 KDa)占黑曲霉发酵酶解蛋白总量的61.4%超过50%,可见分子量少于10 kDa的低分子蛋白组分对羊胎盘提取残余物的抗氧化活性起着主要的贡献,多肽含量分布满足函数关系方程的曲线y=0.0006X2-0.0932X+3.1345;枯草芽孢杆菌的发酵酶解组分中MT-Ⅰ(<3 KDa)、MT-Ⅱ(3 KDa-10 KDa)占总量的85%,MT-Ⅱ(3 KDa-10 KDa)对酶解产物的免疫增殖能力起到重要作用,MT-Ⅰ(<3 KDa)具有较高的抗氧化活性,MT-Ⅱ(3 KDa-10 KDa)与MT-Ⅰ(<3KDa)在免疫细胞增殖方面具有一定的协同增殖效应。
任兴宏[5]2010年在《羊胎盘免疫活性小分子肽的分离纯化》文中研究表明胎盘是哺乳类胎生动物在妊娠时为胎儿供应养分,供胚胎生长的特殊器官。其组织细胞内含有丰富的类固醇激素,肽类激素,前列腺素,生长因子,细胞因子等胎儿生长所需的物质成分。自从1943年日本京都医院山岛教授从羊胎盘中成功地提取出羊胎素后,对羊胎盘提取液的研究引起了广大学者的浓厚兴趣。近年来研究发现,羊胎盘提取液中富含包括小分子肽类的多种生物活性物质。但是对羊胎盘提取液中功能组分的纯化、功能组分的组成研究的相关报道甚少。本研究采用组织匀浆、反复冻融、冷冻离心、超滤的方法制备羊胎盘提取液；采用加脲的Tricine-SDS-PAGE电泳初步鉴定胎盘肽的存在；采用RP-HPLC逐级分离、纯化羊胎盘提取液肽组分,并采用E-玫瑰花环试验检测各肽组分的免疫活性；用Edman降解法测活性组分N末端氨基酸序列。其目的是通过超滤和反相高效液相色谱将结合的方法分离纯化出有免疫活性的胎盘肽,并对所纯化的羊胎盘肽的免疫活性进行分析和氨基酸序列鉴定,为进一步阐明其生物活性的作用机理和免疫活性小分子肽的进一步研发提供必要的依据。本实验的研究内容如下：1、采用组织匀浆、反复冻融和超滤相结合的方法制备羊胎盘提取液。2、对所制备的羊胎盘提取液进行理化性质鉴定,并采用Tricine-SDS-PAGE电泳方法鉴定羊胎盘肽是否存在。3、采用RP-HPLC方法对所制备的羊胎盘提取液逐一纯化得到纯度比较高的单一组分,并采用E-玫瑰花环实验对各个纯化物进行免疫活性检测。4、对免疫活性高且纯度较高的组分,采用Edman降解法测定N端氨基酸序列。实验结果：1、羊胎盘提取液均为无色或微黄色的透明液体,冷冻干燥后呈疏松多孔的海绵状白色粉末,其PH为6.40±0.02,蛋白质定性反应检测中颜色均变成紫红色,沉淀反应中蛋白质反应呈阴性,电泳结果显示羊胎盘提取液中含有小分子肽类物质,多肽含量为2.14±0.05mg/ml,在190-340nm范围内分别在212nm和253nm附近有两个吸收峰。2、RP-HPLC纯化出3个纯度较高的组分,分别为峰1-5、峰1-7、峰2-3,其纯度分别达到90.6%、91.4%、99.6%。3、通过E-玫瑰花环实验对3个纯度较高组分的活性测定表明峰1-5、峰2-3有免疫活性。Edman降解法测得峰2-3的N端的前10个氨基酸序列为：Trp-Glu-Pro-Asn-Val-Ser-Ala-His-Ala-Phe,将该段氨基酸序列登录美国国立生物技术信息中心,应用BLAST检索工具进行短序列匹配的蛋白质数据库检索,发现没有与此多肽同源的序列,为一新的多肽。该多肽的免疫功能稳定性及其作用机制尚需要进一步的研究。结论：(1)采用反复冻融结合超滤方法获得PH6.40±0.02、多肽含量为2.14±0.05mg/ml羊胎盘提取液。(2)利用RP-HPLC逐级分离纯化羊胎盘提取液,纯化峰1-5、峰1-7、峰2-3叁个肽组分,其肽纯度分别为90.6%、91.4%、99.6%。E-玫瑰花环试验检测发现峰1-5、峰2-3组分具有增强脱受体的淋巴细胞恢复其表面受体的功能,促进人外周血T淋巴细胞E玫瑰花环形成,并具有剂量效应依赖关系,表明两个纯化组分具有T细胞免疫活性。(3) Edman降解法测定峰2-3组分的氨基酸测序,发现N端前十个氨基酸序列为Trp-Glu-Pro-Asn-Val-Ser-Ala-His-Ala-Phe,经Blast蛋白质数据库检索发现该多肽为一个新的多肽。
房新平[6]2007年在《牛胎盘免疫活性肽提取与酶法制备研究》文中认为牛胎盘含有丰富的生物活性物质,是乳品企业开发利用的重要资源。对其它来源的免疫活性肽已经有广泛的研究,但对牛胎盘免疫活性肽的开发利用研究不多。因此有必要对牛胎盘免疫活性肽进行分离纯化,并深入探讨牛胎盘免疫活性肽的理化性质,体内外的免疫作用,为牛胎盘及其免疫活性肽的开发利用提供理论基础。本论文首先研究了不同提取缓冲液、提取方式和提取条件对牛胎盘水溶性蛋白提取率的影响。确定磷酸盐缓冲液在一次提取条件下的最佳提取参数是温度20℃,时间2h, pH 7.2,料液比1:2 (w/v)。应用超滤在操作压力0.10MPa和操作时间60min以及纳滤在压力0.6MPa和时间90min的条件下对提取的蛋白质溶液进行分离,纳滤分离得到的产物得率为299.4mg/100g原料(湿基以蛋白质计)。纳滤产物经活性检测表明具有显着的免疫调节活性。依据淋巴细胞增殖实验作为筛选具有免疫调节活性成分的手段,对纳滤产物中具有免疫调节活性的肽进行DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换色谱、Sephadex G-25体积排阻色谱以及Sephasil C18反相高效液相色谱的纯化,得到具有显着的促进淋巴细胞增殖能力的反相层析组分4。该组分利用反相色谱和毛细管电泳鉴定为单一峰,证明其为纯品。对具有免疫调节活性的反相层析组分4的结构、理化性质和贮藏稳定性进行研究。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱、毛细管等电聚焦和蛋白质测序仪分别测得相对分子质量为2134、等电点为3.82、部分氨基酸序列为Tyr-X-Phe-Leu-Gly-Leu-Pro-Gly-X-Thr;含糖性质和紫外光谱确定为不含有糖成分的肽;在温度为-20℃时可以贮藏6个月;处理温度≤40℃和pH6-10时具有显着的促进淋巴细胞增殖活性;对胃蛋白酶和胰蛋白酶水解不稳定;红外光谱和圆二色谱法确定含有螺旋、折迭、转角以及无规卷曲构象的吸收特征,并且随着处理温度的逐渐提高,其组成不断变化。根据保健食品功能学评价程序和检验方法的免疫功能指标的评价手段,对不同剂量的牛胎盘水溶性免疫活性肽免疫功能的量效关系进行了测定。结果表明,在500mg/kg、50mg/kg和5mg/kg叁个剂量,对于正常小鼠组,各给药组小鼠的血清溶血素值、巨噬细胞的吞噬功能和T淋巴细胞增殖活性比阴性对照组明显增强(P<0.01);对于免疫功能低下小鼠组,各给药组小鼠在脾脏指数、胸腺指数、细胞免疫、体液免疫和单核-巨噬细胞免疫方面比模型对照组得到提高,缓解了小鼠免疫力低下的症状。对于提取水溶性免疫活性肽后富含蛋白质的牛胎盘剩余物料,研究了酶法制备具有免疫调节活性的多肽以及酶解产物在微生物培养基中的应用。采用混合酶(中性蛋白酶和胰蛋白酶)在温度46.4℃,pH8.17,酶比1:1,料水比为1:3,总酶量4000u/g的最佳水解条件下对物料进行水解,得到具有显着的促进淋巴细胞增殖活性的酶解产物。经RP-HPLC分离纯化酶解产物得到的组分7免疫调节活性最高,其氨基酸序列为Gly-Gly-Ser-Thr或Gly-Gly-Thr-Ser。此外,活性炭脱色的酶解产物制备成替代蛋白胨,应用到微生物培养基中。啤酒酵母在该蛋白胨培养基与沙氏培养基上的生长曲线相仿,延滞期、指数期、稳定期几乎都在同一时段内,而且吸光值非常接近;大肠杆菌在该蛋白胨培养基与肉汤培养基上的生长也较接近。牛胎盘酶解产物作为替代蛋白胨具有很好的应用前景。
姜惠敏[7]2016年在《羊胎盘抗氧化肽的制备及其在抗衰老化妆品中的应用》文中指出随着自由基理论的发展和活性氧的进一步研究,“抗氧化”和“抗衰老”已经成为化妆品行业关注的热点。抗氧化肽具有安全稳定、易溶于水、易吸收、分子量小,同时具有清除自由基、螯合金属离子等优点,在化妆品领域有很大的开发潜力。羊胎盘中含有丰富的营养物质,是优质的蛋白质资源。我国羊资源丰富,但羊胎盘的加工利用率不到3%,羊胎盘下脚料作为羊胎盘提取水溶性活性肽的废弃物,蛋白质含量高,氨基酸组成丰富,可作为制备多肽的蛋白资源。为实现羊胎盘的高值化利用,本文以羊胎盘下脚料为原料,通过酶解法制备抗氧化肽、进一步分离纯化,并通过人体实验评价其在化妆品中的抗衰老性能。主要内容如下:(1)收集经组织匀浆、反复冻融和低温离心所得的羊胎盘下脚料,冷冻干燥后过60目筛网得到羊胎盘下脚料粉末,其蛋白含量为81.41%,多糖含量为16.84%。羊胎盘粉有一定的抗氧化能力,清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的IC50分别为5.4 mg/mL、2.88 mg/mL和15.2 mg/mL。(2)以DPPH?清除率和水解度为考察指标,筛选出木瓜蛋白酶为酶解羊胎盘下脚料的最适蛋白酶。通过单因素试验以及响应面法优化了酶解羊胎盘下脚料的工艺参数,得到最佳酶解工艺为:pH 6.4、温度55℃、加酶量4900 U/g、底物质量浓度33 mg/mL、水解时间120 min,此时水解度为7.92%,制备得到的羊胎盘酶解肽SPHs在10 mg/mL下,DPPH?清除率(DRSA),超氧阴离子自由基清除率(SRSA)和羟基自由基清除率(HRSA)分别为92.15%、93.45%和48.88%。(3)采用DA201-C型大孔吸附树脂对SPHs进行除糖脱盐处理,50%乙醇溶液洗脱得到的产物SPH-I多糖去除率达到82.85%。SPH-I经过超滤、Sephadex G-10凝胶层析色谱、反相高效液相色谱RP-HPLC分离纯化,得到DRSA最高的组分S12-2。在浓度为50 ug/mL时DRSA达到32.52%。用MALDI-TOF-MS对S12-2组分进行结构鉴定和氨基酸序列测定,得到一种由六个氨基酸组成的新肽,序列为Glu-Pro-Val-Ser-His-Phe,相对分子量为678.6。(4)选用通过Sephadex G-10凝胶色谱分离得到的S12组分,评价其在化妆品中的抗衰老功效。配制含1%、2%、3%、4%和5%S12的护肤乳液和护肤霜,双盲测试,在60天内连续监测受试者角质层含水量、皮肤水分流失量(TEWL)和弹性的变化。结果表明,使用添加S12的润肤乳液60天后,角质层含水量增长了27,皮肤TEWL降低了12 g/m2h,弹性系数R升高了38%。感官测试结果表明,添加S12的眼霜的吸收性、滑爽感、柔软感和水润感均优于同含量的谷胱甘肽产品及空白产品。连续涂抹含S12的眼霜60天后,能明显淡化眼周的细纹。
李小梅[8]2016年在《猪胎盘肽冻干粉的制备及功效考察》文中研究说明猪胎盘(Pig Placenta)是富含多种生物活性成分的优质动物药资源,具有调节内分泌、增强免疫力、防治阿尔兹海默症、抗氧化、增强记忆力等功效,但目前常被废弃,有关猪胎盘的研究鲜见报道。本实验以猪胎盘为原料,利用组织匀浆、反复冻融相结合的方法提取猪胎盘肽,优化猪胎盘肽冻干粉制备工艺及功效评价,旨在为猪胎盘肽的充分合理利用提供科学依据。具体研究内容如下：1.猪胎盘肽的提取和分析利用组织匀浆、反复冻融相结合的方法提取猪胎盘成分,并鉴别其基本性质,采用SDS-PAGE电泳方法鉴别猪胎盘肽,建立RP-HPLC色谱条件分析猪胎盘提取物。实验结果为猪胎盘提取液为微黄色透明液体,其pH为6.70；电泳结果：猪胎盘提取液含有相对分子量为74.4 kDa,61.16 kDa,43.39 kDa,14.52 kDa分子肽；提取液多肽含量为6.050 mg.ml-1;在200-600 nm范围内在260.5 nm处有最大吸收峰。RP-HPLC色谱条件：色谱柱：Symmetry C18(5μm,4.6×250mm)；流动相：60%乙腈-水,梯度洗脱：乙腈：0-15min 10%～20%,15～20 min 20%～25%;柱温：25℃；流速：0.5 ml.min-l;检测波长：260.5 nm;进样量：10μl,RP-HPLC分析呈现12个峰,初步认定含有人血白蛋白、免疫球蛋白、免疫调节因子、羊胎盘肽等功效成分。2.猪胎盘肽冻干粉的制备及稳定性考察以外观、复水性、多肽含量为考察指标,通过单因素考察,确定最佳冻干保护剂为4%蔗糖,冻干时间为30 h,药液体积为3 m1。以多肽含量为考察指标,对冻干保护剂浓度、冻干时间、药液体积叁种因素进行星点设计-响应面法优化工艺,确定对猪胎盘肽多肽含量影响程度大小顺序为药液体积>蔗糖浓度>冻干时间,最佳工艺为4.35%蔗糖、冻干时间为30 h、药液体积为3.41 ml,此时多肽含量最大,为6.05016 mg.ml-1。经稳定性实验,猪胎盘肽冻干粉在高温高湿和光照条件下不稳定,所以要密封干燥低温避光保存。3.猪胎盘肽功效考察测定猪胎盘肽冻干粉体外清除DPPH·自由基、超氧阴离子自由基(O2-)、羟基自由基(·OH-)的活性,结果表明猪胎盘肽冻干粉具有清除DPPH·、O2-、·OH-活性,且清除自由基活性与维生素C清除自由基活性相当。猪胎盘肽冻干粉作用于经过D-半乳糖诱导的衰老小鼠,给药后每周末称量小鼠体重；停药前一周采用Morris水迷宫法检测小鼠学习记忆能力。第六周末处死小鼠,以皮肤含水率及超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(Hyp)的含量为考察指标,并观察病理切片。结果表明：与正常组相比,模型组小鼠逃避潜伏期明显延长,小鼠在平台象限内停留时间、停留时间百分比、穿越平台次数均减少(P<0.05)；小鼠体重、皮肤含水率、SOD含量、Hyp含量降低(P<0.01,P<0.05),MDA含量升高(P<0.01,P<0.05),病理检查结果为皮肤表皮不规则,真皮皱缩,胶原纤维排列紊乱；猪胎盘肽经皮给药后,与模型组相比,高、中剂量组小鼠逃避潜伏期缩短(P<0.05),高剂量组小鼠在平台象限内停留时间、停留时间百分比、穿越平台次数均增高(P<0.05)；高、中剂量组小鼠体重、皮肤含水率、SOD含量、Hyp含量均明显上升(P<0.01,P<0.05),MDA含量明显下降(P<0.01,P<0.05)；病理检查结果为猪胎盘肽高、中剂量组小鼠的皮肤结构较完整,表皮规则,真皮厚度增加,胶原纤维排列较整齐。
方廖琼[9]2005年在《羊胎盘免疫调节因子的免疫促进作用及其机理研究》文中研究说明根据药物对机体免疫功能的不同影响,免疫药理学家一般把免疫调节剂分为免疫增强剂和免疫抑制剂两大类。前者的效应特点是促进免疫功能,而后者则表现为对免疫应答的抑制。羊胎盘免疫调节因子是本室采用现代生物技术以山羊胎盘为原料制备的生物活性物质,初步活性分析发现其具有免疫增强活性。在分析总结目前国内外有关动物源性免疫活性肽免疫增强作用特点研究资料的基础上,本研究根据免疫增强剂药效学研究原则,系统地探讨羊胎盘免疫调节因子的免疫促进作用及其功能特点,并对其作用机理进行分析研究;进而,对进一步分离纯化的单一组分之一的羊胎盘肽–Ⅰ的免疫调节作用进行初步研究,为羊胎盘活性成分的深入研究和开发提供基础研究资料,为GPIF的申报提供临床前的研究资料,为GPIF的临床应用提供科学的实验依据,对GPIF功能组分的分离纯化和进一步的研究开发奠定基础。本研究共分四部分,分别就GPIF对BALB/c小鼠T细胞免疫功能、体液免疫功能和巨噬细胞免疫功能的促进作用进行系统研究,对GPIF免疫促进作用机理作部分探讨。在此基础上,对GPIF分离纯化的单组分之一GPIF–Ⅰ的T细胞免疫功能进行初步研究。第一部分,从体内、外两方面,建立环磷酰胺所致免疫抑制模型、~(60)Coγ射线辐射所致免疫抑制模型,探讨羊胎盘免疫调节因子对BALB/c小鼠T淋巴细胞免疫功能的促进作用及其作用机理。方法(1)体外,以正常T淋巴细胞、环磷酰胺所致免疫抑制T淋巴细胞、~(60)Coγ射线辐射所致免疫抑制T淋巴细胞为GPIF药效学研究模型,MTT法测定ConA诱导的T淋巴细胞的增殖反应;直接免疫荧光抗体标记,FACS分析脾T淋巴细胞、胸腺淋巴细胞表达CD3、CD4、CD8、CD28、CD152阳性细胞百分率;ELISA法测定T淋巴细胞培养上清IL2、IFN-γ水平,间接法测定IL4的活性;(2)体内,分别建立环磷酰胺、~(60)Coγ射线辐射所致免疫抑制动物模型,以耳片差重法测定GPIF对小鼠DTH反应能力的影响;建立60Coγ射线辐射所致免疫抑制动物模型,直接免疫荧光抗体标记、FACS分析GPIF对脾淋巴细胞、胸腺细胞表达CD3、CD4、CD8的影响,FACS分析GPIF对小鼠脾T淋巴细胞及其CD4~+、CD8~+亚群T淋巴细胞表达CD28、CD152的影响;ELISA法测定小鼠血清IL2、IFN-γ生成水平,间接
高垚垚[10]2018年在《猪胎盘抗衰老药效物质基础及相关作用机制研究》文中研究指明人胎盘是一种具有补肾益精、补血益气等功效的传统中药,但猪胎盘的相关研究却鲜有报道。猪为哺乳动物,猪胎盘容易获得,功效与人胎盘应具有相似和可比性。本实验对猪胎盘进行药效物质基础研究,以组织冻融法提取猪胎盘蛋白(Pig Placenta Protein,PPP)并制备其凝胶剂(Pig placenta protein gel,PPPG),考察其基本性质及功效,为猪胎盘的废物利用提供依据。主要研究内容及结果如下:1猪胎盘蛋白的提取及成分研究新鲜的猪胎盘组织先用机械粉碎法粉碎,再经冻融、匀浆、过滤得到PPP,冻干保存。测定其总蛋白含量,并采用薄层色谱(TLC)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)等分析方法对PPP的组成成分进行分析。结果表明:得到的PPP为浅黄色的透明溶液,冻干粉为乳白色絮状粉末;TLC 检测出 7 个斑点,Rf值分别为 0.06、0.08、0.23、0.27、0.34、0.47、0.54;紫外波谱扫描图谱显示其最大吸收波长为260 nm;微量元素分析结果为:PPP溶液中含有丰富的Ca、P、K、Mg、Zn、Fe等人体不可缺少的营养元素;红外光谱扫描结果显示其在3400 cm-1和1630 cm-1附近都有明显的振动峰;SDS-PAGE得到7个电泳条带,经MALDI-TOF MS鉴定,按照分子量从大到小的顺序依次为:葡萄糖调节蛋白78、热休克蛋白8、蛋白质二硫键异构酶A3前体蛋白、脯氨酰4-羟化酶β多肽、β细胞骨架肌动蛋白片段、醛糖还原酶、β血红蛋白亚基。2猪胎盘蛋白对小鼠体内DA含量的影响将正常小鼠和D-半乳糖诱导衰老的小鼠按不同剂量的PPP(高浓度:1g·kg-1·d-1,中浓度:0.5g·kg-1·d-1,低浓度:0.25g·kg-1·d-1)灌胃给药,给药35天后,通过脑组织和血液同步采样的方法,结合酶联免疫分析(ELISA)法检测各组小鼠脑组织和血液中多巴胺(DA)含量,考察其对体内DA能神经元的影响。实验数据表明:正常小鼠阳性对照组、PPP高、中、低浓度组的脑组织内DA水平与正常小鼠空白组比较分别显着增加了 58.0%(p<0.01),59.0%(p><0.01),37.6%(p<0.01)和30.2%(p<0.05);衰老小鼠的体内DA含量明显降低,阳性对照组、PPP高、中、低浓度组的脑组织内DA水平与模型组比较分别显着升高了 95.5%(p<0.01),101.3%(p<0.01),79%(p<0.01)和 67.1%(p<0.01)。正常小鼠阳性对照组、PPP 高、中、低浓度组的血液中DA含量与正常小鼠空白组比较分别增加11.9%(p<0.05),10.5%(p<0.05),6.2%(p>0.05)和3.2%(p>0.05);衰老小鼠阳性对照组、PPP高、中、低浓度组小鼠的血液中DA含量与模型组比较分别增加了 30.1%(p<0.01),15.7%(p<0.05),8.8%(p<0.05)和 5.5%(p>0.05)。3猪胎盘蛋白凝胶剂的制备及其功效考察将12 g盐酸化壳聚糖加到25 mL纯化水中,溶胀溶解形成凝胶液;向132 g PPP冻干粉中加入25 mL纯化水形成溶解液;凝胶液和溶解液合并均质2 min,加入6g甘油再均质2 min即得PPP凝胶剂。测定PPP凝胶的粘度、pH、总蛋白浓度等指标,扫描电子显微镜(SEM)观察凝胶剂的结构。将PPP凝胶涂抹于D-半乳糖诱导衰老的小鼠和深Ⅱ度烫伤的大鼠皮肤,给药35天后,通过HE染色法考察PPP凝胶对各组动物皮肤组织中表皮形态和厚度的影响,同时采用RT-PCR检测皮肤组织中Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平。结果表明:制备的PPP凝胶为均匀、细腻的黄色半固体物质,粘度为(4.5±0.1)Pa-s、pH为6.6～6.9,总蛋白含量为5%,易涂布、易清洗,符合凝胶制剂要求。皮肤组织切片表明PPP凝胶能使衰老和烫伤动物的整体及创伤处皮肤表皮厚度增加;RT-PCR显示PPP凝胶剂组的动物皮肤组织中I型前胶原mRNA表达均明显升高(p<0.05)。本实验提取和鉴定了猪胎盘中可增强细胞活力和人体免疫功能的蛋白类物质,确认其与猪胎盘提取物明显的抗氧化抗衰老作用相关,显示其在保健和医药领域的应用价值和应用前景,值得借鉴。
参考文献：
[1]. 奶山羊胎盘抗氧化多肽制备及其功能活性研究[D]. 高闪闪. 西北农林科技大学. 2017
[2]. 猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究[D]. 师玉淼. 浙江农林大学. 2013
[3]. 人胎盘多肽的分离纯化及其活性的初步研究[D]. 白玉. 沈阳药科大学. 2003
[4]. 羊胎盘提取残留物高质化利用研究[D]. 刘旺旺. 华南农业大学. 2016
[5]. 羊胎盘免疫活性小分子肽的分离纯化[D]. 任兴宏. 西南大学. 2010
[6]. 牛胎盘免疫活性肽提取与酶法制备研究[D]. 房新平. 江南大学. 2007
[7]. 羊胎盘抗氧化肽的制备及其在抗衰老化妆品中的应用[D]. 姜惠敏. 江南大学. 2016
[8]. 猪胎盘肽冻干粉的制备及功效考察[D]. 李小梅. 扬州大学. 2016
[9]. 羊胎盘免疫调节因子的免疫促进作用及其机理研究[D]. 方廖琼. 第叁军医大学. 2005
[10]. 猪胎盘抗衰老药效物质基础及相关作用机制研究[D]. 高垚垚. 扬州大学. 2018