刘春霞[1]2004年在《马皮肤成纤维细胞体外培养与异质克隆胚构建》文中指出本研究用不同的方法体外培养成年马皮肤成纤维细胞，将获得的成纤维细胞经血清饥饿培养后，作为核供体移入去核牛卵母细胞透明带下，电融合后，构建重组胚。马皮肤成纤维细胞的分离与体外培养。经试验获得：在37℃、5%CO2、饱和湿度下，小组织块直接培养法和酶消化法均可获得马皮肤细胞，但在酶法中，以100IU -150IU/ml胶原酶Ⅰ的DMEM消化效果最佳；酶消化法和反复贴壁法可分离纯化马皮肤成纤维细胞；在37℃下，TE消化原代或传代细胞4min，可得到较理想的传代细胞；用D-Hanks为缓冲液配制的消化酶更适合马皮肤成纤维细胞的消化；含10%NCS的DMEM和DMEM+F12(1:1)培养液适宜于马皮肤成纤维细胞体外生长，一定浓度的cGMP（0.2mM）和Insulin（20μg/ml）能促进该细胞的增殖；获得了马皮肤成纤维细胞的生长曲线；并发现至少在传至第12代时有81.3%的染色体还保持正常的倍数（2n=64）；含10%DMSO和20%NCS的DMEM冻存液，对马皮肤成纤维细胞的冻存效果好。从冷冻方法来看，程序冷冻法优于手工冷冻法(P﹤0.05)。马成纤维细胞与牛卵母细胞构建克隆胚。经试验获得：5mM离子霉素、A23187和7%乙醇联合6-DMAP均能有效地激活牛卵母细胞，并支持其发育到囊胚，但离子霉素激活效率显着优于其它两种（P﹤0.05）；以SOFaa+10%FBS+颗粒细胞为发育微环境培养激活的成熟卵母细胞可得到较高的卵裂率和囊胚率（72.30%，14.91%）；颗粒细胞与卵母细胞共培养能促进重组胚的发育；带下注射结合电融合能得到融合的重构胚，交流电脉冲起始电压20V，持续时间10s，频率0.2MHz，2次脉冲，结束电压15V，融合电压间隔0.125s，在融合电压为2.0kV/cm，脉冲时间为40μs时，重组胚融合率及卵裂率最高（52.27%，71.74%）；重组胚在体外能发育到8-细胞期。
李宝山[2]2007年在《马体细胞与牛卵母细胞和绵羊卵母细胞异质克隆胚的构建及其发育能力的比较》文中提出本试验用不同的方法体外培养马皮肤成纤维细胞,以其作为核供体构建了马体细胞-绵羊卵母细胞和马体细胞-牛卵母细胞两种重组胚,并对其早期发育进行了研究。马皮肤成纤维细胞的分离培养:在37℃、5%CO2、饱和湿度下,10%FBS的DMEM/F12培养液适宜于马皮肤成纤维细胞体外培养,小组织块直接培养法比酶消化法更易获得马皮肤成纤维细胞,经4次消化传代培养后,分离纯化了马皮肤成纤维细胞,并发现至少传至第10代时有76.3%的染色体还保持正常的二倍体倍性(2n=64)。绵羊卵母细胞孤雌激活:绵羊卵母细胞在用离子霉素联合6-DMAP的化学激活时,其卵裂率为81.68%,囊胚发育率为34.43%,优于在激活电压1300v/cm,脉冲时间为10μsec,脉冲次数为2次,间隔0.5s的条件下,卵裂率为74.22%,囊胚率为29.69%的电激活效果。经盲吸去核,带下注射结合电融合构建重组胚。两种重组胚在1580v/cm融合电压下,融合率和卵裂率最高:马-牛重组胚融合率为49.01%,卵裂率为55.65%;马-绵羊重组胚融合率为55.36%,卵裂率为58.06%。马-牛重组胚发育到早期桑椹胚,而马-绵羊重组胚发育到囊胚期,经胚胎染色体检查重组胚染色体数目和形态同马成纤维细胞染色体相同,说明马体细胞可以与绵羊的卵母细胞构建重组胚。
刘春霞, 王文龙, 周欢敏[3]2006年在《牛卵母细胞孤雌激活及马-牛异质克隆胚构建》文中进行了进一步梳理首先用不同的激活剂孤雌激活体外成熟培养的牛卵母细胞,经试验获得:离子霉素、A23187和7%乙醇联合6-DMAP可有效地激活牛卵母细胞,并支持其发育到囊胚,但离子霉素激活效率显着优于其他两种(P<0.05);以10%FBS+SOFaa+颗粒细胞为发育体系培养激活的成熟牛卵母细胞可得到较高的卵裂率和囊胚率(72.30%,14.91%)。其次,通过体外培养成年马皮肤成纤维细胞,将获得的成纤维细胞经血清饥饿培养后,作为核供体移入去核牛卵母细胞透明带下,电融合后,能得到融合的马牛重构胚,在交流电脉冲起始电压20V,持续时间10s,频率0.2MHz,结束电压15V,2次脉冲和融合间隔为0.125s的条件下,当融合电压为2.0kV/cm,脉冲时程为40μs时,重组胚的融合率和卵裂率最高(52.27%,71.74%)。
赵高平[4]2011年在《马体细胞核移植的研究》文中研究指明体细胞核移植技术为家畜快速繁育和基因组保存提供了新的机遇和方法。在我国,这项技术在牛羊等家畜的繁育上已得到应用,但在马的繁殖上还很少开展这方面的研究。本研究以纯血马的体细胞为供核细胞,分别以马和驴的卵母细胞为胞质受体构建同种和异种体细胞核移植胚,建立了马的体细胞培养体系及马和驴卵母细胞的体外成熟培养体系,并对胚胎的体外培养、手术法移植早期异构克隆胚到受体马输卵管进行了相关的研究。1.马体细胞系的建立本研究通过对马腿部皮肤组织的体外培养、冻存和复苏的实验研究,建立了马成纤维细胞的培养和保存体系。2.马体细胞核移植胚的构建通过对马卵母细胞两种采集方法的对比,发现切割法比抽吸法更适合马卵母细胞的收集,可获得较高的回收效率。以M199和DMEM/F12为基础培养液用于马卵母细胞的体外成熟培养,结果显示成熟率差异不显着。扩展型(Ex) COCs体外培养24-28小时和紧凑型(Cp) COCs体外培养30-36小时后成熟率分别达到65.2%和42.9%,两种类型COCs成熟后的MⅡ期卵母细胞且具有相同的发育能力。马体细胞核移植实验中发现140V,20Us, 2次脉冲的条件可获得较高的融合效率,融合率达72.5%。采用Ionomycin与6-DMAP和CHX联合激活,重构配的卵裂率为41.9%。3.马-驴异种核移植胚的构建本实验分别采用M199培养液,DMEM/F12培养液和由M199培养液与DMEM/F12培养液按1:1混合组成的培养液作为驴卵母细胞的体外成熟基础培养液,最终成熟率差异不显着(p>0.05),并且这叁种成熟液驴卵母细胞的孤雌激活和发育无显着影响。提高成熟液中钙离子的浓度不能有效提高驴卵母细胞体外成熟和孤雌激活的效率。驴的COCs同马的COCs相似也分为扩展型(Ex) COCs和紧凑型(Cp) COCs,两种类型的COCs分别成熟培养30-36小时和24-28小时后获得MⅡ期卵母细胞的效率分别为75.9%和55.2%。驴卵母细胞在室温下放置于EH培养液中12小时内对卵母细胞的体外成熟率无显着影响。长时间(20-22小时)的运输卵巢、卵母细胞或是使用简易便携式培养系统在运输途中成熟培养驴卵母细胞都不利于卵母细胞的成熟,但后两种方法的成熟效率高于前一种方法。SOFaa和DMEM/F12都可用于驴的胚胎体外培养,差异不显着(p>0.05)。提高发育液中葡萄糖的浓度可促进胚胎的发育,但差异不显着。以马皮肤成纤维细胞和去核的驴卵母细胞胞质体构建马-驴异种核移植胚胎,在融合参数为130-150V,20Us,2次脉冲时可获得较高的融合率,融合率为60-70%,采用Ionomycin与6-DMAP和CHX联合激活,重构配的卵裂率为48.4%。共移植了46枚早期马-驴异种核移植胚胎到5匹受体马的输卵管中,90天检测均未建立妊娠。
参考文献：
[1]. 马皮肤成纤维细胞体外培养与异质克隆胚构建[D]. 刘春霞. 内蒙古农业大学. 2004
[2]. 马体细胞与牛卵母细胞和绵羊卵母细胞异质克隆胚的构建及其发育能力的比较[D]. 李宝山. 内蒙古农业大学. 2007
[3]. 牛卵母细胞孤雌激活及马-牛异质克隆胚构建[J]. 刘春霞, 王文龙, 周欢敏. 细胞生物学杂志. 2006
[4]. 马体细胞核移植的研究[D]. 赵高平. 内蒙古农业大学. 2011