莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）细胞核转化体系的构建及两种外源蛋白的表达研究

论文摘要

莱茵衣藻是一种成熟的模式生物,其细胞核、线粒体、叶绿体三套基因组都可以进行遗传转化,具有培养条件简单、生长速度快、光合效率高等优点,基于细胞核转化体系可构建生产高附加值蛋白的“衣藻生物反应器”,具有广阔的应用前景。本课题首先构建莱茵衣藻细胞核转化体系,研究环形质粒的转化,成功表达人表皮生长因子（EGF）蛋白,再研究线性质粒的转化,解析单酶切条件及线性质粒共转化,为“衣藻生物反应器”提供了理论基础和试验指导。（1）通过研究衣藻核转化的关键因素,成功构建莱茵衣藻细胞核转化体系。衣藻培养条件:接种比为1%,培养温度20℃,光暗周期为16h/8h,光照强度为12000Lx,摇床转速120r/min,培养5天达到对数生长中期,呈深绿色。衣藻核转化条件:采用对数生长中期的衣藻,最佳质粒用量为3μg,最佳涡旋振荡时间为20s,TAP固体培养基中博来霉素抗性筛选浓度为15μg/mL,TAP液体培养基中博来霉素抗性筛选浓度为5μg/mL。经PCR、RT-PCR检测,证明ble基因已经成功整合进入衣藻细胞核基因组中,并在转录水平上表达。（2）基于衣藻核转化体系的构建,探究人表皮生长因子基因（EGF）的转化及表达。首先按照衣藻细胞核密码子偏好性改造并合成EGF基因,成功构建pSP108-EGF双元表达载体,采用玻璃珠法转化、博来霉素抗性筛选,经PCR、Southern blot、ELISA检测转化情况。结果表明:试验获得3株阳性衣藻,EGF和ble基因均已成功整合进入核基因组,其中EGF基因均以单拷贝形式存在并且整合在衣藻核基因组的不同位点,3株阳性衣藻中表达的EGF蛋白浓度分别为19.4 pg/mL、17.1 pg/mL、19.7pg/mL。（3）探究玻璃珠法转化线性质粒。进行pSP108质粒单酶切试验制备线性质粒,采用玻璃珠法转化,经博来霉素抗性筛选、PCR及RT-PCR检测转化情况,对转化条件进行优化。结果表明:经BamHⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、SacⅠ单酶切制备的pSP108线性质粒均能成功转化,其中BamHⅠ单酶切的线性质粒转化率最高,ble基因成功整合进入莱茵衣藻核基因组,并且在转录水平表达。优化得到玻璃珠法转化线性质粒的条件:采用对数生长中期的衣藻,最佳质粒用量为4μg,最佳涡旋振荡时间为25s,最适博来霉素筛选浓度为15μg/mL。（4）研究线性质粒的共转化。首先按照衣藻细胞核的密码子偏好性改造并合成C反应蛋白基因（CRP）,成功构建pCRP载体,采用BamHⅠ单酶切制备pCRP、pSP108线性质粒,玻璃珠法进行转化,通过15μg/mL博来霉素抗性筛选。提取衣藻转化子的DNA,经PCR检测,结果表明ble及CRP基因均已成功整合进入衣藻核基因组之中,经RT-PCR检测,结果表明仅ble基因在转录水平表达,CRP基因可能出现了“基因沉默”现象。

论文目录

摘要

abstract

1 绪论

1.1 莱茵衣藻简介

1.2 莱茵衣藻细胞核转化体系

1.2.1 莱茵衣藻细胞核转化机理

1.2.2 莱茵衣藻细胞核转化技术

1.2.3 转基因衣藻的筛选

1.2.4 莱茵衣藻细胞核转化的主要影响因素

1.3 莱茵衣藻细胞核转化体系的应用

1.3.1 药用蛋白的表达

1.3.2 功能蛋白的表达

1.3.3 功能酶的表达

1.4 本课题表达的外源蛋白

1.4.1 人表皮生长因子（EGF）蛋白

1.4.2 C反应蛋白（CRP）

1.5 立题背景和意义

1.6 主要研究内容及技术路线

1.6.1 主要研究内容

1.6.2 技术路线

2 莱茵衣藻细胞核转化体系的构建

2.1 材料和仪器

2.1.1 试验材料及培养条件

2.1.2 试验仪器

2.1.3 试验试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 引物设计

2.2 试验方法

2.2.1 pSP108质粒的提取

2.2.2 pSP108质粒的鉴定

2.2.3 莱茵衣藻生长曲线的测定

2.2.4 玻璃珠法转化条件探究

2.2.5 莱茵衣藻转化子筛选

2.2.6 衣藻转化子DNA的提取

2.2.7 衣藻转化子的PCR检测

2.2.8 衣藻转化子的RT-PCR检测

2.3 结果与讨论

2.3.1 pSP108质粒的提取

2.3.2 pSP108质粒的鉴定

2.3.3 玻璃珠法转化条件的确定

2.3.4 衣藻转化子的博来霉素最适筛选浓度

2.3.5 衣藻转化子的PCR检测

2.3.6 衣藻转化子的RT-PCR检测

2.4 本章小结

3 人表皮生长因子（EGF）基因的转化与表达

3.1 材料及仪器

3.1.1 试验材料

3.1.2 试验仪器

3.1.3 试验试剂

3.1.4 引物设计

3.2 试验方法

3.2.1 EGF基因的克隆

3.2.2 pSP108-EGF双元表达载体的构建

3.2.3 玻璃珠法转化p SP108-EGF载体

3.2.4 衣藻转化子的筛选及DNA提取

3.2.5 衣藻转化子的PCR检测

3.2.6 衣藻转化子的Southern blot检测

3.2.7 衣藻转化子的ELISA检测

3.3 结果与分析

3.3.1 pSP108-EGF双元载体的鉴定

3.3.2 衣藻转化子的PCR检测

3.3.3 衣藻转化子的Southern blot检测

3.3.4 EGF蛋白含量测定

3.4 本章小结

4 莱茵衣藻玻璃珠法转化线性质粒

4.1 材料及仪器

4.1.1 试验材料

4.1.2 试验仪器

4.1.3 试验试剂

4.2 试验方法

4.2.1 pSP108质粒的提取

4.2.2 单酶切制备线性质粒

4.2.3 玻璃珠法转化线性质粒

4.2.4 衣藻转化子的筛选及DNA提取

4.2.5 衣藻转化子的PCR检测

4.2.6 衣藻转化子的RT-PCR检测

4.2.7 玻璃珠法转化线性质粒条件优化

4.3 结果与分析

4.3.1 线性质粒的转化结果分析

4.3.2 单酶切试验结果及PCR检测

4.3.3 衣藻转化子的RT-PCR检测

4.3.4 玻璃珠法转化线性质粒条件优化

4.4 本章小结

5 C反应蛋白（CRP）基因的转化与表达

5.1 材料及仪器

5.1.1 试验材料

5.1.2 试验试剂

5.1.3 试验仪器

5.1.4 引物设计

5.2 试验方法

5.2.1 CRP基因的克隆

5.2.2 表达载体p CRP的构建

5.2.3 线性质粒的制备

5.2.4 玻璃珠法转化线性质粒

5.2.5 衣藻转化子的筛选及DNA提取

5.2.6 衣藻转化子的PCR检测

5.2.7 衣藻转化子的RT-PCR检测

5.3 结果与分析

5.3.1 pCRP质粒的提取

5.3.2 pCRP质粒的鉴定

5.3.3 衣藻转化子的筛选

5.3.4 衣藻转化子的PCR检测

5.3.5 衣藻转化子的RT-PCR检测

5.4 本章小结

6 结论与展望

6.1 研究结论

6.2 创新点

6.3 展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文及研究成果

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄亚萍

导师: 王川

关键词: 莱茵衣藻,细胞核转化体系,玻璃珠法,线性质粒,人表皮生长因子,反应蛋白

来源: 四川轻化工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 四川轻化工大学

分类号: Q943.2

DOI: 10.27703/d.cnki.gsclg.2019.000015

总页数: 77

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莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）细胞核转化体系的构建及两种外源蛋白的表达研究

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