重组双加氧酶合成羟基异亮氨酸的转化系统与过程调控

论文摘要

4-羟基异亮氨酸（4-hydroxyisoleucine,4-HIL）是一种具有促进胰岛素分泌、调节血脂异常、促进脂肪代谢等功能的非蛋白质氨基酸,在治疗糖尿病方面具有潜在的价值。实验前期研究已从土壤中筛选获得一株含异亮氨酸双加氧酶（ido）基因的芽孢杆菌,并在大肠杆菌中克隆表达,构建了将L-异亮氨酸（L-isoleucine,L-ILe）一步催化合成4-HIL的重组菌。本研究基于重组IDO催化异亮氨酸羟基化的性质和条件对反应过程进行调控,扩大转化体系探究高底物浓度下的转化效率,进一步提高4-HIL的产量。其主要研究结果如下:（1）外源添加L-ILe,以重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28a-ido作为催化酶源,基于IDO催化异亮氨酸羟基化的生物转化条件,在摇瓶水平进行单因素优化,发现采用诱导16 h的静止态全细胞作为催化剂的转化效果最佳,且在α-酮戊二酸（α-KG）与底物摩尔浓度比为1:1,Fe2+2 g·L-1、Vc 5 mmol·L-1条件下,全细胞催化效率最好,在300mmol·L-11 L-ILe浓度下可一次催化生成190 mmol·L-1 4-HIL。（2）该催化反应是以细胞作为酶源,发酵结束后的菌体浓度一定程度上可以反映IDO酶量,为了获得更多的细胞以节约生产成本,对重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28a-ido发酵条件进行了优化。其中发酵培养基初始pH为7.0,接种量4%,以甘油作为碳源,且浓度为10 g·L-1时,发酵10 h后细胞活性最好,产物4-HIL的积累量最高。对乳糖诱导条件进行优化,确定其最佳条件为:乳糖浓度5 g·L-1、诱导温度45℃、乳糖加入时机12 h,诱导时长20 h,发酵结束后OD600可达12。利用3 L罐培养重组大肠杆菌,发酵24 h,菌体OD600达到44,细胞的催化效率保持在90%,成功利用乳糖替代IPTG诱导,弥补了IPTG价格昂贵且对细胞有毒害作用的缺陷。（3）结合摇瓶优化结果,对全细胞催化体系进行放大,在500 mL反应器上对重组菌的菌浓,搅拌速度进行单因素优化,对细胞进行冷冻处理,使得在300 mmol·L-1底物浓度下可生成250 mmol·L-1的4-HIL,相比摇瓶水平,4-HIL的产率提高了20%。继续增大底物浓度,通过后期补加辅底物α-KG,使得底物800 mmol·L-1下,可催化生成630mmol·L-1的4-HIL,其产率达到78%。在底物最大溶解度浓度下,对重组细胞进行分批次反应,以300 mmol·L-1底物作为反应浓度,经过3批次反应后,单批次催化生成4-HIL的浓度仍保持在220 mmol·L-1,解决了高底物浓度下产物产率低的问题,为全细胞大规模生产4-HIL奠定了基础。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张文丽

导师: 聂尧

关键词: 异亮氨酸,全细胞催化,羟基异亮氨酸,双加氧酶,过程调控

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

基金: 国家自然科学基金项目“Fe(Ⅱ),α-KG 依赖型双加氧酶催化游离氨基酸选择性羟基化的分子机制及其功能调控”,项目号:21676120

分类号: TQ922

总页数: 50

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