Phoma sp.XZ068的基因组分析及其杂萜产物的生物合成研究

论文摘要

真菌次级代谢产物作为药物先导化合物的重要来源,近年来成为药物研发的热点领域之一。本课题组前期从低温来源茎点霉属真菌Phoma sp.XZ068中获得了一系列具有环庚三烯酚酮-倍半萜骨架结构的杂萜类化合物,体外活性评价表明该类化合物具有良好的细胞毒活性,其中eupenifeldin对神经胶质瘤细胞的增殖具有显著的抑制活性,有望成为治疗神经胶质瘤药物的先导分子。为深入研究该类化合物的生物合成,本研究对产生菌Phoma sp.XZ068进行了全基因组测序及生物信息学分析,并在此基础上开展了 eupenifeldin类杂萜的生物合成研究。本研究基于Phoma sp.XZ068的全基因组数据对其基因组特征进行了描述,并分析预测了该菌株可能的生存策略,同时对该菌株次级代谢产物的生物合成基因簇进行了预测及转录验证,揭示了该菌株在大米培养基上合成的次级代谢产物结构类型较为丰富。在此基础上,结合生物信息学分析、基因敲除实验及发酵产物的化学分析,鉴定了 eupenifeldin的生物合成基因簇eup,并对簇内各基因的功能进行了预测及验证。通过体外酶学功能验证及体内基因高表达实验,对簇中与eupenifeldin前体化合物humulenol生物合成相关的两个基因eupE和eupD进行了验证,其中eupE负责前体化合物humulene的生物合成,而eupD则参与了humulene羟基化生成humulenol的反应过程。根据各基因功能的分析结果和前期分离得到的中间产物,初步预测了Phoma sp.XZ068体内eupenifeldin的生物合成途径。此外,通过体内基因高表达及转录验证,对eup基因簇中途径特异性调控基因eupR的正调控作用进行了初步验证。为进一步了解与eupenifeldin生物合成相关的次级代谢通路,本课题组对基因eupA的敲除株进行了化学研究,发现阻断eupenifeldin生物合成途径后,新产生了一系列具有十氢萘环的tetramic acid类化合物。为明确该类化合物的生物合成途径,本论文对其生物合成基因簇进行了鉴定,并初步推测该类化合物与eupenifeldin的生物合成存在底物竞争性抑制。综上所述,本论文提供了真菌Phoma sp.XZ068的全基因组数据及菌株特性的相关信息,并首次鉴定了 eupenifeldin类杂萜的生物合成基因簇,相关研究成果可以为该类杂萜的进一步理性设计和结构优化提供借鉴。同时,tetramic acid类化合物生物合成基因簇的鉴定,为下一步通过代谢网络调控实现Phoma sp.XZ068次级代谢产物的定向分离及结构优化提供了理论基础和依据。

论文目录

摘要

Abstract

第1章绪论

1.1 引言

1.2 真菌来源天然产物的研究现状

1.2.1 真菌来源活性天然产物简介

1.2.2 真菌来源天然产物的研究策略

1.3 茎点霉属真菌的研究概述

1.4 杂萜类天然产物的生物合成研究

1.5 研究意义及研究内容

1.5.1 选题依据及研究意义

1.5.2 研究内容及预期结果

第2章 Phoma sp. XZ068的全基因组测序及生物信息学分析

2.1 引言

2.2 实验材料与方法

2.2.1 菌株及引物

2.2.2 实验试剂、仪器及技术服务供应商

2.2.3 培养基及缓冲液的配制

2.2.4 月桂酸钠法提取真菌基因组DNA

2.2.5 PCR扩增体系及程序

2.2.6 真菌总RNA的提取及反转录PCR分析

2.2.7 基因组测序及组装

2.2.8 基因组组分分析

2.2.9 基因功能注释及分析

2.2.10 系统发育树的构建

2.2.11 次级代谢产物生物合成基因簇的预测

2.3 实验结果与分析

2.3.1 Phoma sp. XZ068的全基因组测序及拼装

2.3.2 Phoma sp. XZ068的基因组特征

2.3.3 Phoma sp. XZ068的系统发育分析

2.3.4 Phoma sp. XZ068的可能生存策略分析

2.3.5 Phoma sp. XZ068次级代谢相关基因分析

2.4 本章小结与讨论

第3章 Eupenifeldin类杂萜产物的生物合成研究

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 菌株、质粒和引物

3.2.2 实验试剂、仪器及技术服务提供商

3.2.3 培养基及缓冲液的配制

3.2.4 通用真菌基因组DNA的提取

3.2.5 DNA片段的PCR扩增和回收

3.2.6 序列分析

3.2.7 实时荧光定量PCR（Q-PCR）

3.2.8 大肠杆菌质粒的提取、感受态细胞的制备及转化

3.2.9 根瘤农杆菌化学感受态细胞的制备及转化

3.2.10 根瘤农杆菌AGL-1介导的真菌遗传转化（ATMT）

3.2.11 真菌发酵产物的提取及化学分析

3.2.12 His标签融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

3.2.13 EupB体外酶学功能验证

3.2.14 EupE体外酶学功能验证

3.2.15 EupD体外酶学功能验证

3.2.16 EupF体外酶学功能验证

3.3 结果与分析

3.3.1 Phoma sp. XZ068遗传操作体系的构建

3.3.2 Eupenifeldin生物合成基因簇的鉴定

3.3.3 Eupenifeldin生物合成基因簇内各基因功能预测

3.3.4 Eupenifeldin生物合成途径分析

3.4 本章小结与讨论

第4章 Tetramic acid类化合物生物合成基因簇的鉴定

4.1 引言

4.2 实验材料与方法

4.2.1 菌株、质粒和引物

4.2.2 实验试剂、仪器及技术服务提供商

4.2.3 培养基及缓冲液的配制

4.2.4 实验方法

4.3 结果与分析

4.3.1 Tetramic acid类化合物生物合成基因簇的预测

4.3.2 Tetramic acid类化合物生物合成基因簇的鉴定

4.4 本章小结与讨论

第5章总结与展望

5.1 本研究取得的成果

5.2 本研究尚未解决的问题及展望

参考文献

附录

致谢

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文章来源

类型: 博士论文

作者: 翟亚楠

导师: 刘杏忠,车永胜

关键词: 茎点霉属,基因组,基因簇,生物合成途径

来源: 中国科学技术大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,药学

单位: 中国科学技术大学

分类号: R914;Q78

总页数: 131

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