钱汐晶[1]2016年在《丙型肝炎病毒感染的抑制性分子筛选及作用机制研究》文中提出【研究背景与目的】丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球重要的公共卫生问题,影响着全世界约3%的人口,每年导致超过35万的死亡病例。HCV感染慢性化程度非常高,病程进展隐匿,终末期患者常伴有慢性肝疾病的发生,包括肝脂肪变性、肝纤维化,甚至发展为肝细胞肝癌。目前,并无有效的预防性或治疗性疫苗问世。早期治疗HCV感染一般采用聚乙二醇干扰素加利巴韦林,疗效在不同基因型中差别较大、治疗时限较长、不良反应较多。近几年,针对HCV生命周期中特定病毒蛋白的靶向性药物,又称直接作用的抗病毒药物(DAA)得到了飞速的发展,有效提高了治疗患者的持续病毒应答率(SVR)。然而,DAA的使用仍旧受到一些问题的限制,如耐药突变的产生、药物附带的一些不良反应、不可忽视的高昂治疗费用等。因此,对HCV感染过程的进一步研究,包括研制针对病毒生命周期不同阶段的新型药物,及解析病毒与宿主相互作用中的关键分子等,都将加深我们对HCV感染机制的认识,也为发展更高效、耐受性更好的抗HCV药物提供研究基础与助力。HCV的感染包括病毒颗粒的入侵、病毒基因组的翻译与复制、成熟病毒颗粒的组装与释放这些步骤。目前上市的DAA药物主要通过抑制病毒非结构蛋白的成熟或酶的活性进而阻断病毒复制的过程。然而,这些药物由于靶向高度变异的病毒成分,其基因屏障相对较低,且难以起到预防感染的作用,这也是HCV终末期患者肝移植后的病毒再感染率居高不下的一个原因。HCV入侵是一个高度协调的多步骤过程,包括病毒的非特异性结合、与靶细胞入侵相关受体的相互作用、病毒内吞入靶细胞及与宿主细胞间的膜融合。这个过程为抗HCV治疗提供了许多新的靶点,这些靶点由于多靶向宿主细胞成分,因此具有较高的基因屏障。由于入侵抑制剂干扰的是病毒生命周期最开始的阶段,此时病毒基因组并未释放,因此具有同时预防与治疗病毒感染的作用。入侵抑制剂与目前的抗HCV药物联合运用,即病毒生命周期多个阶段的靶向联合治疗,可能成为未来抗HCV治疗的一个主要方向。研发新型的覆盖多基因型的高效HCV入侵抑制剂十分必要。HCV的感染会引起宿主细胞内环境的改变,多种宿主因子的表达会发生变化。在这其中,一些分子表达水平的变化会进一步影响病毒的感染过程。增进对这类分子,尤其是具有抑制病毒感染作用分子的认识和研究,将大大促进抗HCV研究的发展。非编码RNA(nc RNA)早前被认为在细胞中并无实际功能。近几年,随着生物技术的发展及研究的深入,越来越多的非编码RNA被发现在各种的生理或病理过程中发挥着重要作用。其中对长度小于200 bp的微小RNA(mi RNA)的研究较多,它的作用方式和机制目前已经解析得较为透彻。在HCV感染中,较为熟悉的有mi R-122,它通过与病毒基因组5’UTR区域的相互作用促进病毒的复制,其抑制剂目前已进入临床试验阶段。我室之前也有报道mi R-221通过靶向干扰素通路抑制性分子来增加IFN的抗HCV的活性。然而关于长度大于200 bp长链非编码RNA(lnc RNA)的研究仍处于初步阶段,其在病毒感染中的研究更少之又少,在HCV感染中的作用更无报道。因此,研究lnc RNA在HCV感染中的作用将进一步完善病毒与宿主相互作用过程的阐述,也为抗病毒药物提供新的作用靶点。目前抗HCV治疗药物多为针对某一靶点人工合成的化合物,造价昂贵,并可能在人体中产生一定的不良反应。细胞疗法是近期较为流行的治疗方法之一,其中又以间充质干细胞(MSC)疗法最为常见,它可通过旁分泌一定的生物学活性物质发挥作用。外泌体就是实现其旁分泌功能的主要介质。研究显示,外泌体既可在细胞间传递传染性病原体也可以传输保护性物质抑制病原体感染。已有报道称HCV感染细胞分泌的外泌体可以传递具有感染性的病毒颗粒至其他细胞。然而,并无携带具有抗HCV物质外泌体的报道。人干细胞来源的外泌体是生理培养下的人干细胞成分,生产成本较低,不良反应也较少,是未来再生医学的重要组成部分。因此,研究其在HCV感染过程中的作用具有现实意义。第一部分抗HCV活性天然化合物的筛选及机制研究方法:通过HCV体外感染模型,从数百种天然药用植物来源的化合物中,高通量筛选出具有抗HCV活性的来源于保肝中药五味子的四环叁萜类化合物甘五酸(SZA)和来源于抗炎中药络石藤的木脂内酯类化合物络石藤苷元(TGN)。应用不同基因型的单周期HCV假病毒颗粒及原代人肝细胞,初步分析化合物对病毒入侵的影响。继而通过病毒动力学实验,精确定位化合物抗HCV的有效靶点。采用密度梯度超速离心法分析化合物对病毒本身脂密度及感染性的影响。利用流式细胞术、免疫印迹及病毒结合活性实验排除化合物对HCV靶细胞表面入侵相关受体的作用。以Di D介导的膜融合动态监测实验研究SZA对入侵结合后的膜融合环节的作用,利用荧光染料Prodan检测了SZA对脂质膜流动性的影响;通过流式细胞术检测TGN对结合到细胞表面的病毒E2含量的影响,设计CD81与HCV E2的免疫共沉淀实验并检测TGN在其中的作用,利用预测软件对TGN在CD81上的作用位点进行预测分析。测试SZA和TGN在细胞间病毒传递及与临床上抗HCV药物联合运用的效果。综合分析SZA和TGN的抗HCV疗效、作用靶点及靶向病毒生命周期的抗病毒机制。结果:SZA和TGN细胞毒性较小,可显着抑制细胞来源的HCV(HCVcc)和HCV假病毒颗粒(HCVpp)感染靶细胞。SZA和TGN在不同型别的HCVpp中的抑制效果一致,并能阻断HCVpp入侵原代人肝细胞。动力学实验提示,两者的作用靶点位于病毒感染早期入侵阶段的结合后步骤。SZA和TGN对病毒本身的脂密度和RNA水平的分布,及细胞表面入侵受体表达量和病毒结合活性并无显着影响。DID介导的膜融合动态监测实验提示,SZA可能通过破坏病毒与细胞膜融合的过程抑制病毒感染。同时,细胞脂质膜的流动性也在SZA的作用下升高。TGN则干扰了HCV E2蛋白与入侵关键分子CD81之间的相互作用,且分子预测软件结果显示,CD81大胞外环上的Thr166、Asn184、Lys187或Glu188与TGN形成的氢键可能在TGN抑制病毒入侵中发挥着重要作用。此外,SZA和TGN能显着抑制细胞间病毒的传递,且与干扰素或VX-950联合运用后具有协同抑制病毒感染的效果。结论:天然植物来源的SZA和TGN具有显着的抗HCV感染的活性。两者的作用机制为干扰了HCV感染早期的必要步骤即病毒入侵,与目前传统的DAA的治疗靶点不同,可作为HCV感染预防及对现有疗法的补充,具有广阔的应用前景。第二部分抗HCV长链非编码RNA的高通量筛选及机制研究方法:通过高通量测序发现在HCV感染前后差异表达的系列Lnc RNA。其中,Lnc RNA GAS5所有转录体在HCV感染后都呈高表达。通过进一步过表达或下调该Lnc RNA,发现GAS5的上调可以显着抑制HCV的感染,下调则促进感染。随后,应用单周期HCV假病毒颗粒,排除GAS5对病毒入侵的影响。通过转染病毒RNA入靶细胞或利用HCV复制子细胞实验,检测GAS5对HCV复制的影响。构建GAS5的不同截短体,通过观察它们在病毒感染中的作用,明确GAS5的功能序列。使用预测软件分析可能与GAS5相互作用的蛋白,并从中挑选出与HCV感染尤其是复制相关的蛋白,利用RNA免疫共沉淀(RIP)技术明确两者之间的相互作用。构建缺失GAS5功能序列的截短体,进一步明确这段序列的抑制作用。综合评估GAS5抑制HCV感染的靶点和所涉及到的相关机制。结果:GAS5在HCV感染细胞的胞质中高表达,并随感染剂量的上升及感染进展而升高。在Huh7细胞中过表达GAS5,可显着抑制HCVcc感染靶细胞;下调GAS5的水平则促进病毒的感染。GAS5对不同基因型HCV假病毒颗粒(HCVpp)入侵靶细胞并无明显抑制效果。在HCV复制子细胞中过表达GAS5后能显着降低胞内病毒RNA水平,干扰GAS5能提高病毒RNA的表达。GAS5的不同截短体,包括GAS5-251都能抑制病毒的感染。软件预测GAS5前200 bp与HCV NS3可能存在相互作用。利用RIP技术,将与GAS5相互作用的蛋白拉下,通过Western-blot检测发现,过表达GAS5可显着拉下HCV NS3蛋白,提供了GAS5与病毒NS3蛋白相互作用的依据。缺失GAS5前200序列的截短体失去原有的抗HCV活性,进一步证实了GAS5前200个序列为与病毒蛋白相互作用起抑制效果的功能序列。结论:Lnc RNA GAS5具有显着的抗HCV的效果,其作用机制为通过与HCV NS3蛋白的相互作用,干扰NS3蛋白酶的活性,进而阻碍病毒的复制。GAS5在感染中高表达可能涉及宿主对病毒感染的抵御作用,为阐明抗病毒机制、发展抗病毒药物等提供助力。第叁部分间充质干细胞来源的外泌体抗HCV感染的作用及机制研究方法:利用脐带间充质干细胞(u MSC)的上清及Transwell共培养检测u MSC旁分泌在HCV感染中的作用。进一步分离获得上清中的外泌体(u MSC-Exo),明确外泌体在病毒感染中的效果。利用动力学实验明确u MSC-Exo在病毒感染生命周期中抑制的阶段。通过单周期HCV假病毒颗粒,排除u MSC-Exo对病毒入侵的影响。应用电穿技术将病毒RNA转染入靶细胞或HCV复制子细胞,评估u MSC-Exo对HCV复制的影响。检测转染病毒RNA的细胞内外病毒颗粒的再感染性,明确u MSC-Exo对病毒组装、释放的影响。通过蛋白酶K实验确定外泌体中何种成分具有抑制HCV感染的活性。对u MSC-Exo中的小RNA进行测序,选取在其中高表达的前15个micro RNA(mi RNA),并利用功能性实验包括过表达或干扰技术,明确具有抑制HCV感染功能的mi RNA。将鉴定的mi RNA的抑制剂转染u MSC,检测其分泌的u MSC-Exo的抗病毒活性。将u MSC-Exo与临床上的抗HCV药物联合运用,并评估其抑制效果。结果:u MSC可通过旁分泌抑制靶细胞中HCV的感染,且u MSC-Exo是这个过程中主要起效的活性物质。u MSC-Exo能有效进入Huh7细胞中,降低感染细胞的病毒RNA水平和病毒蛋白的表达。u MSC-Exo对HCV的入侵并无影响,但是能显着抑制病毒的复制。蛋白酶K实验明确u MSC-Exo起效的分子为其内的RNA成分。u MSC-Exo的小RNA测序中高表达的前15个mi RNA中,有9个mi RNA在u MSC-Exo处理的靶细胞中高表达,而功能性实验提示其中4个mi RNA(let-7f、mi R-145、mi R-199a和mi R-221)在u MSC-Exo的抗病毒效果中发挥主要作用。将这4个mi RNA的抑制剂转染u MSC后,其分泌的u MSC-Exo的抗病毒效果明显下降。将u MSC-Exo与IFN或VX-950联合运用能协同抑制HCV的感染。结论:u MSC-Exo具有显着的抗HCV的活性,其作用机制为通过外泌体包裹的具有抗HCV感染作用的mi RNA(let-7f、mi R-145、mi R-199a和mi R-221)抑制病毒的复制,进而阻断病毒感染。此工作为解析HCV感染的分子机制及抗病毒治疗的发展提供了新的思路和可能性。【小结】本研究通过高通量筛选天然化合物库,发现了具有抗HCV活性的SZA和TGN,进一步研究发现两者分别通过靶向病毒膜融合及入侵关键受体CD81抑制HCV的入侵。通过高通量测序发现在HCV感染后上调的lnc RNA GAS5,分析其作用机制为通过与病毒NS3蛋白相互作用,干扰其活性,从而阻碍病毒的复制。首次发现u MSC-Exo具有抑制HCV感染的作用,它起效的方式是传递u MSC-Exo包裹的特有的具有抗HCV活性的mi RNA至感染的靶细胞。以上这些研究成果发现并鉴定了外源性及内源性HCV抑制性分子,为阐明HCV感染的分子机制及抗病毒治疗的发展提供了助力。
付娜[2]2016年在《长链非编码RNA-ATB在HCV相关肝纤维化中的作用及机制研究》文中认为丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染为世界性健康问题,据WHO报道,全球HCV感染流行率约3%(约1.85亿感染者),每年约3.5万例新发丙型肝炎病例,约50万例患者死于HCV相关疾病。近年来,据国家疾病防治控制中心统计数据,我国上报HCV感染人数逐年上升,2013年的病例数超过22万人。肝硬化及肝细胞癌(hepatocellular cancer,HCC)是慢性丙型肝炎患者致死的主要原因,由此造成的疾病负担成倍增长。肝纤维化是慢性HCV感染进展为肝硬化及终末期肝病的重要病程阶段,Butt等最新研究提出HCV感染早期即出现肝纤维化,且经FIB-4(fibrosis index based on the 4 factor)指数监测11年证实,随着感染时间的延长,肝纤维化呈进行性加重趋势,因此,早期诊断及有效抗肝纤维化治疗是防止该病进展、改善患者生活质量及生存率的主要策略。目前,尚乏准确判断病情及其进展的特异性标志及有效治疗手段,因此,深入研究HCV相关肝纤维化发病机制、主要靶基因,提出新型基因诊断标志及治疗新靶点,对该病的及时诊断及有效防治至关重要。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的不具备编码蛋白功能的RNA分子,可在表观遗传学调控、转录调控、转录后调控等多个层面调控蛋白编码基因的表达。近年研究表明,lncRNAs差异表达或功能失调参与多种疾病的发生及进展,其与肝细胞再生、炎症反应、免疫反应以及肝癌的发生等密切相关;此外,lncRNAs还可以参与调节肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)功能,影响肝纤维化的发病与进展。转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β激活的lncRNA(lncRNA-activated by TGFβ,lncRNA-ATB)被证实参与多种恶性肿瘤的发生、进展及转移,并与肝硬化呈正相关,但是lncRNA-ATB在HCV相关肝纤维化中的作用及分子机制尚不清楚。本研究采用临床HCV感染病例及建立HCV相关肝纤维化体外细胞模型,旨在明确lncRNA-ATB在HCV相关肝纤维化中的表达情况,预测其靶标基因及相关信号转导通路,探明其调控靶标基因的机制,以阐明lncRNAs在hcv相关肝纤维化发病中的作用及主要作用机制,为临床从基因水平诊断及防治该病提供新的途径及科学依据。第一部分长链非编码rna-atb在hcv相关肝纤维化患者血浆及肝组织的表达变化目的:明确lncrna-atb在hcv相关肝纤维化患者血浆及肝组织的表达变化,分析血浆lncrna-atb作为生物学标记对hcv相关肝纤维化的诊断价值。方法:采用随机对照研究,选择2014年9月至2015年6月在河北医科大学第叁医院门诊及住院的慢性hcv感染者36例,并选择15例健康体检者作为健康对照。留取外周静脉血,分别分离血浆、血清,储存于-80℃冰箱备用。hcv感染患者均进行肝穿刺活检术及肝组织病理检查,根据metavir评分系统将hcv患者分为轻度纤维化组(f<2;n=14)和中至重度纤维化组(2≤f<4;n=22)。另选5例肝移植供体作为健康对照组。血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,alt)及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,ast)水平采用酶法检测;肝组织切片行苏木素-伊红(haematoxylinandeosin,he)染色及masson叁色染色,观察肝组织脂肪变性、炎症及纤维化程度;免疫组织化学染色方法评估肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)、?型胶原α1(alpha-1typeicollagen,col1a1)表达;原位杂交方法检测肝组织lncrna-atb表达;采用trizolls提取血浆总rna,以实时荧光定量pcr方法检测血浆lncrna-atb表达。结果:1患者一般情况:健康对照组(n=15),其中男性8例(53.3%),女性7例(46.7%),平均年龄(51.2±11.4)岁;hcv感染患者f<2组(n=14),其中男性6例(42.9%),女性8例(57.1%),平均年龄(48.8±11.6)岁;hcv感染患者2≤f<4组(n=22),其中男性12例(54.5%),女性10例(45.5%),平均年龄(52.5±7.2)岁。叁组年龄之间差异无统计学意义(f=0.596,p=0.555)。2血清alt、ast水平:健康对照组、hcv感染患者f<2组及hcv感染患者2≤f<4组血清alt中位数分别为17.0、33.0、50.0u/l,叁组之间差异具有统计学意义(χ2=23.79,p=0.000);血清ast中位数分别为15.0、32.0、43.5u/l,叁组之间差异具有统计学意义(χ2=23.33,p=0.000)。两两比较结果显示,hcv感染患者血清alt、ast均显着高于健康对照组(p值均为0.000);hcv感染患者两组间alt水平无显着性差异(p=0.107),hcv感染患者2≤f<4组血清ast显着高于f<2组(p=0.000)。3肝组织病理学特征:健康对照组肝小叶结构正常;hcv感染患者f<2组肝组织可见肝细胞轻度水样变、部分肝细胞脂肪变性,小叶内可见少许点状肝细胞坏死,肝窦内可见成串淋巴细胞浸润,窦周轻度纤维化;汇管区轻度扩大,可见淋巴滤泡,少量纤维化组织增生;hcv感染患者2≤f<4组肝组织可见肝细胞中至重度水样变、部分肝细胞脂肪变性,小叶内散在点状肝细胞坏死,肝窦内可见成串淋巴细胞浸润,可见窦周纤维化;汇管区扩大,可见淋巴滤泡,纤维组织增生明显,形成纤维间隔。4肝组织α-sma、col1a1及lncrna-atb表达:α-sma主要表达于血管壁及肝窦内活化的hsc细胞浆;col1a1主要表达于纤维化间隔;lncrna-atb表达于肝细胞胞浆。与健康对照组相比,肝组织α-sma、col1a1及lncrna-atb表达随着纤维化程度加重而增加。5血浆lncrna-atb表达变化及与肝纤维化分期相关性分析:hcv感染患者血浆lncrna-atb表达水平显着高于健康对照组(z=-5.562,p=0.000),且与肝脏纤维化程度呈正相关(r=0.785,p=0.000);其中,hcv感染患者2≤f<4组血浆lncrna-atb显着高于f<2组(z=-3.960,p=0.011)。6血浆lncrna-atb诊断肝纤维化的效果分析:应用受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,roc)分析显示血浆lncrna-atb水平可用于区分hcv感染患者纤维化程度,曲线下面积为0.877(p=0.000),其诊断特异性为0.880,敏感性为0.787。结论:1.肝组织病理学显示hcv感染患者肝脏炎症及纤维化增加,伴随lncrna-atb表达上调。2.血浆lncrna-atb表达在hcv感染患者中显着升高,并在中至重度肝纤维化患者中进一步升高。并且血浆lncrna-atb水平与hcv相关肝纤维化分期呈正相关。3.血浆lncrna-atb对hcv相关肝纤维化程度具有重要的诊断价值,有望成为诊断hcv相关肝纤维化的新型生物学标记。第二部分长链非编码rna-atb在体外活化的肝星状细胞中的表达变化目的:建立稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系,探明lncrna-atb在hsc活化中的作用。方法:转染pcdna3.1-hcv核心蛋白质粒至hepg2细胞,筛选稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系并进行验证;进一步应用小干扰rna(smallinterferencerna,sirna)转染hepg2-core细胞以敲除转化生长因子(transforminggrowthfactor,tgfβ)1。实时荧光定量pcr和westernblot方法检测hcvcore表达;酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)检测细胞培养上清液中tgfβ1水平。将细胞培养上清作为条件培养基处理人肝星状细胞系lx-2,同时应用重组人tgfβ1按剂量梯度及时间梯度处理lx-2细胞。实时荧光定量pcr、westernblot及免疫细胞荧光染色方法检测α-sma、col1a1表达;细胞增殖-毒性检测试剂盒(cellcountingkit-8,cck-8)检测细胞增殖情况;实时荧光定量pcr检测lncrna-atb表达变化。结果:1稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系建立成功:hepg2-core细胞与对照hepg2-nc细胞相比,能够稳定表达hcvcoremrna和蛋白;培养上清液中tgfβ1水平显着升高。si-tgfβ1-1能明显减少hepg2-core细胞tgfβ1mrna表达,并降低细胞培养上清中tgfβ1水平。2hepg2-core细胞培养上清作为条件培养基促进hsc活化:hepg2-core细胞培养上清液促进lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达显着增加,与之相比,si-tgfβ1-1转染后的hepg2-core细胞培养上清液引起lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达程度下降。3重组人tgfβ1促进hsc活化及增殖:重组人tgfβ1显着增加lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达,且呈剂量及时间依赖性。同时选择10ng/ml重组人tgfβ1作用48h促进lx-2细胞α-sma、col1a1蛋白表达增加及细胞增殖。4lncrna-atb在活化的hsc表达显着增加:lncrna-atb表达在hepg2-core细胞培养上清液诱导活化的hsc中显着上调;lncrna-atb表达在重组人tgfβ1诱导活化的hsc中呈剂量及时间依赖性上调。结论:1.稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞上清液可作为条件培养基促进lx-2细胞活化;2.敲除hepg2-core细胞中tgfβ1表达,减少细胞培养上清液中tgfβ1水平,并减少lx-2细胞活化;3.重组人tgfβ1以剂量及时间依赖方式促进细胞活化及增殖;4.lncrna-atb可能为hsc活化的重要分子标志。第叁部分长链非编码rna-atb的竞争性内源rna分子调控机制预测及验证目的:预测并验证lncrna-atb作为竞争性内源rna调控相关mirna靶基因的分子机制。方法:采用分子生物信息学分析预测lncrna-atb相关mirna及其靶基因,构建lncrna-atb及靶基因3’-非翻译区(untranslatedregions,utr)野生型及突变型双荧光素酶报告载体质粒,与mirna模拟物(mimics)共转染,定量检测双荧光素酶催化产生的荧光数值,验证mirna的作用靶点。应用mirnamimics、抑制剂(inhibitor)以及相应对照转染lx-2细胞,48h后收集细胞,采用实时荧光定量pcr检测lncrna-atb、mirna及α-sma、col1a1mrna表达变化;westernblot方法检测α-sma、col1a1蛋白表达变化。结果:1分子生物信息学预测lncrna-atb相关的mirna及其靶基因:lncrna-atb与ii型tgf-β受体(tgf-βtypeiireceptor,tgf-βrii)和smad2具有相同的mirna-425-5p结合位点(cacagua)。2双荧光素酶报告基因验证mirna-425-5p与lncrna-atb及靶基因结合:结果显示mirna-425-5pmimics可显着下调psi-atb-wt、psi-tgf-βrii-wt、psi-smad2-wt依赖的荧光素酶活性,而对共转染相关的突变型质粒的荧光素酶活性无影响。3mir-425-5p具有抑制肝星状细胞活化的作用:mir-425-5pmimics引起lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达显着下调。相反地,mir-425-5pinhibitor引起lx-2细胞α-sma、col1a1mrna及蛋白表达显着升高。4mir-425-5p转录后调控作用:mir-425-5pmimics引起lx-2细胞表达mir-425-5p显着升高,其靶基因tgf-βrii和smad2mrna及lncrna-atb表达无明显变化,而其靶基因tgf-βrii和smad2蛋白表达下降;mir-425-5pinhibitor引起lx-2细胞表达mir-425-5p显着下降,其靶基因tgf-βrii和smad2mrna及lncrna-atb表达无明显变化,而其靶基因tgf-βrii和smad2蛋白表达上调。结论:1生物信息学预测及双荧光素酶报告基因检测证实lncrna-atb与tgf-βrii和smad2具有相同的mir-425-5p结合位点。2靶向调控mir-425-5p表达引起lx-2细胞内源性mir-425-5p表达变化,并能通过转录抑制tgf-βrii、smad2蛋白表达及调节α-sma、col1a1mrna及蛋白表达变化。第四部分靶向调控长链非编码rna-atb对肝星状细胞活化的作用及分子机制目的:明确过表达及敲除lncrna-atb对hsc活化的影响及潜在的分子生物学机制。方法:构建lncrna-atb过表达质粒转染lx-2细胞,通过实时荧光定量pcr、westernblot方法检测α-sma、col1a1、tgf-βrii和smad2表达;lx-2细胞增殖通过cck-8试剂盒检测;免疫荧光细胞化学染色检测tgf-βrii和smad2表达;实时荧光定量pcr检测lncrna-atb、mir-425-5p表达变化。合成si-atb并转染lx-2细胞,通过实时荧光定量pcr、westernblot方法检测α-sma、col1a1、tgf-βrii和smad2表达;lx-2细胞增殖通过cck-8试剂盒检测;免疫荧光细胞化学染色检测tgf-βrii和smad2表达;实时荧光定量pcr检测lncrna-atb、mir-425-5p表达变化。结果:1 LncRNA-ATB促进LX-2细胞活化:过表达lncRNA-ATB可增加LX-2细胞α-SMA、Col1A1 mRNA和蛋白表达,并促进LX-2细胞增殖。2 LncRNA-ATB通过miR-425-5p调控TGF-βRII和SMAD2表达:过表达lncRNA-ATB可增加TGF-βRII和SMAD2蛋白表达而下调内源性mi R-425-5p表达,miR-425-5p mimics共转染可部分恢复上述变化。3敲除lncRNA-ATB抑制HSC活化:si-ATB-1/si-ATB-2/si-ATB-3分别转染LX-2细胞后,结果显示si-ATB-3具有最高的抑制效率。si-ATB-3可抑制LX-2细胞α-SMA、Col1A1 mRNA和蛋白表达,抑制LX-2细胞增殖。4敲除lncRNA-ATB通过上调miR-425-5p抑制TGF-βRII和SMAD2表达:si-ATB-3可减少LX-2细胞TGF-βRII和SMAD2蛋白表达而上调内源性mi R-
杨大荣[3]2015年在《新型肝炎病毒感染体系构建及抗病毒先天免疫应答研究》文中研究指明全球有超过5亿人口属于丙型肝炎病毒(HCV)和/或乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染人群,这些感染者有可能逐步发展为慢性肝炎、肝硬化和肝癌。因缺少理想的病毒感染体系而制约了病毒生活周期、先天免疫反应以及发病机制的相关研究,从而阻碍了研发抗病毒药物的进程。尽管乙肝病毒的预防性疫苗早已上市,HCV疫苗却还未研发成功。相比于其它大部分的病毒感染,HCV感染的主要特征是极易形成慢性感染(约80%)。另一方面,约有20%的HCV感染者能够自动清除体内病毒而不需要接受治疗,表明宿主的先天免疫反应可以控制病毒感染。在病毒感染过程中,诱导I型干扰素和干扰素刺激基因(ISGs)是宿主抵御病毒的主要方式。宿主通过模式识别受体(PRRs)捕获病毒感染所形成的病原体相关分子模式(PAMPs),激活先天免疫应答系统。主要的PRRs包括RIG-I样受体(RLRs)、Toll样受体(TLRs)、Nod样受体(NLRs)和蛋白激酶R(PKR)。然而,HCV和肝细胞抗病毒先天免疫反应之间的复杂相互作用机制未知。本研究工作旨在研发一个理想的HCV和HBV感染细胞培养体系,并基于此体系探究宿主应答病毒感染的先天免疫机制。第一,我们成功分离了一株新型肝癌细胞系HLCZ01。该细胞系来源于一位患有高分化肝癌的男性病人的肝组织。HLCZ01细胞的形态酷似人正常原代肝细胞(PHH),并表达多种肝细胞特异性标志物,包括白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肝细胞核因子4(HNF4)、细胞色素CYP3A4和mi R-122。同时,HLCZ01细胞还表达HCV的四种受体,分别为CD81、SR-BI、CLDN1和OCLN。第二,HLCZ01细胞系支持HCV和HBV感染的完整生活周期。HLCZ01细胞既支持实验室来源和临床病人血清中的HCV感染和复制,又支持体外来源的和体内病人血清来源的HBV感染和复制。从病毒感染的HLCZ01细胞中组装和释放的HBV和HCV可以再感染原始的HLCZ01细胞。HLCZ01细胞支持HBV和HCV共感染,并且这两种肝炎病毒在HLCZ01细胞中的复制互不干扰。抗HBs Ag和抗CD81特异性抗体可分别阻断HBV和HCV入侵HLCZ01细胞。已开发的抗病毒药物可有效抑制HBV和HCV在HLCZ01细胞中的复制。HLCZ01是世界首例支持HBV和HCV病人血清直接感染以及HBV/HCV共感染的肝癌细胞系,这株细胞系可应用于肝炎病毒生活周期、肝细胞与肝炎病毒相互作用的研究以及抗病毒药物和疫苗的研发。第叁,HLCZ01细胞和PHH具有完整的先天免疫应答系统。一方面,HCV感染肝细胞后可诱导IFN-β和G1P3、ISG12a以及1-8U等抗病毒ISGs的表达。在HLCZ01细胞中,HBV的存在并不影响HCV诱导IFN-β和ISGs的产生。另一方面,HCV感染HLCZ01细胞和PHH至相对较长时间点时,可诱导病毒感染细胞凋亡,这可能是宿主细胞清除病毒的另一种先天免疫应答方式。在肝细胞中沉默TRAIL可抑制HCV诱导的细胞凋亡。RIG-I缺失可下调IFN-β和TRAIL的表达,并阻断病毒诱导的细胞凋亡,从而促进病毒复制。IRF3是RIG-I的下游信号分子,同样参与了TRAIL介导的肝细胞凋亡。第四,mi R-942通过调控ISG12a表达以介导HCV诱导的细胞凋亡。借助于HLCZ01细胞感染体系,找到了介导HCV所致细胞凋亡的重要调控分子ISG12a及其参与HCV诱导细胞凋亡的信号通路。经生物信息学方法预测和实验验证显示,mi R-942是ISG12a的负调控因子。HCV感染可下调mi R-942的表达,并且mi R-942与ISG12a在HCV感染的肝细胞和肝组织中的表达呈负相关性。过表达或沉默mi R-942可分别减弱或增强HCV诱导的细胞调亡。同时,促凋亡蛋白Noxa在HCV感染细胞中被诱导表达,诱导的Noxa可介导ISG12a依赖的肝细胞凋亡。综上所述,本研究工作构建了一株支持HCV和HBV完整生活周期的新型肝癌细胞系HLCZ01。借助于该感染体系,初步揭示了若干宿主应答病毒感染的先天免疫反应节点。RIG-I通路在HCV感染诱导I型干扰素产生和引发TRAIL介导的病毒感染细胞凋亡途径中起关键作用。mi R-942通过调控ISG12a表达可介导Noxa依赖的HCV所致细胞凋亡。
陈红松, 窦晓光, 段钟平, 侯金林, 贾继东[4]2015年在《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》文中认为为规范丙型肝炎的预防、诊断和抗病毒治疗,中华医学会肝病学分会和感染病学分会根据丙型肝炎病毒(HCV)感染的特点、国内外最新的循证医学证据和药物的可及性,于2015年组织国内有关专家修订了《丙型肝炎防治指南》。完善的病毒学检测是慢性HCV感染筛查、监测、诊断和治疗的基础。根据我国社会和经济发展情况,还需要积极发展适宜于资源有限地区HCV RNA定量和HCV基因分型的检测试
王贞[5]2016年在《基于抗体多维数据的解析探讨丙型肝炎病毒抗体亲和力在病程中的动力学变化及与HLA多态性的关联》文中研究说明背景:丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是输血后以及散发性肝炎的主要病原,是世界性的公共卫生难题。全世界约有1亿7千万HCV血清学阳性的患者,面临着转变成肝硬化、肝癌的风险。尽管HCV能刺激机体产生有效的免疫反应,但80%的HCV感染者会进展成慢性丙肝患者,只有20%患者能有效清除病毒,自行恢复且不留任何后遗症。大多数HCV慢性感染患者体内能产生针对不同HCV病毒蛋白的抗体,而且在患者血清中能检测到这些抗体的存在。显然,HCV感染的宿主免疫反应的类型和强度可能对其预后用着重要作用。HCV抗体检测对HCV诊断有重要价值,中和抗体能直接作用于HCV病毒,但一般认为通常在HCV感染者中所检测到的抗体是针对HCr43蛋白(HCV非结构区NS3及核心区的编码产物)、c100-3抗原(HCV非结构区NS3、NS4的编码产物)的抗体,为非中和抗体,因此,不能通过检测HCV抗体准确判定HCV感染者的免疫状态。我们在对乙型肝炎anti-HBc亲和力与HBV感染的联系中发现同为非中和抗体,但anti-HBc亲和力与HBV感染的预后关系密切;也有研究证明抗体亲和力高低能准确反映巨细胞病毒感染的活动状况。测定HCV抗体亲和力有可能较为准确的反映HCV感染者的免疫状况,对判定HCV感染的现状和结局提供有价值的信息。抗体的总活性取决于抗体蛋白的含量及其与抗原间的结合活性(亲和力)。而目前临床实验室hcv抗体的检测只检测抗体的总活性,并未涉及抗体蛋白的含量和抗体亲和力的检测,本研究将hcv抗体总活性解析成抗体蛋白量和抗体亲和力,试图利用常规的hcv抗体总活性的检测系统,参照乙型肝炎anti-hbc亲和力的检测原理来建立hcv抗体亲和力的检测方法,并探讨丙型肝炎病毒抗体亲和力、总活性及物质量与病毒载量、机体损伤程度以及疾病不同阶段变化的动力学联系。近十年对hla和hcv感染持续性及清除的研究非常多,机体对病毒表位的免疫反应取决于抗原递呈细胞加工和递呈抗原表位的能力,以及免疫细胞识别这些抗原表位的能力,而这些功能是由hla分子遗传决定的,因而推测hla类型可影响hcv感染结局。hla-i类等位基因与hcv感染的自限性转归之间存在很强的相关性,例如hla-i类等位基因a3、b27和cw*01均与病毒清除相关,而b8则与病毒的持续性感染相关。ns3区域的一个表位对hla-dr具有高度亲和性,提示hla-Ⅱ类分子也与病毒清除有关。某些hla-Ⅱ类等位基因也与hcv感染的结局相关,与病毒清除最为高度相关的hla-Ⅱ类等位基因是dqb1*0301基因和drb1*1101。然而,这些研究结果并不完全一致,甚至相互矛盾。目的:采用抗体多维数据分析,建立hcv抗体亲和力的检测方法,并探讨丙型肝炎病毒抗体亲和力、物质量及总活性动力学变化及其与病毒量、机体损伤程度以及疾病不同阶段的联系。hcv感染患者hla-a,hla-b,hla-drb1基因型别与疾病过程的联系以及其作用机制。方法:1、采用重组乙型肝炎疫苗反复叁次皮下注射免疫兔子,第一次注射一周后采集兔子血清,获得低亲和力抗体动物血清;第叁次注射两周后采集兔子血清,获得高亲和力抗体动物血清,倍比稀释血清,采用双抗原夹心酶联免疫吸附实验测定anti-hbs。随机收集临床诊断为hcv感染患者血清106例,采用化学发光微粒子免疫检测法测定hcv抗体,pcr-荧光探针法检测hcv-rna,同时检测alt、ast、alb等临床常用检测指标。根据alt、ast水平以及hcv-rna水平各分叁组,比较分析组间抗体亲和力、抗体总活性及抗体物质量的变化。2、随机收集临床诊断为hcv感染患者血清328例,采用化学发光微粒子免疫检测法测定hcv抗体,pcr-荧光探针法检测hcv-rna,同时检测alb。根据疾病阶段分为慢性肝炎组和肝硬化组,慢性肝炎组又根据患者alb和hcv-rna水平分为:alb正常&hcv-rna阴性组(好转恢复阶段)和其他组(进展阶段)。分析比较组间抗体亲和力、抗体物质量及抗体总活性的变化。3、随机收集临床诊断为hcv感染患者血清104例及健康对照200例,采用化学发光微粒子免疫检测法测定hcv抗体,pcr-荧光探针法检测hcv-rna,同时检测血清alb水平,采用测序方法(sequencebasedtyping,pcr-sbt)进行hla基因型的鉴定。比较分析不同hla型别间alb水平、抗体亲和力、抗体物质量及抗体总活性的变化。4、采用网上搜索数据库结合discoverystudio(ds)软件来分析预测ns3和hla-drb1*09,hla-a*02,hla-a*33,hla-b*58,hla-drb1*07,hla-drb1*13这6种hla蛋白分子之间的相互作用。数据库包括美国国立医学图书馆文献检索系统ncbi,蛋白质结构数据库pdb以及prosite数据库。结果:1、雌兔第1次免疫后血清抗体亲和力为0.522,第2次为0.826,第3次为0.896;雄兔第1次免疫后血清抗体亲和力为0.816,第2次为0.846,第3次为0.972,均呈逐渐升高趋势,与抗体亲和力成熟规律一致。2、alt、ast正常组的抗体物质量明显低于任一异常组、均异常组(p<0.05),而抗体亲和力则明显高于任一异常组、均异常组(p<0.05)。抗体总活性在叁组中比较,均没有显着性差异(p>0.05)。3、根据hcv-rna水平,将alt、ast均正常组(53例)进一步分组为hcv-rna阴性组和hcv-rna阳性组。hcv-rna阴性组的抗体总活性、抗体物质量均明显低于hcv-rna阳性组(p<0.05),而抗体亲和力却明显高于hcv-rna阳性组(p<0.05)。4、hcv-rna阴性组的抗体总活性、抗体物质量均明显低于低病毒载量、高病毒载量组(p<0.05),而抗体亲和力则明显高于低病毒载量、高病毒载量组(p<0.05)。5、以hcv-rna阳性为因变量,抗体亲和力、抗体物质量和抗体总活性为自变量,进行logistic回归分析,hcv-rna水平与抗体亲和力呈负相关(p<0.05)。6、alb正常&hcv-rna阴性组的抗体亲和力明显高于慢性肝炎其他组和肝硬化组(p<0.05),而抗体物质量明显低于慢性肝炎其他组和肝硬化组(p<0.05),抗体总活性在叁组中比较没有显着性差异(p>0.05)。7、抗体亲和力和抗体物质量的roc曲线下面积分别是0.816、0.811,均显示了较高的诊断效能,明显高于传统的抗体检测(roc曲线下面积为0.581)。抗体亲和力对于区分丙肝感染进展阶段(hcv-rna阳性)和好转阶段(hcv-rna阴性)的最佳诊断临界点为0.873,抗体亲和力越高,病毒复制越少。8、alb正常&hcv-rna阴性组中,高抗体亲和力(≥0.873)的比例明显高于慢性肝炎其他组和肝硬化组(p<0.05)。9、hcv-rna(+)的血清被含有高亲和力抗体的血清中和后,lgrna明显低于中和前的水平(p<0.05)。10、在hcv患者和健康对照组中鉴定出8种hla型别具有显着性差异(p<0.05),分别是hla-a*02,hla-b*39,hla-drb1*09,hla-drb1*11,hla-a*33,hla-b*58,hla-drb1*07,hla-drb1*13。其中hla-a*02,hla-b*39,hla-drb1*09,hla-drb1*11在hcv患者中阳性率明显低于健康对照组,而hla-a*33,hla-b*58,hla-drb1*07,hla-drb1*13则明显高于健康对照组(p<0.05),提示hla-a*02,hla-b*39,hla-drb1*09,hla-drb1*11为丙肝感染的抵抗基因,而hla-a*33,hla-b*58,hla-drb1*07,hla-drb1*13则是丙肝感染的敏感基因。11、在上述8种hla型别中,血清alb水平在hla-a*02,hla-a*33,hla-b*39,hla-drb1*07,hla-drb1*11,hla-drb1*13基因携带者与非携带者间并无差异(p<0.05),仅hla-b*58和hla-drb1*09携带者与非携带者的alb水平明显不同,前者p=0.015,后者p=0.003,均<0.05,但仅有hla-drb1*09在交叉验证中仍然具有显着性差异,p=0.017,说明hla-drb1*09不仅是丙肝感染的抵抗基因,还在阻碍alb水平下降及疾病进展的过程中起到保护作用。12、hla-a位点基因频率(高分辨)与抗体亲和力呈正相关,提示基因频率越高,抗体亲和力越强。13、对携带hla-a*02,hla-b*39,hla-drb1*09,hla-drb1*11,hla-a*33,hla-b*58,hla-drb1*07,hla-drb1*13基因型别的患者进行抗体亲和力、抗体物质量以及抗体总活性的比较,由于hla-b*39仅有1例阳性患者,hla-drb1*11只有4例阳性患者,故不对此两种基因型别进行比较。结果显示,按抗体亲和力排序,hla-a*33>hla-b*58>hla-drb1*07>hla-a*02>hla-drb1*09>hla-drb1*13。14、生物信息学角度的亲和力分析结果是:hla对hcvns3的亲和性排序为:hla-b*58>hla-a*33>hla-drb1*09>hla-drb1*07>hla-a*02>hla-drb1*13。结论:1.hcv抗体多维数据解析方法成立,hcv感染患者抗体亲和力、抗体总活性、抗体物质量的变化有可能反应肝细胞损伤及病毒载量的变化,具有一定的临床应用价值。2.hcv抗体多维数据解析发现,抗体亲和力与病情联系密切,优于传统实验室仅检测抗体总活性的方法。抗体亲和力在疾病转归中可能有一定的指示作用,具有较高的诊断效能,高亲和力抗体可能有利于疾病的好转,测定抗体亲和力将有助于临床医生判断疾病的预后。3.HLA多态性与丙型肝炎发生发展过程及HCV抗体亲和力高低有关,基因频率高(进化保守),可能越有利于产生高亲和力的抗体。
黄鹏[6]2016年在《抗原加工递呈相关基因多态性与HCV感染转归的关系研究》文中进行了进一步梳理既往国内丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染现况研究主要集中在高危人群,一般人群HCV感染状况的报道相对较少。大部分急性HCV感染者转为慢性持续感染状态,主要是由环境和宿主因素共同作用。位于人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)II类非经典区域的抗原加工递呈通路相关基因包括HLA-DM、HLA-DO、TAP、LMP和tapasin基因,其编码产物可对抗原进行加工,并递呈于细胞表面,激发T细胞免疫应答,在HCV感染转归及治疗效果中可能发挥着至关重要的作用。第一部分,本研究采用多阶段分层整群抽样方法,选取江苏叁个县级市60个社区或行政村一般居民,对其进行流行病学调查和血清HCV抗体检测。结果显示,共收集有效样本149175例,其中HCV抗体(HCV antibody, anti.HCV)阳性者1175例,阳性率为0.79%(95%confidence intervalCI)=0.74%-0.83%)。儿童人群中HCV感染率较低,青少年和21岁以上成人人群HCV感染率逐渐升高,分别为0.09%(95% CI=0.04%-0.17%)和0.20%(95% CI=0.15%-0.28%)。在大部分年龄组中,女性人群HCV抗体阳性率高于男性人群。多水平回归分析显示,年龄、性别、教育水平、职业、输血史(odds ratio(OR)=2.91,95% CI=1.09-5.37)、侵入性检测史(OR=1.28,95% CI=1.14-1.61)及拔牙史(OR=2.27,95% CI=1.41-3.42)与HCV感染相关。尽管江苏省部分地区一般人群HCV感染率不高,但由于慢性持续HCV感染易进展为肝硬化、肝癌,仍然不能忽视HCV感染造成的公共卫生问题。第二部分,本研究对中国汉族既往有偿献血人群中9个候选基因(HLA-DMA、 HLA-DMB、HLA-DOA、HLA-DOB、TAP1、TAP2、LMP2、LMP7和tapasin)上的34个标签单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms, SNPs)进行基因分型。比较1207名不同HCV感染结局的有偿献血者中SNPs的基因型分布,探讨候选基因多态性和HCV感染结局的关系。结果显示,HLA-DMA rs1063478和HLA-DOA rs2284191是影响HCV感染易感性的独立因素。携带叁个rs1063478-T、rs2284191-G保护等位基因,这种保护效应最强(OR=0.46,95% CI=0.27-0.78)。HLA-DOB rs7383287和LMP2 rs17587是HCV感染慢性化的独立影响因素。携带两个rs7383287-G和rs17587-A等位基因的个体,HCV感染慢性化的风险会下降58%(OR=0.42,95% CI=0.26-0.66)。交互作用分析表明单采血浆史和rs1063478、rs2284191联合效应在HCV易感性相关中存在交互作用(交互作用P=0.04)；献全血史和rs7383287在HCV病毒清除相关中存在交互作用(交互作用P=0.04)。抗原递呈相关基因遗传变异影响HCV感染易感性和慢性化结局。本研究在中国汉族人群中发现的与HCV感染转归的结局相关的HLA-DMA rs1063478、 HLA-DOA rs2284191和HLA-DOB rs7383287的位点尚属首次报道。第叁部分,本研究基于句容市人民医院慢性丙型肝炎住院患者,采用前瞻性随访研究,PEG-IFN-a-2b治疗48周,结束后随访24周,观察持续病毒应答(sustained virological response, SVR)。对HLA-DOA rs2284191、HLA-DOB rs7383287、HLA-DMA rs1063478和LMP2 rs17587进行基因分型,比较不同结局组间基因型分布差异。探讨抗原加工递呈相关基因多态性与聚乙二醇干扰素α(PEG-IFN-a)治疗慢性丙型肝炎效果的关系。结果表明,336例慢性丙型肝炎患者完成了治疗周期及随访,其中SVR率75.3%。持续应答组与非持续应答组间基线HCV RNA,谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyl transpeptadase, GGT),空腹血糖(glucose, GLU),叁碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine, T3),甲状腺素(thyroxine, T4),血小板计数(platelets,PLT),甲胎蛋白(alpha-fetal protein, AFP)水平差异有统计学意义(P<0.05)。调整因素为年龄、性别、基线HCV RNA,GGT,GLU,T3,T4,血小板计数及AFP水平。结果显示,HLA-DMA rs1063478(显性模型：调整OR=2.05,95% CI=1.24-3.41,P=0.005)和LMP2 rs17587(显性模型：调整OR=2.04,95%CI=1.23-3.35,P=0.005)位点影响患者是否获得SVR。且HLA-DMA rs1063478和ZMP2 rs17587突变基因型均为保护因素。本研究提示,HLA-DMA rs1063478和ZA/P2rs17587位点、基线GLU、血小板水平及T4是预测慢性丙型肝炎治疗是否达到SVR的独立影响因素。
段晓琼[7]2017年在《MicroRNA130a通过调节干扰素信号通路及丙酮酸代谢调控HCV及HBV复制的机制研究》文中研究表明研究背景:乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染是导致严重肝脏疾病的主要原因之一。目前,全球约有HBV慢性感染者2.57亿人,HCV慢性感染者7100万人,对公共健康造成严重的负担。目前,乙肝的治疗药物主要有干扰素和核苷类似物两种,干扰素治疗应答率低,而核苷类药物治疗易复发。丙肝治疗的传统方法为长效干扰素联合利巴韦林,但毒副作用大,且对HCV基因Ⅰ型病毒应答率低。近年,靶向HCV蛋白酶和聚合酶的直接抗病毒药物(Direct-actingAntivirals,DAAs)的飞速发展极大的提高了抗病毒应答率,但是一些不足之处也逐渐显现,如在HBV/HCV共感染的患者中,DAAs药物易造成HBV的复发,加之DAAs药物价格昂贵,因此,寻找新的抗病毒策略,尤其是能同时抵抗HCV和HBV两种病毒的广谱抗病毒策略,仍然是非常有必要的。保持自身的代谢和激发免疫应答是宿主细胞在受到外界刺激,如病毒感染时,维持内稳态的两个方面。microRNAs在调节宿主代谢和免疫应答中均起着极为重要的作用。有研究显示,在HCV及HBV感染的病人肝组织及体外细胞培养模型中,miR-130a的表达发生明显的改变;同时有研究显示,miR-130a表达的改变对HCV及HBV的复制具有调节作用。我们在研究中发现miR-130a能调节Ⅰ型干扰素及其下游干扰素刺激基因的表达,同时miR-130a靶作用于丙酮酸激酶PKLR,调节PKLR的表达及其催化的丙酮酸生成反应。但是针对miR-130a调节HCV和HBV的复制及宿主免疫是否与丙酮酸代谢存在关联,目前尚不清楚。研究目的:1、探索miR-130a对HCV和HBV复制的影响;2、鉴定miR-130a作用的靶基因;3、阐述miR-130a调控HCV和HBV复制的分子机制。研究内容:第一部分miR-130a通过调节Ⅰ型干扰素信号通路调控HCV复制的研究;第二部分miR-130a与维生素D协同抗HCV作用研究;第叁部分miR-130a通过调节靶基因PKLR的表达调控HCV和HBV复制的研究;第四部分PKLR及丙酮酸调控HCV和HBV复制的研究。研究方法:1、将miR-130a模拟物(mimic)转染HCV复制子细胞(Con1b细胞)及JFH1感染的Huh7.5.1细胞(JFH1细胞),使miR-130a高表达,检测miR-130a高表达对内源性IFNα/β生成、干扰素刺激基因(ISGs)表达及HCVRNA复制的影响;在干扰素受体缺陷的细胞U5A中及其母细胞2fTGH中转染miR-130a模拟物,检测两种细胞中,ISGs的表达,明确miR-130a对ISGs表达的影响是否依赖于干扰素与其受体的结合。2.在Con1b及JFH1感染的Huh7.5.1细胞中,加入骨化叁醇(Calcitriol,VD的活性形式)处理、转染miR-130a模拟物或转染miR-130a模拟物的同时加入骨化叁醇处理,检测骨化叁醇、miR-130a对HCV复制、IFNα/β表达的影响,并检测二者是否具有协同作用。3、采用四种预测软件(TargetScan、miRanda、RNAhybrid 及 PITA)对 miR-130a 可能发挥作用的靶基因进行预测,通过双荧光素酶报告基因实验对可能作用的叁个靶基因(IL18BP、PKLR及LDLR)进行验证。在HCV复制子细胞OR6、JFH1感染的Huh7.5.1、JFH1感染的人原代肝细胞(PHHs)中或者HBV细胞系HepAD38、HBV 感染的 pNTCP-PHHs、HBV 感染的 pNTCP-Huh7.5.1 细胞中,转染 miR-130a模拟物(mimic)或者 miR-130a表达抑制物(inhibitor)或者 CRISPR/Cas/9gRNA,考察miR-130a过表达、抑制或基因沉默对HCV RNA复制、HBV DNA复制及对PKLR表达的影响。4、靶基因功能研究,通过构建PKLR过表达质粒,将质粒转染细胞进行过表达或者通过小分子干扰RNA(siRNA)或CRISPR/Cas9技术使其沉默,检测PKLR过表达及沉默对HCV及HBV复制的影响。同时考察PKLR催化反应产物丙酮酸对HCV、HBV复制的影响,以及补充丙酮酸是否对miR-130a高表达及PKLR沉默引起的病毒复制的抑制具有营救效果。研究结果:1、JFH1感染的Huh7.5.1及HCV复制子细胞Con1b中,miR-130a过表达后,HCV RNA复制显着降低,Ⅰ型干扰素(IFNα/β)及一些ISGs基因(Mx1,CH25H)的表达显着增加,但miR-130a的表达不受IFNα刺激的影响。此外,在干扰素受体IFNAR2c缺失的U5A细胞中,miR-130a高表达对ISGs基因无上调作用,提示miR-130a对ISGs的调节是通过干扰素信号通路实现的。2、骨化叁醇不影响miR-130a的表达;miR-130a过表达及骨化叁醇均显着抑制HCV RNA复制,两者具有一定的迭加作用。miR-130a过表达及骨化叁醇均显着促进IFNα/β的表达,但在miR-130a过表达的同时加入骨化叁醇,IFNα/β的表达低于单独处理组。miR-130a过表达及骨化叁醇均显着抑制HCV入胞受体LDLR的表达及HCV的入胞吸附过程,且同时处理具有一定的迭加作用。这些结果提示,miR-130a过表达与骨化叁醇的抗病毒迭加效应与Ⅰ型干扰素信号通路无关,很可能是通过调节病毒的吸附入胞实现的。3、通过四种不同的软件对miR-130a可能作用的靶基因进行预测,我们获得2152个潜在的靶基因,其中有534个基因同时由2种以上的软件获得;通过文献检索的方法,我们从中筛选了 116个与病毒感染及肝脏疾病相关的基因进行研究,通过荧光定量PCR的方法,我们发现,在miR-130a高表达的细胞中,PKLR(编码丙酮酸激酶,广泛存在于肝脏及红细胞中),IL18BP(编码白介素18结合蛋白),LDLR(编码低密度脂蛋白受体)叁个基因的表达显着降低。对这叁个基因,我们进行了双荧光素酶报告基因实验,结果证实PKLR为miR-130a的靶基因,而IL18BP和LDLR不是。miR-130a高表达显着抑制PKLR的表达和HCV、HBV的复制;miR-130a表达抑制或基因沉默显着促进PKLR的表达及HCV和HBV的复制。4、PKLR过表达显着促进HCV及HBV的复制;PKLR基因沉默显着抑制HCV及HBV的复制。无丙酮酸培养基中培养的细胞,当向培养基中加入丙酮酸溶液后,HCV及HBV的复制显着增加,且在miR-130a过表达及PKLR沉默的实验组中加入丙酮酸,丙酮酸对miR-130a高表达及PKLR沉默导致的HCV、HBV复制的抑制具有营救作用。但是PKLR及丙酮酸处理均不影响miR-130a的表达,提示PKLR及丙酮酸位于miR-130a调节通路的下游。研究结论:1、miR-130a过表达显着抑制HCV及HBV的复制;而miR-130a表达抑制或基因沉默显着促进HCV及HBV的复制。miR-130a高表达与骨化叁醇对HCV复制的抑制具有迭加效应。2、miR-130a过表达上调IFNα/β的表达,通过与细胞表面的干扰素受体结合,激活下游ISRE及ISGs的表达。但miR-130a与骨化叁醇的抗病毒迭加作用与Ⅰ型干扰素信号通路无关。3、PKLR为miR-130a直接作用的靶基因,miR-130a通过调节PKLR的表达,影响其催化的丙酮酸生成过程,进而影响HCV和HBV的复制。4、miR-130a对Ⅰ型干扰素通路的调控与PKLR的表达及丙酮酸生成无显着的关联。
牛学敏[8]2017年在《miR-1273g-3p在HCV相关肝纤维化中的作用及调控机制研究》文中研究说明丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是慢性肝脏疾病的主要病因。据世界卫生组织统计,全球约有1.85亿丙型肝炎病毒感染者,感染率约3%。我国的HCV感染率呈逐年上升,2013年报告病例数超过22万人。前瞻性研究显示80%的急性丙型肝炎患者可进展为慢性感染,HCV感染20-30年后,可导致肝硬化,肝衰竭及肝细胞癌。据估计到2025年,HCV相关的死亡率将增加3倍,是引起慢性肝脏疾病死亡的重要原因之一,严重危害人类健康。肝纤维化作为慢性HCV感染进展为肝硬化、肝衰竭及肝细胞癌的重要病理过程。因此,肝纤维化的早期诊断及有效的抗纤维化治疗是阻止该病进展的重要措施。目前肝穿刺组织病理学检查是诊断肝纤维化分期的金标准,但由于标本量限制及有创性,不适宜反复进行,且部分患者不易接受。因此,迫切需要探寻准确判断肝纤维化分期及进展的分子生物学标志物。微小RNAs(microRNAs,miRNAs/miR)是一类内源性非编码单链小RNA,可通过与靶mRNA的3'端非翻译区(untranslated region,UTR)结合,抑制mRNA翻译,对基因转录后水平进行负性调控。miRNAs参与体内正常细胞的生长、分化及增殖。大量研究表明miRNAs可参与细胞外基质成分的沉积及调节纤维化相关的信号通路。特异性阻断或促进相关miRNAs表达可能逆转肝纤维化的形成。因此,差异表达的miRNAs在HCV相关肝纤维化中的作用及分子机制有待进一步研究。本研究采用慢性HCV感染病例及建立HCV相关肝纤维化细胞模型,观察差异表达miRNAs与HCV相关肝纤维化发生发展的关系,预测其靶基因及主导信号转导通路,阐明靶向调节miRNAs及其靶基因在HCV相关肝纤维化中的作用及分子机制,并进一步通过临床病例验证差异表达miRNAs对丙型肝炎肝纤维化分期的诊断价值,以为该病早期诊断提供敏感、特异的新型分子诊断标志物,为临床上从基因水平诊断及防治该病提供新途径及科学依据。第一部分hcv相关肝纤维化患者血清差异表达mirna的筛选、验证及靶基因预测目的:筛选hcv相关肝纤维化患者血清中差异表达的mirnas,验证及靶基因预测。方法:选择河北医科大学第叁医院的慢性hcv感染者61例,另选与性别、年龄匹配的健康体检者20例作为对照组,留取血清备用。慢性hcv感染者均由血清学及肝组织病理学确诊,根据metavir评分系统将hcv患者分为轻度纤维化组(f<2,n=27)和中至重度纤维化组(2≤f<4,n=34)。另选5例肝移植供体作为健康对照组。血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,alt)及天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,ast)水平采用酶法检测;肝组织切片行苏木素-伊红(haematoxylinandeosin,he)染色及masson叁色染色,观察肝组织纤维化程度;采用lcsciencesmicrorna基因表达谱芯片筛选hcv相关肝纤维化差异表达mirnas,采用实时定量pcr进行验证;原位杂交方法检测肝组织中mirna的表达情况;采用生物信息学3种软件对mirna的靶基因进行共同预测,并用双荧光素酶报告基因实验进行验证。结果:1一般情况:健康对照组(n=20),其中男性8例,女性12例,平均年龄(48±9.7)岁;hcv感染患者f<2组(n=27),其中男性11例,女性16例,平均年龄(47.44±11.8)岁;hcv感染患者2≤f<4组(n=34),其中男性15例,女性19例,平均年龄(52.40±7.8)岁。叁组年龄之间差异无统计学意义(f=2.006,p=0.141)。2血清alt、ast水平:健康对照组、hcv感染患者f<2组及hcv感染患者2≤f<4组血清alt中位数分别为25.5、48、31u/l,叁组之间差异具有统计学意义(z=6.262,p=0.044);血清ast中位数分别为23.5、38、44u/l,叁组之间差异具有统计学意义(z=29.511,p=0.000)。两两比较结果显示,hcv感染患者f<2组、2≤f<4组血清alt显着高于健康对照组(p=0.032,p=0.005);hcv感染f<2组、2≤f<4组患者血清ast均显着高于健康对照组(均p=0.000)。3肝组织病理学特征:健康对照组肝小叶结构正常,hcv感染者f<2组肝组织可见肝细胞轻度水样变,窦周轻度纤维化,少量纤维化组织增生;2≤f<4组可见肝细胞中至重度水样变,可见窦周纤维化;汇管区扩大,纤维组织增生明显,纤维间隔形成。4mirnas芯片结果:采用mirnas芯片筛选hcv相关肝纤维化患者血清中差异表达的mirnas,筛选出41个差异表达mirnas,其中表达上调的有30个(has-mir-7977,has-mir-1273g-3p等),下调的有11个(has-mir-191-5p,has-mir-4289等)。5mirnas的验证及相关性分析:应用实时定量pcr方法检测,结果显示hcv相关肝纤维化患者血清中mir-1273g-3p表达较对照组明显上调,与芯片结果一致(p<0.05),sperman相关分析mir-1273g-3p与肝纤维化分期呈正相关(r=0.601,p=0.000)。应用原位杂交技术检测到hcv相关肝纤维化肝组织中mir-1273g-3p表达随着肝纤维化的进展其表达明显增多。6mir-1273g-3p的靶基因预测:应用3种靶基因预测软件预测mir-1273g-3p的靶基因,其中10号染色体缺失性磷酸酶张力蛋白同原物基因(phosphataseandtensinhomologydetetedonchromosometen,pten)3'utr区存在mir-1273g-3p的结合位点并应用双荧光素酶报告基因实验进行验证。结论:1hcv相关肝纤维化患者血清中mirnas差异表达明显,提示mirnas可能参与了该病的进展。2血清mir-1273g-3p在hcv相关肝纤维化患者表达较正常组明显上调,并在中至重度肝纤维化患者进一步升高,且与肝纤维化分期呈正相关。3mir-1273g-3p能与pten特异性结合,提示pten为mir-1273g-3p的靶基因。第二部分mir-1273g-3p在体外活化肝星状细胞中的表达变化目的:建立稳定表达hcv核心蛋白的hepg-core细胞系,探明mir-1273g-3p在肝星状细胞(hepaticstellatecell,hsc)活化中的作用。方法:将pcdna3.1-hcv核心蛋白质粒转染至hepg2细胞,构建稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系并用实时定量pcr和westernblot进行验证;酶联免疫吸附实验检测hepg2细胞上清液中转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,tgf-β1)水平。将细胞培养上清液作为条件培养基处理人肝星状细胞系lx-2,检测lx-2中mir-1273g-3p及靶基因pten的表达变化;实时定量pcr,westernbolt及免疫细胞荧光染色方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)、?型胶原α1(alpha-1typeicollagen,col1a1)及tgf-β1表达;细胞增殖-毒性检测试剂盒(cellcountingkit8,cck-8)检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。结果:1成功建立稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞系:与对照hepg2-nc细胞相比,hepg2-core细胞能够稳定表达hcvcoremrna和蛋白;培养上清液中tgf-β1水平显着升高。2hepg2-core细胞培养上清液作为条件培养基可促进hsc活化及增殖,抑制其凋亡:hepg2-core细胞培养上清液促进lx-2细胞α-sma、col1a1及tgf-β1mrna及蛋白表达显着增加,促进lx-2细胞的活化及增殖,抑制lx-2细胞的凋亡。3在活化的hsc中,mir-1273g-3p表达显着增加,靶基因pten表达显着下调:mir-1273g-3p在表达hepg2-core细胞培养上清液诱导活化的hsc中表达显着上调,靶基因pten随着hsc的活化其表达显着减少。结论:1稳定表达hcv核心蛋白的hepg2-core细胞上清液可作为条件培养基促进lx-2细胞活化及增殖,抑制其凋亡。2mir-1273g-3p在活化的hsc中升高,靶基因pten表达下调。第叁部分靶向调控mir-1273g-3p及靶基因pten对肝星状细胞活化的影响及作用机制目的:明确过表达及抑制mir-1273g-3p及其过表达靶基因pten对活化hsc的影响及分子生物学机制。方法:应用肝星状细胞系lx-2细胞,将50μmmir-1273g-3pmimic、100μminhibitor及各自的对照组,过表达载体pten及对照组转染至lx-2细胞;采用cck-8测定各组细胞活力,采用实时定量pcr及westernblot检测mir-1273g-3p,靶基因pten及下游信号因子,肝纤维化相关基因的表达情况。结果:1抑制或过表达mir-1273g-3p对hsc活化、增殖及凋亡的影响:抑制mir-1273g-3p能够显着抑制α-sma、col1a1及tgf-β1mrna及蛋白的表达;cck-8结果显示,转染100μmmir-1273g-3pinhibitor后,lx-2的细胞活力明显降低;pi标记的流式细胞仪检测,应用mir-1273g-3p抑制剂后,lx-2的细胞凋亡率明显增多。过表达mir-1273g-3p后上述结果呈相反趋势。2抑制或过表达mir-1273g-3p对靶基因pten、下游信号通路因子及纤维化因子的影响:抑制mir-1273g-3p后,靶基因pten的蛋白表达明显增多,mrna的表达无明显差异;其下游akt的表达明显减少;促凋亡指标bad、bax、caspase9/3及parp的表达明显增多,抗凋亡指标bcl-2的表达明显减少。过表达mir-1273g-3p后,靶基因pten的表达明显减少,下游因子akt的表达明显增多,促凋亡指标bad、bax、caspase9/3及parp的表达明显减少,抗凋亡指标bcl-2的表达明显增多。3过表达靶基因对pten、下游信号通路因子及肝纤维化因子的影响:过表达pten后,pten的表达水平明显上调,同时下游基因akt的mrna水平及p-akt蛋白水平表达下调;促凋亡指标bad、bax、caspase9/3及parp的表达显着上调,抗凋亡因子bcl-2表达水平下调;肝纤维化因子α-sma、col1a1及tgf-β1的表达水平表达明显减少,lx-2细胞的凋亡率明显增加。结论:1抑制mir-1273g-3p能够减少hsc的活化、增殖及胶原分泌,促进hsc的凋亡。2抑制mir-1273g-3p能够上调hsc内靶基因pten的表达,抑制下游因子akt的表达,进而促进hsc凋亡。3过表达pten可抑制hsc的活化及增殖,促进hsc的凋亡。第四部分mir-1273g-3p对丙型肝炎肝纤维化分期的诊断价值目的:对比分析mir-1273g-3p、lsm、arpi及fib-4与肝纤维化分期的相关性及受试者曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve,roc)下面积,明确mir-1273g-3p诊断丙型肝炎肝纤维化分期的价值。方法:肝穿证实慢性丙型肝炎患者112例,均于肝穿前后1周,同步检测肝脏生化、外周血小板计数及fibrotouch检测肝脏硬度值(liverstiffnessmeasurement,lsm),根据metavir纤维化评分系统分成3组(f<229例,2≤f<447例,f=426例),外周血血小板(platelet,plt)采用自动五分类血细胞分析仪检测;采用olympus全自动生化分析仪检测肝脏生化指标;apri和fib-4指数按公式进行计算;spearman分析mir-1273g-3p、lsm、apri和fib-4与肝组织病理学分期的相关性;采用roc曲线对比分析mir-1273g-3p、lsm、apri和fib-4诊断不同纤维化分期的诊断效能。结果:1患者的一般情况:慢性丙型肝炎患者112例,f<2组39例,其中男性17例,女性22例,平均年龄(43±12.42)岁;2≤f<4组47例,其中男性22例,女性25例,平均年龄(52.29±9.54)岁;f=4组26例,其中男性17例,女性9例,平均年龄(55.19±10.18)岁,叁组之间年龄的差异具有统计学意义(χ2=12.294,p=0.000),两两比较结果显示,2≤f<4组及f=4组间年龄无显着性差异(p=0.274),但高于f<2组(p值均为0.000)。2血清酶学水平:f<2组、2≤f<4组及f=4组血清alt中位数为31.5、33、38.4u/l,叁组之间alt差异无统计学差异(χ2=1.604,p=0.199);f<2组、2≤f<4组及f=4组血清ast中位数为34、39、48.5u/l,叁组之间ast差异无统计学差异(χ2=1.175,p=0.245);f<2组、2≤f<4组及f=4组血清tbil中位数为12.7、13.9、17.31μmol/l,叁组之间tbil差异有统计学差异(χ2=5.603,p=0.035),f=4组血清tbil中位数高于f<2组、2≤f<4组(p=0.002,p=0.004);f<2组、2≤f<4组及f=4组血清plt中位数为183×109/l,149.6×109/l,125×109/l,叁组之间plt差异有统计学差异(χ2=13.518,p=0.000),f=4组及2≤f<4组血清plt水平低于f<2组(p=0.001,p=0.000);f=4组血清plt水平低于2≤f<4组(p=0.021)。3mir-1273g-3p、lsm、fib-4及apri与丙型肝炎肝纤维化分期的相关性:以肝组织病理学分期为依据,spearman相关分析了血清mir-1273g-3p的表达与肝纤维化的分期呈正相关(r=0.657),lsm,apri和fib-4与肝组织病理学也显出很好的相关性(r=0.815,0.417,0.522)。4对比分析mir-1273g-3p,lsm,fib-4及apri对丙型肝炎肝纤维化分期的诊断价值及影响因素:ROC下面积结果显示miR-1273g-3p诊断肝纤维化分期S≥2,S=4的ROC曲线下面积分别为(0.841,0.933),明显高于FIB-4(0.791,0.766)和APRI(0.719,0.760),低于LSM(0.890,0.937)。Spearman相关分析显示:miR-1273g-3p与年龄,体重指数,ALT,AST及TBIL呈正相关,相
洪伟[9]2014年在《抗HCV多肽的筛选、设计与作用机制研究》文中认为丙型肝炎病毒(HCV)是一种正链RNA病毒,在分类学上属于黄病毒科。HCV是慢性肝炎,肝硬化和肝癌等慢性肝病的主要诱因,目前在全球范围内大约有2亿人被感染。多年以来,临床上主要依靠干扰素配合病毒唑的鸡尾酒疗法来治疗HCV的感染,近年来发展了蛋白酶抑制剂配合上述二联疗法的新型抗病毒模式,并取得了一定的治疗效果。但是由于药物副作用、耐药性的产生以及患者的持续病毒学应答存在差异等因素,现行治疗方法并不能满足临床的需要。同时,由于缺乏有效的疫苗来对HCV的感染进行预防,寻找并开发新型的抗HCV药物显得尤为重要。本实验室构建了西藏特里豚蝎和叁脊豚蝎毒腺组织cDNA文库,并从中发现了13条具有潜在抗微生物功能的多肽分子。通过化学合成的方法获得了这13条多肽,从中发现了具有抗HCV感染功能的多肽Ctry2459。在体外条件下,Ctry2459多肽能够采用一种“剥膜”的方式将HCV的包膜和核壳结构分离,从而有效抑制HCV的早期感染,但不影响病毒的核壳及其RNA。这种抑制作用具有快速高效的特点,Ctry2459多肽抑制HCV感染的半数有效浓度(EC50)为1.84μg/ml,对Huh7.5.1细胞系的半数毒性浓度(CC50)为79.8μg/ml,药物选择指数(SI)为43.4,半数溶血浓度(HCs0)为137.9μg/ml,表现出了较好的药理学性能。尽管天然蝎毒肽Ctry2459具有一定的抗HCV感染作用,但它缺乏对HCV的感染后抑制功能。这种功能缺陷是由于Ctry2459多肽的细胞摄取量低并受到细胞内含体的限制,通过调节细胞摄取和内含体通路能够有效改善它的生物利用度。在此基础上,以天然多肽Ctry2459为分子模板,设计了两条富含组氨酸的衍生肽Ctry2459-H2和Ctry2459-H3。进一步研究发现,衍生肽Ctry2459-H2和Ctry2459-H3保持了与天然多肽Ctry2459类似的α螺旋结构以及抑制HCV初期感染的功能,它们抑制HCV感染的作用也具有快速高效的特点,EC50分别为1.08μg/ml和0.85μg/ml。通过共聚焦显微镜观察发现Ctry2459衍生肽能够有效地突破细胞摄取和内含体的障碍,从而发挥对HCV感染后的抑制作用。在HCV感染48小时后使用20μg/ml Ctry2459-H2和Ctry2459-H3多肽进行处理,可以分别抑制细胞内40%和70%的HCV含量。此外,研究也发现Ctry2459-H2和Ctry2459-H3多肽具有更低的细胞毒性和溶血性,CC50均大于500μg/ml, HC50分别为203.3μg/ml和416.4μg/ml。因此,与天然多肽Ctry2459相比,衍生肽Ctry2459-H2和Ctry2459-H3展示出了更高的成药性。另外,本研究依据HCVp7离子通道的结构和功能特征,从其跨膜结构域截取了4条可能具有干扰正常通道组装的多肽序列。通过化学合成的方法获得了多肽,并从中发现了对HCV具有感染后抑制作用的多肽p7avp3。体外条件下,p7avp3多肽能够有效抑制HCV的感染后增殖,其EC5o为2.19±0.16μM,CC50为83.64±6.95μM,药物选择指数为38.19。尽管p7avp3多肽具有一定的抗HCV功能,但是它的药物选择指数较低,因此需要对其药理学性能进行优化。在p7avp3多肽的基础上,根据氨基酸的极性以及电荷等特征,设计了10条新的衍生肽,并从中发现了比p7avp3抗病毒功能更强的多肽p7avp5。体外条件下,p7avp5多肽能够高效抑制HCV的感染后增殖,其ECso为1.09±0.13μM,CC50为115.99±16.68μM,药物选择指数为106.41,展示出了更好的药理学性质。此外,p7avp3和p7avp5多肽均表现出了较低的溶血性以及较高的血清稳定性。进一步开展了p7avp5多肽抗HCV的机制研究。通过不同给药方式的抗病毒实验发现,p7avp5多肽可以在多种条件下抵抗HCV的感染,包括作用于细胞和病毒来抑制病毒早期感染,抑制病毒的入侵和感染后增殖。其中,当p7avp5多肽直接作用于HCV时,抗病毒功能最高效,且不依赖于对病毒核酸的破坏。用FITC标记多肽并在共聚焦显微镜下观察发现,p7avp5多肽能够快速吸附到细胞膜上并导致HCV感染的下降,随着时间的推移,p7avp5多肽逐渐在细胞膜上富集并进入细胞质,导致细胞内病毒粒子的感染性下降。因此,p7avp5多肽可能采取了叁种作用模式来发挥抗HCV功能,包括封闭细胞和钝化病毒抑制早期感染,以及进入细胞钝化病毒来抑制二次感染。此外,电生理实验结果显示,p7avp5多肽不影响p7离子通道的正常组装及其生理功能,也不阻断其电流,并且不抑制HCV从宿主细胞的释放过程。综上所述,本研究从蝎活性多肽资源库中发现了新的天然抗HCV多肽分子Ctry2459,通过对其合理的优化设计获得了具有高生物利用度以及抗HCV功能的衍生肽。同时,以HCVp7离子通道为基础,设计并鉴定了新的抗HCV多肽分子p7avp5,解析了该多肽的抗HCV功能与机制。本研究发现了具有潜在应用价值的抗HCV多肽分子,丰富了现有的抗病毒多肽开发策略,并为天然动物毒素多肽的开发利用以及新型抗病毒多肽的筛选和设计提供了理论和应用基础。
佚名[10]2015年在《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》文中研究指明为规范丙型肝炎的预防、诊断和抗病毒治疗,中华医学会肝病学分会和感染病学分会根据丙型肝炎病毒感染的特点,国内外的循证医学证据和药物的可及性,于2015年组织国内有关专家更新了《丙型肝炎防治指南》。完善的病毒学检测是慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染筛查、监测、诊断和治疗的基础。根据我国社会和经济发展情况,还需要积极发展适宜于资源有限地区HCV RNA定量和HCV
参考文献：
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[10]. 丙型肝炎防治指南(2015年更新版)[J]. 佚名. 中华实验和临床感染病杂志(电子版). 2015
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