马晓冬, 马文丽, 孙朝晖, 吕梁, 郑文岭[1]2004年在《制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的初步研究》文中进行了进一步梳理建立制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的技术 ,并探讨研制检测炭疽芽胞杆菌基因芯片的方法。酶切炭疽芽胞杆菌的毒素质粒和荚膜质粒 ,通过建立质粒DNA文库的方法获取探针 ,并打印在经过氨基化修饰的玻片上 ,制成用于炭疽芽胞杆菌检测的基因芯片。收集了 2 90个阳性克隆探针 ,制备了检测炭疽芽胞杆菌的基因芯片。提取炭疽芽胞杆菌质粒DNA与基因芯片杂交 ,经ScanArrayLite芯片阅读仪扫描得到初步的杂交荧光图像。通过分析探针的杂交信号初步筛选出 2 73个基因片段作为芯片下一步研究的探针
马晓冬[2]2004年在《制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的初步研究》文中研究指明炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)是可形成芽胞的革兰式阳性需氧菌，可导致炭疽疾病。炭疽是草食动物的一种主要疾病，人类接触土壤中、皮毛上的炭疽杆菌芽胞可以导致感染。芽胞可以通过呼吸道、消化道和皮肤接触感染人类，以皮肤型炭疽最常见。由于炭疽芽胞在环境中的抵抗力极强，有可能为生物恐怖分子所利用而造成社会动荡。2001年美国出现的炭疽杆菌芽胞生物恐怖事件也说明了该菌芽胞的威胁性。无论是生物战的使用，还是作为生物恐怖手段，快速检验和鉴定炭疽芽胞杆菌是最关键的。最近发展迅速的生物高新技术——基因芯片技术为炭疽芽胞杆菌的鉴别诊断提供了一种快速、高效、敏感、经济、自动化的方法。 本研究以炭疽芽胞杆菌的毒素质粒pX01和荚膜质粒pX02为原材料，根据GenBank中两个质粒的特异性基因序列信息，设计引物并扩增了质粒pX01上的特异性基因pagA、lef、cya和pX02上的特异性基因CapB。分别以炭疽芽胞杆菌的毒素质粒pX01和荚膜质粒pX02以及其上的特异性基因为原材料，使用限制性内切酶Sau3AI酶切质粒pX01和pX02及特异性基因，酶切片段经Taq DNA聚合酶72℃补平加A，并与T载体连接，后转化感受态细胞。一次PCR初步鉴定并筛选出炭疽芽胞杆菌DNA片段的阳性克隆。采用牙签插胶的方法回收一次PCR产物并以此为模板进行二次PCR扩增，以减少探针所包括冗余的T载体序列，制备纯净的炭疽芽胞杆菌基因芯片探针。实验中共收集了294个阳性克隆探针，并打印在经过氨基化修饰的玻片上，制成炭疽芽胞杆菌DNA芯片。 此外，根据炭疽芽胞杆菌毒素质粒pX01和荚膜质粒pX02的基因序列信息，并按照寡核苷酸探针设计原则设计了检测炭疽芽胞杆菌的60mer寡核苷酸特异性探针，并使用DMSO作为点样液，将20条60mer特异性寡核苷酸探针打印在经过多聚赖氨酸包被的DAKO硅烷化玻片上，制成检测炭疽芽胞杆菌的寡核苷酸基因芯片。 分别提取苏云金(Bacillus thuringiensis)、蜡样(BacillusCereUS)、枯草(Bacillus subtilis)芽胞杆菌及正常人血液总DNA，以限制性显示技术标记细菌、正常人血液总DNA及炭疽芽胞杆菌的两个质粒DNA并与炭疽芽胞杆菌DNA芯片进行了杂交反应，扫描并分析各探针的荧光强度。实验中对所制备的DNA芯片检测炭疽芽胞杆菌的实验条件做进一步优化。实验结果显示:基因芯片技术可以有效地检验出炭疽质粒的DNA序列成分。采用限制性显示标记技术进行样品的标记，可提高芯片杂交信号;在荧光标记后的样品内加入EDTA，也是一种提高芯片信噪比的方法;此外，在高严谨性的条件下(高温，低盐离子浓度、短时间)杂交可提高芯片检测的特异性。
马晓冬, 马文丽, 肖维威, 张宝, 郑文岭[3]2004年在《炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建》文中认为为制备炭疽芽胞杆菌的基因芯片探针文库,以炭疽芽胞杆菌毒素质粒pX01和荚膜质粒pX02为原材料,用Sau3AI酶切pX01和pX02质粒DNA,TaqDNA聚合酶72℃补平加A,经AT克隆,PCR初步鉴定筛选出炭疽质粒片段的阳性克隆.DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定;用生物信息学方法对其片段进行同源性分析;并将克隆的探针打印于玻片上,制备成炭疽芽胞杆菌基因芯片,与炭疽杆菌质粒DNA样品进行初步芯片杂交的实验.杂交实验的阳性率达到了90%以上,证明大部分克隆探针属于炭疽芽胞杆菌.炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建为基因芯片探针的制备摸索出一条简便、高效、可行的方法.
沈圣[4]2007年在《食品中常见病原菌快速检测系统研究》文中认为目的为建立以磁分离技术为核心的分离系统，摸索制备具有非特异吸附性能的裸磁珠及其包被的条件，为下一阶段免疫磁珠的制备奠定基础。同时建立以蜡样芽胞杆菌为代表的芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的TaqMan实时荧光PCR快速检测方法，并对该方法进行了初步的优化、评价及应用。方法本研究分为两部分内容：1裸磁珠的制备及包被1．1磁珠的制备Fe~(2+)和Fe~(3+)分别与OH离子反应生成Fe(OH)_2和Fe(OH)_3，Fe(OH)_2和Fe(OH)_3不稳定，分别降解生成FeO和Fe_2O_3，即最后生成了Fe_3O_4。用蒸馏水洗涤磁珠至中性，并用磁分离架进行分离。1．2磁珠的包被以1％的醋酸溶解壳聚糖，将壳聚糖包被于制备好的裸磁珠表面后，进而再包被上作为交联剂的戊二醛。2 TaqMan实时荧光PCR快速检测芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌方法的建立通过比较大量芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的特异性基因，最终选择ITS基因作为检测的目的片段。从GenBank中下载ITS基因序列并进行同源性比较，选择保守区段进行引物和探针的设计。对比CTAB法和硅胶模型基因组DNA提取法两种DNA提取方法，选取实时荧光PCR快速检测方法建立初期，合适的DNA标准制备方法。同时，通过优化引物浓度、退火温度、探针浓度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度以及缓冲液浓度，以建立起TaqMan实时荧光PCR快速检测芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌的方法。最后，检验该方法的灵敏度和特异性，并对模拟样品进行了检测。结果1磁珠的制备和包被成功制备出裸磁珠，经透射电镜观察，裸磁珠直径达到纳米级，制备的磁珠在溶液中悬浮性较好，在磁场的作用下可较好的分离该磁性微粒。壳聚糖溶解于1％醋酸后用于包被制备的磁珠，包被磁珠体积增大，可用于连接抗体，为后续免疫磁珠的制备奠定了基础。2选取16S-23S rDNA基因间区序列作为目的基因设计引物和探针如下：上游引物：5′-GAGTCCATTTAGGCCCACCATAC-3′下游引物：5′-AGCTTGGCGACTGGAGGACGC-3′TaqMan探针：5′-FAM-CAAGGCAGGCGCTCTCCCAGCTGAG-TAMRA-3′经过优化，成功建立了以蜡样芽胞杆菌为代表的芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群TaqMan实时荧光PCR的快速检测方法，优化后的反应体系如下表所示。并通过比较，最终选取硅胶模型基因组DNA提取法，成功制备了该检测方法的DNA初标准。同时该方法的评测结果显示，该方法的检测灵敏度达到172fg，菌液灵敏度达到22cfu／反应体系；且该方法特异性较好，可同时检测包括蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌在内的4种芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌。结论本研究为建立常见食源性病原菌快速检测系统，在分离手段上成功制备了纳米级的裸磁珠和包被磁珠，为下一步免疫磁珠的建立奠定了良好的基础。同时，成功建立了芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群TaqMan实时荧光PCR快速检测方法，为芽胞杆菌Ⅰ群大细胞群细菌引起的食物中毒检测提供了又一灵敏、特异的方法。
朱义广[5]2011年在《苏云金芽胞杆菌幕虫亚种YBT-020晶胞粘连基因簇的克隆及内生质粒pBMB26和pBMB28序列分析与功能验证》文中研究表明苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性菌,主要特征是在形成芽胞的过程中伴有杀虫晶体蛋白组成的伴胞晶体的形成。大多数苏云金芽胞杆菌的伴胞晶体在母细胞一侧形成,当芽胞成熟母细胞裂解后,晶体和芽胞处于游离的状态。而少数亚种(如幕虫亚种)形成的伴胞晶体定位于芽胞外壁和芽胞衣之间,当母细胞裂解后伴胞晶体和芽胞不会分离,这种特殊的表型被称为晶胞粘连(Spore-Crystal Association,简称SCA)。晶胞粘连表型在半个世纪前就已经被鉴定出来,而对于其形成机制,至今还没有报道。本研究以具有典型晶胞粘连表型的苏云金芽胞杆菌幕虫亚种YBT-020为出发菌株开展了相关实验,结果如下：1.采用Solexa测序技术测定了YBT-020的全基因组序列,并进行了初步分析。结果表明YBT-020的基因组由1条染色体和2个质粒构成,其中染色体的长度为5,355,490个碱基对(bp),共编码5,477个开放阅读框(ORF)；质粒pBMB26大小为187,880 bp,质粒pBMB28大小为139,013 bp,分别编码200和149个ORFs。2.通过接合转移实验确定控制晶胞粘连的基因位于质粒pBMB26和pBMB28上。通过构建菌株YBT-020的基因组细菌人工染色体文库,从中筛选到6个克隆子重迭覆盖完整的pBMB26序列,4个克隆子重迭覆盖完整的pBMB28序列。利用片段互补实验将控制晶胞粘连的基因定位在pBMB26和pBMB28的两个35kb的片段上,通过缺失实验获得控制晶胞粘连最小的区域。质粒pBMB26上最小区域仅编码晶体蛋白基因cry26Aa;质粒pBMB28上最小区域编码5个基因,分别命名为orfl-orf5,序列比对表明orfl和orf2为晶体蛋白类似基因,orf3,orf4和orf5为芽胞萌发受体类似基因。这6个基因可以在异源宿主BMB171中呈现晶胞粘连表型。3.通过基因敲除和互补实验验证了异源表达获得的6个控制晶胞粘连的基因在菌株YBT-020中的作用,菌株BMBJ1为晶体蛋白基因cry26Aa敲除突变株,镜检发现晶胞粘连表型丢失,互补基因cry26Aa后晶胞粘连表型恢复,说明cry26Aa所编码的晶体蛋白对晶胞粘连是必需的,也同时暗示该蛋白是伴胞晶体的主要成分；菌株BMBJB为orfl和orf2同时敲除突变株,镜检发现在母细胞裂解后晶胞粘连表型丢失,互补这两个基因后晶胞粘连表型恢复,透射电镜表明敲除这两个基因后伴胞晶体形成在芽胞外壁的外侧,互补这两个基因后伴胞晶体产生在芽胞外壁和芽胞衣之间。分别将两个基因移码突变后互补,都不能恢复晶胞粘连表型,说明orfI和orf2在伴胞晶体的定位中起到关键的作用；菌株BMBJB为orf3,orf4和orf5同时敲除的突变株,镜检观察显示母细胞裂解后仍存在晶胞粘连表型,但这种表型没有野生株YBT-020稳定,当连续培养100 h后,基本观察不到晶胞粘连表型存在,互补这叁个基因后,稳定的晶胞粘连表型恢复,说明orf3,orf4和orf5在晶胞粘连表型稳定中起到重要作用。4.质粒pBMB26序列比对分析发现该质粒没有复制蛋白相似性的基因,仅发现orf69编码ATP依赖的DNA解螺旋酶,orf71编码DNA聚合酶Ⅲ的亚基,这两个基因报道和质粒复制有关。为了证明该区域有复制功能,将12 kb包含这两个基因的EcoRI片段克隆到复制子克隆载体pHT304E上转化无质粒突变株4Q7,实验结果显示该片段具有复制功能。缺失实验和移码突变实验证实最小复制区包含两个基因：orf69和orf70。orf70编码一个未知功能蛋白,预测这个蛋白可能是一类新型的复制蛋白,原因包括复制起始位点(ORI)位于orf70的内部,且该基因编码的蛋白包含一个HTH结构域；orf69编码一个与PcrA解螺旋酶的7个保守结构域有很高同源性的蛋白,命名为PcrA26。为了证明ORF70蛋白是一个新型的复制蛋白,在大肠杆菌中表达纯化了ORF70蛋白；琼脂糖凝胶阻滞实验证明ORF70蛋白与ORI位点存在蛋白质和DNA的相互作用,故将ORF70命名为Rep26。实验结果表明克隆得到的pBMB26复制子是一种新型的复制子。5.序列比对发现pBMB28的ORF32与已报道的复制蛋白Ori44氨基酸序列一致性为93%,由此推测ORF32与其侧翼序列构成p28的复制区。将含有ORF32的4.1kb的EcoRI片段克隆到复制子克隆载体pHT304E上转化无质粒突变株4Q7。实验证明该片段具有复制功能。进一步通过缺失实验,将质粒pBMB28的复制子缩短到一个3kb的片段上,其复制稳定性为71%。序列比对发现BAC克隆子pBAC721可能包含了pBMB28的接合转移区,通过双亲本杂交实验证明pBAC721具有自主接合转移能力,克隆到了pBMB28的接合转移区。
冯松凯[6]2013年在《检测动物皮毛中6种致病菌的基因芯片技术研究》文中研究指明本研究根据WHO、OIE等权威机构公布的各国疾病流行情况和相关的文献资料，结合实验室病原分离、鉴定结果，以动物皮毛中常见的6种致病菌布氏杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、丹毒杆菌、铜绿假单胞杆菌等为研究对象，选择16srDNA基因和gyrB基因进行序列分析，设计两对通用引物和相应的多条细菌鉴别探针，研究同时检测6种致病菌的基因芯片检测方法，并进行实际应用效果评价。主要研究内容和结果如下：1.在对动物皮毛携带布氏杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、丹毒杆菌、铜绿假单胞杆菌等鉴定的基础上，采用CTAB法，酚氯仿法、NaI法和NaOH-SDS法分别提取6种致病菌的核酸，比较提取核酸含量、纯度和完整性，发现：酚氯仿法可作为基因芯片检测的通用核酸提取方法。2.选择在细菌生物学上具有重要意义的16s rDNA基因和gyrB基因，对6种致病菌的序列分析后分别设计2对通用引物和对应的1～5条特异性寡核苷酸探针，每条上游引物标记TAMARA荧光基团。使用芯片点样液将各个探针稀释为30μmol/L，点样制备检测基因芯片，每个矩阵为18×10阵列（行×列），每条探针5个重复点。建立每种细菌基于16s rDNA基因和gyrB基因的通用不对称的PCR方法，其产物与制备基因芯片杂交，优化并建立同时检测6种致病菌的基因芯片方法。结果表明：基因芯片最佳反应条件为使用47%甲酰胺杂交液，42℃杂交4h。该芯片的检测方法特异性好，仅与布氏杆菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、丹毒杆菌、铜绿假单胞杆菌等菌发生特异性反应，与蜡样芽孢杆菌、苏云金杆菌、大肠杆菌O152、李斯特杆菌、沙门氏菌和阪崎肠杆菌不产生假阳性反应。方法的灵敏度最低可达10拷贝数核酸。3.随机选取163份动物皮毛样品进行基因芯片检测，对杂交阳性样品进行细菌分离鉴定或相应的特异性PCR方法检测，检测符合率为100％，表明建立的动物皮毛中携带致病菌的基因芯片检测方法适合临床样品的批量检测。
孙长坡[7]2007年在《苏云金芽胞杆菌G03的芽胞形成相关基因对cry基因表达的影响》文中研究表明苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物。Bt与其它芽胞杆菌相比，一个显着特点就是不仅能够形成芽胞，同时还能产生由杀虫蛋白组成的晶体。在模式芽胞杆菌枯草杆菌中有关芽胞形成的相关基因研究较深入，而Bt晶体形成机制方面的研究主要是集中在杀虫晶体蛋白基因的表达调控，有关晶体形成与芽胞形成相关基因关系的研究报道极少。本研究利用苏云金芽胞杆菌全基因组序列，初步研究了芽胞形成相关基因与杀虫蛋白基因表达、调控的相互关系。利用携带Mini-Tn10转座子的pIC333构建了B．thuringiensis G03的转座子突变体库，获得了50，000株具有壮观霉素抗性的突变体。筛选获得一株不能产生芽胞和晶体的突变株，命名为G03(spoⅢAE)∷Mini-Tn10。分析Mini-Tn10转座子两端的侧翼序列确定了插入位点位于spoⅢAE基因的前端，并造成了9个碱基的重复。Southern blotting分析表明，Mini-Tn10转座子在染色体上只有一个插入位点。SDS-PAGE分析表明晶体蛋白的表达由于spoⅢAE基因的失活而受到严重影响。已知编码晶体蛋白的cry基因是sigmaE、sigmaK因子共同控制转录的，而且sigmaE因子发挥主要作用，据此推测sigmaE因子的活性有可能因spoⅢAE基因的失活而降低。枯草芽胞杆菌作为芽胞杆菌的模式菌，其芽胞形成的级联调控网络中，spoⅢAE基因的转录是由上游的sigmaE因子控制的，SpoⅢAE蛋白则是激活下游的sigmaK因子所必需的，过去未见SpoⅢAE蛋白影响sigmaE因子活性的报道。为进一步分析Bt芽胞与晶体形成相关基因调控的相互作用与特点，我们又开展了下面的研究。构建了spoⅢAE基因的敲除载体pRAE，然后导入G03菌株，通过高温诱导突变获得了spoⅢAE基因的缺失突变株G03(spoⅢAE△)。该突变株不能产生芽胞和晶体，SDS-PAGE分析表明只能产生少量的杀虫蛋白。克隆了G03 cry1Aa基因的启动子，并构建了携带cry1Aa′-′lacZ的表达载体pHTcry1Aa。然后将载体pHTcry1Aa分别导入出发菌株G03和突变株G03(spoⅢAE)∷Mini-Tn10、G03(spoⅢAE△)中，转录分析表明两突变株中的cry1Aa基因活性严重降低。克隆G03菌株中由sigmaE直接调控的spoⅡD基因的启动子，构建了携带spoⅡD′-′lacZ的表达载体pHTspoⅡD。将载体pHTspoⅡD分别导入出发菌株G03和突变株G03(spoⅢAE)∷Mini-Tn10、G03(spoⅢAE△)中，转录分析表明spoⅡD基因的活性显着降低，说明spoⅢAE基因的敲除严重降低了sigmaE因子的活性。以上结果说明spoⅢAE基因的失活导致Bt菌株不产生杀虫晶体，是由于spoⅢAE基因为sigmaE因子维持高活性所必需。在芽胞形成中spoⅢAE基因对sigmaE因子存在一种反向正调节作用，它的缺失导致sigmaE因子活性降低，从而导致cry1Aa基因的活性降低。为证实spoⅢAE基因的下游基因缺失是否影响sigmaE因子活性，我们对直接参与sigmaK因子激活的spoⅣF操纵子进行了以下研究。构建了spoⅣF操纵子的敲除载体pRIVF，敲除spoⅣF操纵子获得了突变株G03(spoⅣF△。该突变株也丧失了产生芽胞和晶体的能力，SDS-PAGE分析表明突变株G03(spoⅣF△)的杀虫蛋白产量也非常低。为了验证spoⅣF操纵子的功能，构建了恢复载体pSIVF进行了功能互补实验。结果表明部分恢复了突变株G03(spoⅣF△)产生芽胞和形成晶体的能力。将载体pHTcry1Aa和pHTSpoⅡD分别导入突变株G03(spoⅣF△)，转录分析表明cry1Aa和spoⅡD基因的活性显着降低，说明spoⅣF操纵子缺失也可导致sigmaE因子的活性降低，进而影响cry1Aa基因的表达。杀虫蛋白表达量的SDS-PAGE分析发现，与spoⅢAE基因相比，spoⅣF操纵子对sigmaE因子的活性影响要小一些。
张永涛[8]2011年在《猪瘟病毒和猪2型圆环病毒基因芯片检测技术研究》文中研究指明本试验采用基因芯片技术、借助PCR和核酸标记技术,构建了猪瘟病毒和猪2型圆环病毒检测基因芯片。不仅为多种猪传染性疾病在同一张芯片上进行检测奠定基础,而且也为其他动物疫病应用基因芯片方法进行检测提供了理论依据。主要内容分为以下几个部分:1.CSFV-PCV2检测基因芯片目的基因的克隆及鉴定通过对CSFV和PCV2进行病原及分子生物学分析,参考GenBank和文献中报道的CSFV和PCV2基因序列,选择其保守序列并采用Primer Primier5.0软件设计引物。采用PCR或RT-PCR方法扩增目的基因,获得2个目的基因片段;用pMD18-T或pUCm-T克隆载体对目的基因进行克隆并对重组质粒进行PCR或酶切鉴定,然后进行测序。试验结果表明:目的基因被成功克隆。多重序列比对进一步表明:克隆鉴定的目的基因为病原体的高度保守基因,为CSFV-PCV2检测基因芯片的构建提供了确实可靠的材料。2.CSFV-PCV2检测基因芯片的构建通过对引物进行标记,使荧光素(Cy3)掺入到PCR产物中,通过对探针进行氨基修饰,使其更好的与经过醛基化的基片更好的结合,探针就能够更好的固定在基片上;通过对重组质粒PCR扩增产物与相应探针杂交温度和杂交时间的优化,筛选出了杂交特异性好的目的基因并确定了适宜的杂交温度和杂交时间,最后通过扫描仪对杂交结果进行扫描获取杂交图像并用计算机软件对杂交结果进行分析,完成CSFV-PCV2检测基因芯片的构建,结果如下:1)目的基因的制备:以目的基因重组质粒DNA为模板,采用PCR扩增、异丙醇沉淀法纯化目的基因,其浓度和纯度均符合芯片制作要求。2)确定了探针最适点样浓度为100ng/μL,筛选出了杂交信号强、杂交特异性好的目的基因,确定了CSFV-PCV2检测基因芯片的杂交温度为48℃,杂交时间为5h。3)确立了点样环境参数:相对湿度55-65%,温度15-30℃。各探针点间距为1.5mm。3.CSFV-PCV2检测基因芯片检测技术研究试验采用以PRV为阴性对照株,对构建的CSFV-PCV2检测基因芯片特异性进行了评价,结果表明:PRV阴性对照和空白对照均没有杂交信号,而CSFV和PCV2杂交信号明显且肉眼可见,基因芯片特异性好;将所提取的重组质粒按10倍梯度稀释至10~(-8),运用PCR方法和芯片方法分别对不同梯度的重组质粒进行检测并进行对比,以评价芯片检测方法的敏感性,结果表明:芯片检测方法的敏感性均好于PCR方法;通过对现地疑似样品进行检测,以评价基因芯片的应用效果,结果表明:基因芯片应用效果较好,能进一步进行试验研究。
李莹[9]2008年在《应对生物恐怖袭击医学防治技术的情报研究》文中研究指明近年来,全球反对生物恐怖主义的形势十分严峻,尤其是美国“9·11”事件后的“炭疽事件”,充分说明了生物恐怖威胁的现实性。因此,反生物恐怖已成为近年世界防生物危害医学领域的研究主题。医学防护是减少生物恐怖袭击对人员危害的重要手段。防治技术的发展对于生物恐怖袭击的医学防护具有重要意义。相关情报研究有助于为反生物恐怖医学防治技术的发展提供情报支持和决策参考。本研究针对应对生物恐怖袭击的医学防治问题,采用文献调研、专家咨询、典型分析法、对比分析法、综合归纳法等情报学研究方法,详细阐述了美国在反生物恐怖医学防护领域制定的相关研究计划以及医学防治技术的研究进展;分析了美国在反生物恐怖医学防治技术研究上的发展趋势;概述了我国在应对生物恐怖袭击医学防治技术方面的研究进展及存在的问题;比较分析了我国与美国在应对生物恐怖袭击医学防治技术研究上存在的差距;并在此基础上,结合我国反生物恐怖医学防治技术发展的实际情况和技术需求,研究提出了相关对策建议。研究包括五个部分。第一部分综述了反生物恐怖的形势及其医学防治技术情报研究的必要性。概述了反生物恐怖的严峻形势;分析了应对生物恐怖袭击医学防治技术研究的必要性:①反生物恐怖严峻形势的迫切需要;②生物技术的发展加剧了生物恐怖的潜在威胁;③针对传统生物剂的医学防治技术不能满足反生物恐怖袭击的需要;④我国同样面临生物恐怖的威胁。美国医学防治技术水平居于世界领先地位,并且近年来在反生物恐怖医学防护领域研究成果显着,值得我国学习借鉴。第二部分探讨了美国应对生物恐怖袭击医学防治技术的研究现状和发展趋势。详细介绍了美国生物防护相关研究计划,包括:美军2000-2010年国防生物医学技术计划、化生防护国防技术目标、国防部化生防护计划、军事关键技术计划、生物盾计划和NIAID生物防护研究战略计划;阐述了近年美国应对生物恐怖袭击医学防治技术的研究进展,以及美陆军传染病医学研究所和华尔特里德陆军研究所发布的生防疫苗和药物相关专利;从研究现状、研究目标、主要技术障碍与挑战、未来研究方向四个方面分析了美国应对生物恐怖袭击医学防治技术的研究现状与发展趋势,主要包括:美国未来生物防护研究的关键目标生物剂是鼠疫耶尔森菌、肉毒毒素、纤丝病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒和西方马脑炎病毒;预防领域研究重点是多价多抗原疫苗、核酸疫苗等;治疗领域研究重点是广谱的药物或治疗方法等;美国还大力开展病原微生物基因组学和蛋白质组学、转基因技术、复制平台等医学防治技术相关科学和技术基础的研究。第叁部分分析了我国应对生物恐怖袭击医学防治技术的研究现状和存在的问题。阐述了近年来我国应对生物恐怖袭击医学防治技术的研究进展以及我国发布的生防疫苗和药物相关专利;分析了我国应对生物恐怖袭击医学防治技术研究存在的问题。相关文献计量分析反映出近年来我国科学界比较重视反生物恐怖的研究。目前我国反生物恐怖医学防治技术研究存在的主要问题包括:生物剂的基础生物学研究相对薄弱,有效新型疫苗与药物研制略有滞后,病毒类生物剂的医学防治技术研究不足,缺乏用于生物防护研究的动物模型等。第四部分对比分析了我国与美国应对生物恐怖袭击的医学防治技术。从生物剂防护研究的目标生物剂、防治技术研究方向、防治技术相关科学和技术基础叁个方面,比较分析了我国与美国在反生物恐怖医学防治技术研究上的异同。相同之处包括:两国都非常重视A类生物恐怖剂的防治研究,尤其是针对炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌和肉毒毒素的医学防治技术研究;现用疫苗均以灭活疫苗、减毒活疫苗等传统疫苗为主;在研疫苗均以重组亚单位疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗等为主;抗生素治疗中出现新型抗生素研发困难和生物恐怖病原体对抗生素产生耐药性等技术障碍;抗病毒药物和抗体是治疗领域的研究重点;防治技术相关科学和技术基础主要涉及病原微生物基因组学和蛋白质组学、重组核酸技术、复制平台技术、抗体工程等。差异之处在于:我国对马尔堡病毒、埃博拉病毒和马脑炎病毒等病毒类生物剂的研究相对较少;我国在转基因植物疫苗等新型疫苗和抗病毒药物方面研究略有滞后;我国尚未将一些先进技术如转基因技术、纳米技术、反义核酸技术等应用于反生物恐怖袭击医学防治技术的研究之中。研究表明,疫苗和药物的发展趋势是在完善已有疫苗和药物基础上,充分利用医学防治技术相关的科学和技术基础,继续研制各种新型疫苗,开发针对多种病原体的广谱性疫苗和药物。第五部分提出了我国应对生物恐怖袭击医学防护技术发展的对策建议。在上述研究基础上,针对我国反生物恐怖医学防治技术发展的实际情况和技术需求,参照美国在防治技术方面的研究经验,研究提出了相关对策建议:①坚持发展和改进一些传统的、经典的技术,如细胞培养技术等;②重点发展目前研究中支柱性的关键技术,如重组核酸技术、复制平台技术、抗体工程技术等;③密切关注前沿的、有发展前景的新技术,如反向疫苗学技术、转基因技术、纳米技术等;④重视与技术相关的科学基础的研究,如病原微生物的基因组学和蛋白质组学等。
王殿冰[10]2008年在《单克隆抗体检测炭疽芽孢》文中进行了进一步梳理炭疽芽孢杆菌是一种杆状革兰氏阳性细菌,且能引起人畜共患的炭疽病。在营养匮乏时,炭疽芽孢杆菌可产生芽孢,以抵御环境中的不利因素。由于炭疽芽孢具有极强的生命力,一直被列入生物武器中头号战斗剂。因此,如何快速,准确的检测炭疽芽孢成为当今人类必须要解决的难题。本研究中,通过灭活的炭疽芽孢作为免疫原,筛到了叁株高亲和力且特异性很好的单克隆抗体(8G3,10C6,12F6)。这叁株抗体不仅可以识别炭疽芽孢表面,还可直接检测完整的炭疽芽孢杆菌,并且同苏云金、蜡样等芽孢杆菌属的其它成员无交叉反应。其中,单克隆抗体8G3与炭疽芽孢亲和力最高,而12F6则是用于炭疽芽孢杆菌检测的最佳选择。经鉴定,叁株抗体的靶抗原均是EA1蛋白。EA1,作为炭疽芽孢杆菌S层的主要抗原之一,已经被广泛认知。然而,研究者们对“EA1是否也是真正的芽孢蛋白”这一问题有着不一样的看法。我们的试验结果表明,在纯化、洗涤芽孢的过程中,该蛋白持续且大量的存在于炭疽芽孢表面。即使经过严谨洗涤的炭疽芽孢,依然可以被我们的单克隆抗体识别。因此,不管上述问题的答案是肯定还是否定,EA1都可用作炭疽芽孢检测的靶标。除此之外,我们首次将表面等离子共振(SPR)传感器应用于炭疽芽孢的检测,并且建立了直接,快速,灵敏且无标记的炭疽芽孢检测方法。该方法基于BIAcore3000传感器,特异性单克隆抗体8G3及消减抑制试验,可在40 min之内,检测出浓度低至为10~4 CFU/ml的炭疽芽孢,并且很容易将其与苏云金,蜡样等其它近缘细菌的芽孢分开。因此,该方法可作为实验室检测炭疽芽孢的另一种选择,一旦便携式SPR可以获得,即可应用于炭疽芽孢的现场检测。
参考文献：
[1]. 制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的初步研究[J]. 马晓冬, 马文丽, 孙朝晖, 吕梁, 郑文岭. 微生物学报. 2004
[2]. 制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的初步研究[D]. 马晓冬. 第一军医大学. 2004
[3]. 炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建[J]. 马晓冬, 马文丽, 肖维威, 张宝, 郑文岭. 生命科学研究. 2004
[4]. 食品中常见病原菌快速检测系统研究[D]. 沈圣. 四川大学. 2007
[5]. 苏云金芽胞杆菌幕虫亚种YBT-020晶胞粘连基因簇的克隆及内生质粒pBMB26和pBMB28序列分析与功能验证[D]. 朱义广. 华中农业大学. 2011
[6]. 检测动物皮毛中6种致病菌的基因芯片技术研究[D]. 冯松凯. 河南农业大学. 2013
[7]. 苏云金芽胞杆菌G03的芽胞形成相关基因对cry基因表达的影响[D]. 孙长坡. 中国农业科学院. 2007
[8]. 猪瘟病毒和猪2型圆环病毒基因芯片检测技术研究[D]. 张永涛. 河南农业大学. 2011
[9]. 应对生物恐怖袭击医学防治技术的情报研究[D]. 李莹. 中国人民解放军军事医学科学院. 2008
[10]. 单克隆抗体检测炭疽芽孢[D]. 王殿冰. 华中农业大学. 2008