酯酰辅酶A胆固醇酰基转移酶1对BCG诱导巨噬细胞自噬的调控作用研究

论文摘要

结核分枝杆菌（Mycobacterium tubercuLosis,Mtb）是引起人和动物结核病的病原体。巨噬细胞作为Mtb的主要靶细胞和免疫细胞,在抗Mtb感染中发挥着重要作用。研究表明,巨噬细胞可通过自噬途径有效清除Mtb,而Mtb也可通过某些机制逃避自噬的清除作用。酯酰辅酶 A 胆固醇酰基转移酶（Acyl Coenzyme ACholesterol Acyltransferases,ACAT）蛋白家族在体内胆固醇吸收与代谢平衡中发挥着重要作用。ACAT1是游离胆固醇酯化的关键酶,广泛存在于动物组织和细胞中。ACAT1的高表达可影响胞内胆固醇代谢平衡并促进巨噬细胞泡沫化,也可对细胞自噬水平产生影响。为了探究ACAT1对Mtb诱导巨噬细胞自噬的调控作用及其机制,本研究在BCG感染巨噬细胞的基础上,分别采用ACAT1抑制剂阿伐麦布（Avasimibe）、mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）处理 RAW264.7 细胞、牛肺泡巨噬细胞（Bovine alveolar macrophages,BAMs）及在RAW264.7细胞中过表达/干扰ACAT1后,检测ACAT1蛋白、自噬相关蛋白、PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达及胞内胆固醇水平的变化。实验结果如下:1.BCG感染BAM和RAW264.7细胞2h、6h、12h、24h后,随感染时间的延长,ACAT1蛋白表达量、胞内胆固醇酯含量和胞内脂滴先下降后上升,RAW264.7细胞中12h最低,而BAMs中6h最低,而胞内游离胆固醇含量与之相反。随BCG感染时间的延长,自噬相关蛋白Beclin1和LCⅡ/Ⅰ的表达量先上升后下降,RAW264.7细胞中12h最高,而BAMs中6h最高。结果提示,BCG感染巨噬细胞后,ACAT1可通过改变胞内胆固醇水平影响细胞自噬水平。2.采用慢病毒转染,并经RT-PCR及Western blot方法验证,成功获得了 ACAT1过表达/干扰的RAW264.7稳定转染细胞株,为后续探究ACAT1在BCG诱导巨噬细胞自噬中的调控作用提供了实验材料。3.用Avasimibe处理RAW264.7细胞和BAMs,并经BCG感染12h后,自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、Atg7和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达量显著升高。结果表明,抑制ACAT1可促进BCG诱导的巨噬细胞自噬。4.BCG感染ACAT1过表达的RAW264.7稳定转染细胞株12h后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5和Atg7的表达量显著降低,同时胞内游离胆固醇含量亦显著降低,胆固醇酯含量显著升高;BCG感染ACAT1干扰的RAW264.7稳定转染细胞株12h后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5和Atg7表达量显著升高,同时胞内游离胆固醇含量亦显著升高,胆固醇酯含量显著降低。结果证实,BCG感染巨噬细胞后,ACAT1可通过降低胞内胆固醇酯含量从而促进细胞自噬。5.采用Rapamycin处理RAW264.7细胞和BAMs,并经BCG感染12h后,ACAT1蛋白表达下调。结果表明,PI3K/mTOR信号通路通过影响ACAT1表达进而调控BCG诱导的巨噬细胞自噬水平。6.干扰或抑制ACAT1,并经BCG感染巨噬细胞12h后,PI3K/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、mTOR、P-mTOR和P-Akt蛋白的表达显著下调;而过表达ACAT1并经BCG感染巨噬细胞12h后,PI3K/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、mTOR和P-mTOR蛋白的表达显著上调。结果表明,BCG感染巨噬细胞后,ACAT1对PI3K/mTOR信号通路介导的自噬具有调控作用。上述结果显示,在BCG感染巨噬细胞后,ACAT1通过影响胞内胆固醇水平,并与PI3K/Akt/mTOR信号通路协同作用发挥对巨噬细胞自噬的调控作用。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周彦兵

导师: 王玉炯,徐金瑞

关键词: 巨噬细胞,结核分枝杆菌,胆固醇,酯酰辅酶胆固醇酰基转移酶,自噬

来源: 宁夏大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 宁夏大学

基金: 《肺泡上皮细胞与巨噬细胞互作对牛结核分枝杆菌感染的免疫调节机制研究》(31572494)国家自然科学基金,《LncRNA-ABCA对牛肺泡巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的调控作用研究》(31760733)国家自然科学基金

分类号: Q255;R392

DOI: 10.27257/d.cnki.gnxhc.2019.000867

总页数: 73

文件大小: 7020K

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