张富新[1]2003年在《羔羊凝乳酶提取分离及特性的研究》文中进行了进一步梳理本实验以关中奶山羊皱胃为原料，对羔羊哺乳状况、屠宰年龄、皱胃处理方式和不同提取方法对凝乳酶活性的影响，凝乳酶原的激活，凝乳酶纯化与分离以及凝乳酶和胃蛋白酶特性进行了系统的研究，为羔羊凝乳酶开发以及在干酪生产中的应用提供理论基础。 羔羊哺乳状况研究表明，全哺乳组凝乳活性最高(26108SU／g)，蛋白水解活性与随机哺乳组无明显差别(P＞0.05)，而全喂草料组蛋白水解活性最高(1925U／g)，这表明哺乳能够刺激皱胃中凝乳酶的持续分泌。屠宰年龄实验表明，羔羊出生5天时，凝乳活性与蛋白水解活性比率(C／P)最大，是提取羔羊凝乳酶的最佳年龄。 皱胃处理方式研究结果表明，冷冻处理对酶活性影响最小，盐渍风干处理影响较大，自然风干处理酶活性损失最多。同时还发现盐渍风干处理和自然风干处理可使皱胃中一部分酶原自动激活。 用传统方法和不同pH缓冲液方法提取羔羊凝乳酶时，食盐浓度、提取时间、提取温度、提取液与皱胃比例、提取次数对凝乳活性有重要的影响。随着食盐浓度增大，凝乳活性逐渐提高，当达到一定浓度后，凝乳活性又逐渐降低；在提取初期，提取速度较快，凝乳活性明显提高，当提取达到最大值后，凝乳活性又逐渐下降；随着提取温度的升高，凝乳活性逐渐增大，但温度过高时，会导致酶变性失活；随着提取液与皱胃比例的增大，酶溶出速度加快，提取次数越多，皱胃中酶提取越充分，提取2次后，皱胃中绝大部分酶被提出。正交试验表明，用传统方法提取时，当食盐浓度8％，皱胃与提取液比例1：20，提取温度30℃，提取时间48h，提取最大凝乳活性为65700SU／g；用pH4.5缓冲液提取时，当食盐浓度6％，皱胃与提取液比例1：10，提取温度30℃，提取时间60h，提取最大凝乳活性为58200SU／g；用pH5.4缓冲液提取时，当食盐浓度8％，皱胃与提取液比例为1：20，提取温度30℃，提取时间48h，提取最大凝乳活性为72300SU／g；用pH6.0缓冲提取时，当食盐浓度8％，皱胃与提取比例1：10，提取温度25℃，提取时间48h，提取最大凝乳活性为63850SU／g。由此可见，用pH5.4缓冲液提取，可获得最大的酶活性产量。 本实验还对超声波在羔羊凝乳酶提取中的应用进行探讨，结果表明，超声提取可大大缩短提取时间，超声提取40min可达到传统方法48h的提取效果。在食盐浓度8％，皱胃与提取液比例1：15时，用30W／cm2超声强度提取40min，可获得最大的凝乳活性。羔羊凝乳酶以无活性的酶原形式分泌，pH，食盐和温度对其激活有重要的影响小H越低，激活速度越快，在 pHZ．0激活时仅需 5—10ruin，pH3．0时需要30min，在较低pH下激活，己激活酶不稳定，易失活；随着缓冲液中NaCI浓度的增加，激活速度随之加快；在5℃下激活速度非常缓慢，25℃以上激活速度明显加快。 干酪生产中应用的酶是凝乳酶和胃蛋白酶的粗提物，应用凝胶过滤层析和离子交换层析对羔羊凝乳酶粗提物纯化分离结果表明，凝胶过滤层析不能使两种酶分离，仅除去一部分杂蛋白；利用DEAE纤维素（DE32）离子交换层析，可除去大部分杂蛋白，使凝乳酶和胃蛋白酶完全分离。此外，在对样品浓缩时发现，羔羊凝乳酶粗提物中含有分子量小于 10000的活性小肽物质，这在凝胶过滤层析时出现峰＊和峰I［l亦得到证实。应用SDS——PAGE凝胶电泳和PAGE凝胶等电聚焦电泳对纯化羔羊凝乳酶和胃蛋白酶测定结果表明，羔羊凝乳酶分子量为30700，等电点为pH4．5；羔羊胃蛋白酶分子量为29900，等电点为pH4．4。 羔羊凝乳酶特性研究表明，最适凝乳温度为45 ’C；45 ’C处理60Inin，酶活性开始降低，60’C处理60min，酶活性完全丧失；酶最适pH为2．（kr刀，在pHZ．（h刀范围内保持24h，具有较好的稳定性；在凝乳过程中，随着原料乳pH下降，凝乳活性逐渐增大；随着酶溶液中离于强度的增加，凝乳活性逐渐降低；乳中＊”具有明显的促凝作用，当CaC12浓度大于0刀3％时，凝乳活性趋势于稳定；AI叶可明显提高酶的凝乳活性，Cu2＋和Zn”对酶活性有抑制作用；随着乳液浓度增大，凝乳活性逐渐增加，当浓度大于 15％时，凝乳活性趋于稳定；以酪蛋白为底物，随着时间延长，蛋白水解活性逐渐增大，动力学特性研究表明，米氏常数llilll为6刁 g／L。 羔羊胃蛋白酶最适凝乳温度为45 ’C；在45℃处理30Inin，酶活性开始下降，60C处理30lliln，酶活性完全丧失；酶的最适pH为1．G－3刀，在此pH范围内具有很好的稳定性；原料乳pH、CaZ”浓度、乳液浓度和离子强度对凝乳活性的影响与凝乳酶规律一致：A13＋明显提高其凝乳活性，FC卜具有一定的促凝作用；以酪蛋白为底物，蛋白水解活性明显高于凝乳酶，米氏常数Km为234．sg／L。
王玮[2]2009年在《不同凝乳酶在羊奶干酪生产中应用效果的研究》文中研究指明本试验以关中奶山羊羊奶为原料,采用丹麦汉森公司生产的FD-DVS R-704中温同型干酪专用发酵剂(含乳酸乳球菌乳脂亚种和乳酸乳球菌乳酸亚种)生产羊奶半硬质干酪,研究羔羊皱胃酶,小牛皱胃酶,微生物凝乳酶及胃蛋白酶4种凝乳酶对羊奶干酪出品率、物化特性、生化特性及质量品质的影响,研究结果如下。(1)用羔羊皱胃酶、小牛皱胃酶、微生物凝乳酶和胃蛋白酶生产羊奶干酪,其出品率有明显差别。用羔羊皱胃酶生产的羊奶干酪出品率最高,其次为微生物凝乳酶,小牛皱胃酶,胃蛋白酶出品率较低。因此,羔羊皱胃酶更适宜羊奶干酪的生产。(2)通过对4种凝乳酶生产的羊奶干酪成熟期间物理化学特性研究表明：4种凝乳酶生产的羊奶干酪成熟期间pH均呈逐渐降低的趋势,用羔羊皱胃酶生产的羊奶干酪pH相对较高,其次为小牛皱胃酶,微生物凝乳酶和胃蛋白酶生产的羊奶干酪pH较低；4种凝乳酶生产的羊奶干酪成熟期间水分含有一定差别,其中小牛皱胃酶干酪水分含量最高,羔羊皱胃酶、微生物凝乳酶和胃蛋白酶干酪水分含量较低；4种凝乳酶生产的羊奶干酪成熟期间蛋白质含量逐步降低,而脂肪含量逐步升高；4种凝乳酶生产的羊奶干酪成熟期间NaCl的含量无明显变化。(3)通过对4种凝乳酶生产的羊奶干酪成熟期间生物化学特性研究表明：4种凝乳酶生产的羊奶干酪成熟期间蛋白质降解程度有一定的差别,其中小牛皱胃酶降解蛋白质的能力最高,其次是微生物凝乳酶和羔羊皱胃酶,胃蛋白酶降解蛋白质的能力最低；用UREA-PAGE凝胶电泳对4种凝乳酶生产的羊奶干酪成熟期间蛋白质降解产物研究显示,小牛皱胃酶生产的羊奶干酪成熟期间αs-酪蛋白降解程度最大,而胃蛋白酶生产的羊奶干酪成熟期间β-酪蛋白降解程度最大；4种凝乳酶生产的羊奶干酪成熟期间脂肪分解和氧化程度也有一定的差别,其中羔羊皱胃酶和小牛皱胃酶生产的羊奶干酪成熟期间脂肪分解程度较高,而胃蛋白酶生产的羊奶干酪成熟期间脂肪氧化程度较高。(4)通过对4种凝乳酶生产的羊奶干酪成熟期间的质量品质研究表明：羔羊皱胃酶生产的羊奶干酪口感舒适、组织结构细腻、风味最好,是最适宜加工羊奶干酪的凝乳酶；微生物凝乳酶生产的羊奶干酪质量品质方面仅次于羔羊皱胃酶；胃蛋白酶和小牛皱胃酶也可以在羊奶干酪生产中使用,但用其生产的干酪在组织结构和风味方面比用羔羊皱胃酶生产的羊奶干酪稍差。
杜琨[3]2006年在《豆乳牛乳混合干酪关键技术的研究》文中研究指明干酪俗称奶酪,是一种在牛乳或羊乳中加入适量乳酸菌和凝乳酶,使乳中的蛋白质凝固,除去乳清并经一定时间的成熟而制成的乳制品。干酪的营养价值极高,内含丰富的蛋白质、脂肪、各种氨基酸、矿物质等,经常食用可以调整膳食结构,增加牛乳的人均消费量,提高蛋白质尤其是优质动物性蛋白质的摄入量。在所有食品中,牛乳的营养是最全面的,而我国的奶源相对短缺,大豆蛋白富含人体必需的八种氨基酸,尤其赖氨酸含量较高,而且比例比较平衡,并且豆乳的组成成分与牛乳极为相似,是牛乳的最佳替代品。以豆乳代替部分牛乳制作干酪,可使动植物蛋白营养互补,节约牛乳单耗,又可以改善干酪风味,降低生产成本。 本文以豆乳和牛乳为原料,对豆乳牛乳混合干酪加工过程中一些关键技术进行了较为系统的研究,为规模化生产混合干酪提供理论依据和工艺参数。研究结果如下: 1.大豆浸泡的最佳工艺参数:用自来水浸豆,在豆水比1∶2,浸泡水温度25℃,浸泡水pH值8.5,浸泡时间8h,NaHCO_3溶液的浓度0.1%时,获得的豆乳蛋白质含量最大。 2.大豆磨浆的最佳工艺参数:豆水比1∶8,磨浆水温度80℃,热烫6min,磨浆时间为8min时,获得的豆乳蛋白质含量相对最大。 3.豆乳中大豆胰蛋白酶抑制剂的失活左法为:热失活,采用95℃杀菌锅中30min,可使豆乳中胰蛋白酶抑制剂的去除率达到80%。 4.对于混合乳来说,分别使用植物凝乳酶、微生物凝乳酶、动物凝乳酶的进行凝乳,结果表明动物凝乳酶使用量少,凝乳效果好,本文使用羔羊凝乳酶凝乳。 5.豆乳牛乳混合乳制作干酪的最佳工艺参数为:即在豆乳的添加量是18%,混合乳的杀菌条件是63℃/30min,羔羊皱胃酶的添加量0.30%,酸化条件是26°T,CaCl_2添加量是0.05%,凝乳温度是36℃时,混合乳凝乳效果较好,混合干酪出品率相对较高。 6.混合干酪成熟期间理化特性表明:混合干酪在整个成熟期间pH值逐渐下降;混合干酪的干物质含量随着成熟时间的延长有所增加。混合干酪中的蛋白质和脂肪含量随着成熟时间的延长先减小后变大,但总的来说蛋白质和脂肪含量均有所增加;混合干酪乳酸含量随着成熟时间的延长有所增加;混合干酪的水分含量随着成熟时间的延长逐渐减少。
曾剑超[4]2008年在《姜汁凝乳机理的探讨》文中研究指明姜汁凝乳俗名姜汁撞奶,用经生姜打浆榨取的姜汁,按照一定比例添加到一定温度下的牛乳中可制得具有凝乳状态的姜汁凝乳。由于其凝乳具有香纯浓郁,甜中微辣、风味独特等特点,逐渐成为了广大人群所接受并喜爱的甜品。凝乳酶是干酪生产中使牛乳凝固的关键性酶。随着人们生活水平的逐渐提高,干酪的生产和消费呈现一种日益上升的趋势,对凝乳酶的需求量逐渐增加。基于我国干酪生产中所用的凝乳酶主要依靠从国外进口的现状,针对为制取凝乳酶而大量屠杀小牛会造成生态破坏的矛盾,为了降低我国干酪生产的成本和提高产品品质,本文对姜汁凝乳的机理进行探讨,旨在开发出一种新型的凝乳酶,在乳制品工业中得到广泛应用。本文首先对姜汁凝乳的制作方法和姜汁中具有凝乳功能的物质成分进行了研究。以姜汁添加量、冲浆温度、酸度和杀菌条件为影响因素进行了正交试验,试验结果表明,姜汁凝乳的效果均受四个因素的影响,其中受温度的影响最大、其次是姜汁添加量和酸度。采用硫酸铵盐析法、有机溶剂提取法和水蒸汽蒸馏法分别从生姜中提取了生姜蛋白酶粗提物、姜油树脂以及姜精油,在不同条件下进行了凝乳试验,探讨生姜中的有效凝乳成分。试验结果表明,姜油树脂和姜精油不能使牛乳凝固,而生姜蛋白酶提取物能使牛乳凝固。生姜蛋白酶粗提物在10%～12%添加量下,70℃冲浆时,凝乳效果最好,其凝乳完全,质地均匀,坚实而无裂痕。对在不同条件下生姜蛋白酶和皱胃酶的凝乳块中钙元素含量,乳清中的钙元素含量和唾液酸的含量进行了测定,采用Urea-PAGE电泳进行分析。试验结果表明,生姜蛋白酶和皱胃酶凝乳块中钙含量和乳清中唾液酸含量随酶液添加量的增加而增大,其随温度、pH值改变的变化趋势也是一致的。从而说明生姜蛋白酶对酪蛋白作用和皱胃酶是相同的,生姜蛋白酶在一定条件下水解酪蛋白胶束外围的κ-酪蛋白,使之失去对酪蛋白胶束的保护作用,进而使生成的副κ-酪蛋白和暴露出来的α_(s1)-酪蛋白及β-酪蛋白与Ca~(2+)形成网状的凝胶体,使牛乳凝固。对生姜蛋白酶的性质进行了研究。试验结果表明生姜蛋白酶的活力均受温度和pH值的影响,其中最适温度和PH分别为60℃、6.50。在40℃以下和pH值为5.0～6.5内,酶活力保持稳定。Na~+、Ca~(2+)、Fe~(2+)和Al~(3+)对酶活力有促进作用,而Mg~(2+)、Ba~(2+)、Zn~(2+)和Cu~(2+)有抑制作用。同时与皱胃酶的性质进行比较,为之在实践生产中的应用提供理论指导。
赵秀玲[5]2004年在《不同凝乳酶在干酪生产中应用效果的研究》文中进行了进一步梳理本试验以西安常兴乳品厂当日生产鲜奶为原料，以进口的EZAL MA011作发酵剂(由乳油连球菌和乳酸链球菌组成)，以微生物酶，小牛皱胃酶，胃蛋白酶，羔羊皱胃酶，木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶为凝乳酶生产硬质干酪，研究不同凝乳酶对干酪产量，干酪硬度以及干酪成熟期间蛋白质降解的影响。 结果表明，干酪出品率羔羊皱胃酶，小牛皱胃酶和微生物凝乳酶(分别为10.86％、10.80％、10.60％)显着高于猪胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶(分别为10.36％、9.84％、9.76％)。 不同凝乳酶对干酪加工过程中乳清成分有明显影响。无花果蛋白酶制作的干酪随乳清排出的固形物最多，木瓜蛋白酶次之，羔羊皱胃酶最少。这与凝乳酶的活性及水解酪蛋白的特性有关。 不同凝乳酶生产的干酪其成熟期FAA的变化明显，干酪成熟90天时，羔羊皱胃酶FAA含量最多，小牛皱胃酶次之，木瓜蛋白酶最少。干酪在成熟的前期(如前15天内)，硬度变化极为显着，比鲜产品的硬度下降了许多；成熟到30天以后，硬度也有下降趋势，但速度减缓，逐步趋于稳定。 干酪成熟0，15，30，60，90天时，pH4.6WSN，12％TCA-N和5％PTA-N占TN的百分比例随成熟期延长显着增高。pH4.6WSN含量在干酪成熟60天和90天时，六种酶处理间的差异显着，微生物凝乳酶，小牛皱胃酶显着高于无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶，但与猪胃蛋白酶差异不显着。12％TCA-N含量在干酪成熟90天时，小牛皱胃酶，微生物凝乳酶显着高于无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶，与羔羊皱胃酶、猪胃蛋白酶组差异不显着。5％PTA-N含量在六种酶处理之间有差异。 综上所述，羔羊皱胃酶制作干酪，产品出品率高，组织结构细腻，口感舒适，风味浓郁，是六种酶中最适合制作干酪的凝乳酶；小牛皱胃酶、微生物凝乳酶居中；无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶凝乳效果差，产量低，口感粗糙，有苦味，在生产中几乎没有实用价值。
廖亮[6]2010年在《凝乳酶高产菌株的诱变选育及其发酵条件、产物酶学活性的相关研究》文中研究表明凝乳酶最初发现于未断奶小牛的第四胃,是乳酪制造业中的关键性酶,同时在其他食品、医药、轻工业等领域都有应用,其在酶工业中所占的产值比例高达15%。近年来由于全球性小牛短缺,人们逐渐将目光投向牛凝乳酶的代用品,其中,微生物凝乳酶以其优秀的凝乳性状和便捷的生产工艺受到了最广泛的关注。英、美、荷、日等国率先开始了微生物凝乳剂的相关研究,我国在80年代初亦开始进行相关研究,但目前还缺乏形成产业化的凝乳酶生产工艺,生产乳酪所需的凝乳酶主要依赖于进口,因此进行凝乳酶的相关研究具有较高的经济和社会意义。本文主要进行了微生物发酵产凝乳酶的相关研究,内容包括：凝乳酶高产菌株的诱变选育,发酵产凝乳酶培养基及培养条件的优化以及产物分离方法和酶学活性的初步研究。诱变实验以购自ATCC的米黑毛霉、购自CICC的黑曲霉为出发菌株,分别对其依次进行紫外线照射诱变、脱氧胆酸钠诱变和常压低温等离子体诱变。以产物凝乳活性和非特异性蛋白水解活性为考量标准,通过平板初筛和摇瓶发酵复筛,最后选育一株凝乳酶产量高,蛋白质水解活力小的黑曲霉突变株L-2-12。以该菌株作为发酵生产菌株,产物中凝乳酶产量是原始黑曲霉菌株的4.28倍；是原始米黑毛霉菌株的3.39倍。遗传稳定性试验结果表明,该诱变株基本保持产酶性状稳定。后续实验以该菌株作为研究对象,试验菌株使用干燥沙土管法低温保存。微生物发酵是一个复杂的生理生化过程,不同菌株处于不同营养环境和培养条件下,菌体的代谢均会不同从而影响产酶,因此要提高酶产量,对发酵产酶的条件进行优化是必不可少的一环。经过对发酵培养基营养组分和培养条件的单因素分析和发酵条件的Box-Behnken实验研究,本文最终确立的培养条件为：每250mL锥形瓶分装9g麸皮、1g面粉、0.1g脱脂乳粉,用15mL酸性无机离子营养液(按质量体积比配制0.7％MgSO4·7H2O、0.9％FeSO4·7H2O、0.1％脯氨酸溶液,加0.2NHCl调节pH至6.61)浸润,混匀并高温灭菌,待凉后接种,37℃培养98h。经过一系列优化,发酵产物浓缩冻干后的凝乳酶活性最高可达21000SU。另外,实验对从发酵产物中分离纯化凝乳酶粗酶的方法进行了初步探索。凝乳酶在水溶液中不稳定极易降解,因此初提取时,在充分发酵后即以水为溶剂,使用叁步固液反相接触萃取法从固体培养基中萃取出发酵产物,经过离心过滤后,迅速通过真空旋转蒸发的方式浓缩粗酶液,冻干成粗酶粉。通过此方法得到粗酶粉设备简单、便于操作且收率较高,适用于大规模工业化生产。对凝乳酶粗产品进行酶学性质的研究,结果表明该凝乳酶合适的反应温度区间为45-50℃,最适反应pH区间为5.8-6.2；室温(25℃)放置48h酶活基本不变,50℃以下放置凝乳酶超过1h基本无酶活损失。Ca2+的存在对酶的活性有明显的促进作用,凝乳反应中最佳Ca2+添加量为0.1%。
王明强[7]2008年在《微小毛霉产凝乳酶条件及酶性质的研究》文中指出凝乳酶在食品、医药、工业等行业应用广泛，是重要的工业用酶之一。在奶酪生产过程中，它起着凝结牛乳、改善风味的作用。根据来源的不同，可将凝乳酶分为叁类：动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。而利用微生物生产凝乳酶是目前最有前途的发展方向。因此，本论文借鉴现有相关研究成果，以微小毛霉(Mucor pusillus AS 3．3445)为研究对象，采用固态发酵技术，对菌株的产酶条件以及酶学性质进行了研究，以期为实际生产提供一定的理论依据。主要研究结果如下：1．对菌株AS 3．3445进行纯化与复壮后，接种麸皮培养基，观察其产酶规律，发现菌株在发酵4d后获得最大酶活。采用水浸提法，探讨加水量、浸提时间对酶活的影响。结果表明，发酵酶曲经80mL蒸馏水浸提15h后，可基本把凝乳酶浸提完全，而此时的酶活比先前提高了23％。2．对菌株的发酵培养基进行了优化。通过单因素实验，研究了不同碳源、氮源种类、酵母粉、Mg~(2+)、K_2HPO_4·3H_2O对菌株固态发酵产凝乳酶的影响。实验结果表明，以麸皮为基质，培养基中添加0．8％果糖、0．5％奶粉、0．4％K_2HPO_4·3H_2O、0．2％Mg~(2+)和0．2％酵母粉，提高的凝乳酶的活性。3．对菌株的培养条件进行了优化，确定了最佳接种量为10％，最佳固液比为1：1．2，最佳装瓶量为20g，最佳培养温度为28℃，最佳颗粒大小为20目到40目之间。4．在单因素的试验的基础上，利用响应面分析法优化了培养基中影响凝乳酶产量的主要因素，得到了果糖(X_1)、奶粉(X_2)、固液比(X_3)对凝乳酶产量(Y)的回归方程：Y=14573．80+533．50X_1+354．38X_2+2138．63X_3+516．75X_1X_2+908．75X_1X_3-72．00X_2X_3-1553．65X_1~2 -1484．40X_2~2-2239．40X_3~2根据响应值典型分析求得了果糖(X_1)、奶粉(X_2)、固液比(X_3)的最佳组合依次为：1．04％0．58%、1：1．02，与其对应的响应值(Y)为14733Su／g。5．研究了微小毛霉固态发酵产酶进程。在发酵过程中，发酵曲中凝乳酶和蛋白水解活性的变化有一定的相似性，都在发酵4d后获得了最大酶活，且此时凝乳酶活力与蛋白水解活性之比值最大，为21．75。培养基基质pH在发酵时间内中基本维持不变，而水分、还原糖含量到最后都呈现下降趋势。6．对Mucor pusillus AS3．3445凝乳酶的酶学性质研究结果表明：该酶耐酸性比耐碱性强，在pH5．4～7．8之间，随着pH值的降低，酶活增加，其最适温度为60℃；该酶在50℃以下，pH5～8范围内稳定。
姜峰, 张兰威[8]2003年在《我国凝乳酶特性及其替代品的研究现状》文中提出本文介绍凝乳酶的性质,酶凝乳的机理,及其凝乳酶在干酪生产中的作用,并对影响凝乳活性的各因素:pH值,温度,钙离子浓度等的作用机理的研究进展做了详细介绍。同时还介绍国内凝乳酶替代品的研究动态。
顾振磊[9]2010年在《红曲米中产凝乳酶菌株的筛选、鉴定及固态发酵条件的研究》文中研究说明干酪营养丰富,味道鲜美,贮存期长且种类繁多,是世界食品中的重要组成部分,素有“乳制品之王”之称。在干酪的加工处理过程中,凝乳酶应引起人们足够的关注。世界上生产奶酪主要用小牛皱胃酶,致使每年宰杀小牛5000多万头,但仍不能满足日益增加的市场需求,凝乳酶有着广阔的开发前景。本文从红曲米中分离筛选产凝乳酶的菌株,评估菌株的发酵和产凝乳酶的特性,筛选出了适用于生产凝乳酶的菌株。经PDA培养基培养,培养初期为白色小菌落,经过培养后,菌落开始老熟,表面的逐渐变化长出绒毛,菌落颜色开始改变,由白色逐渐为红色、紫色、深紫色、紫黑色,菌落凸起,中心下陷,菌落的主要形状绒毯状,长时间培养菌落出现放射状的沟纹,边沿平滑整齐。扫描电镜观察发现:细胞成椭球型,表面有凹陷。经实验发现:该菌株传代8次后凝乳性依然稳定,最适生长温度为30℃—35℃,凝乳酶为该菌株的次级代谢产物,发酵过程中pH值有较小幅度下降,然后稳定在pH6.5左右。同时,本文还得到了菌种固态发酵的最有条件:最佳碳源为糯米,最佳氮源为豆粕,最佳发酵初始pH6.5,最佳发酵温度为30℃,最佳发酵时间为12天。培养基最佳配比为碳氮比为5:2,葡萄糖添加量为3.5%,氯化钙添加量为1.5%,磷酸氢二钾添加量为2.0%,含水量为60%。在上述条件下,粗酶液中凝乳酶的酶活可以达到90.56SU/mL。取粗酶液,经离心,低温浓缩,葡聚糖G-75分子筛层析和纤维素阴离子交换层析,得到了纯度较高的凝乳酶。其中,葡聚糖分子筛层析分离中后两个峰为活性峰,纤维素凝胶的离子交换层析中NaCl浓度0.4mol/L的活峰中凝乳酶纯度较高,得到的产品为电泳纯。将红曲凝乳酶初步应用到奶酪的制作中,相同工艺条件下,红曲霉发酵液作为凝乳酶相对于小牛皱胃酶作为凝乳酶对乳酪品质的影响,大约相差8.4%。
邵淑娟[10]2011年在《产凝乳酶霉菌菌种的诱变选育及其酶学性质研究》文中进行了进一步梳理产凝乳酶霉菌菌种的诱变选育及其酶学性质研究内容隶属于国家高技术研究发展计划(863计划)(No. 2006AA10Z306);农业部现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目(编号:nycytx-0502)。黑曲霉及微小毛霉具备生产多种胞外水解酶的能力。从实验室收集与保藏的3株黑曲霉和3株微小毛霉菌株中以凝乳活力为指标分别筛选出一株黑曲霉菌株J1和微小毛霉菌株G3;以黑曲霉J1为出发菌株,经过多种方式诱变获得了黑曲霉W2、W5、UV1、U5、C1、P-W1和P-W3;将诱变所得菌株与微小毛霉G3进行比较后发现,后者具有更高的生产凝乳酶的能力,所以选择微小毛霉G3作为实验菌株进行固态发酵工艺研究;探讨微小毛霉凝乳酶粗酶液的提取及分离纯化技术,并对其酶学性质及其在干酪生产中的应用进行了研究。本文获得主要研究结论如下:1.在凝乳酶生产菌的菌种选育研究中发现:(1)对菌株的生长曲线和产酶曲线进行比较后发现:黑曲霉在筛选平板上具有明显的单菌落与凝乳圈,微小毛霉由于菌丝生长过快,故在较短的时间内具有明显的单菌落,但是无法观察到其凝乳圈,故黑曲霉比微小毛霉更易于在诱变育种进行筛选。(2)分别对黑曲霉和微小毛霉菌株的产酶曲线进行比较后发现:黑曲霉的叁个待选菌株J1、J2、J3中,黑曲霉J1具有较高的生产凝乳酶的能力;微小毛霉的叁个待选菌株G1、G2、G3中,微小毛霉G3具有较高的生产凝乳酶的能力,故选择黑曲霉J1和微小毛霉G3作为下一步实验的菌株。(3)在对黑曲霉J1和微小毛霉G3分别进行固态发酵后,对比粗酶液的凝乳活力,发现微小毛霉粗酶液的凝乳活力明显高于黑曲霉粗酶液的凝乳活力。2.在生产凝乳酶菌株的诱变育种实验研究中,以凝乳圈直径为初筛指标,粗酶液的凝乳活力为复筛指标,通过单个指标诱变与复合诱变等方式筛选凝乳酶高产菌株的实验中发现:(1)单个指标诱变以产凝乳酶活力较高的黑曲霉J1作为诱变的出发菌株,对其分别进行紫外诱变、微波诱变、超声波诱变、高压脉冲电场诱变、超高压诱变等,将一定条件下诱变所得的孢子悬浮液涂布在筛选平板上以凝乳圈直径为指标进行初筛,将初筛得到的诱变菌株接种到固态发酵培养基上进行复筛,最终筛选出凝乳活力高蛋白水解活力低且具有遗传稳定性的菌株W2、W5、UV1、U5、C1。(2)复合诱变在单个指标诱变的基础上,对黑曲霉J1的孢子悬浮液分别进行了微波-紫外、超声波-紫外、高压脉冲电场-微波、超高压-微波等复合诱变,其中超声波-紫外复合诱变没有筛选到正突变菌株,其它叁种复合诱变黑曲霉J1孢子悬浮液分别筛选出W-UV2、W-UV5、P-W1、P-W3、C-W1这五株发生正突变的菌株,将其接种到固态发酵培养基上进行复筛,最终筛选出P-W1、P-W3这两株凝乳活力高蛋白水解活力低且具有遗传稳定性目的菌株。(3)经过单个指标诱变和复合诱变,筛选出以下目的菌株W2、W5、UV1、U5、C1、P-W1、P-W3。为下一步固态发酵生产凝乳酶的实验提供的实验菌种。3.在凝乳酶高产菌株固态发酵工艺研究中:(1)将诱变所得的黑曲霉W2、W5、UV1、U5、C1、P-W1、P-W3和微小毛霉G3在相同的实验条件下进行固态发酵后,测定所得粗酶液的凝乳活力进行对比后发现微小毛霉G3的粗酶液的凝乳活力明显高于诱变菌粗酶液的凝乳活力,所以选择微小毛霉G3作为实验菌株进行下一步的固态发酵生产凝乳酶的工艺研究。(2)微小毛霉G3固态发酵工艺研究中,以粗酶液的凝乳活力为考察指标,采用单因素实验和正交试验设计对微小毛霉G3的发酵条件进行优化研究,结果表明发酵温度对微小毛霉G3在固态发酵过程中的产酶能力影响最大,其次为发酵时间,即影响微小毛霉G3固态发酵生产凝乳酶的发酵条件的主次顺序为发酵温度﹥发酵时间﹥固液比﹥接种量;且最优实验组合为A2B3C2D3,即微小毛霉固态发酵生产凝乳酶的最佳条件为发酵时间为5d,发酵温度为30℃,固液比为3:4,接种量为3份。(3)微小毛霉G3培养基成分等因素的优化:首先采用Plackett-Burman实验方法研究麸皮、米糠和豆饼粉等10个营养因子对微小毛霉G3固态发酵生产凝乳酶活力的影响,结果表明麸皮、(NH_4)_SO_4和KH_2PO_4对微小毛霉G3固态发酵生产凝乳酶影响较为显着,且其在一定程度上对微小毛霉G3固态发酵生产凝乳酶具有促进作用;其次利用最陡爬坡实验来确定Box-Behnken实验的中心点;在Plackett-Burman实验和最陡爬坡实验的基础上采用Box-Behnken设计及响应面分析确定影响微小毛霉G3生产凝乳酶的固态发酵培养基的最优配比。结果表明当麸皮质量为15.50g, (NH_4)_2SO_4质量为0.15g, KH_2PO_4质量为0.08 g时,微小毛霉产凝乳酶活力达到1200U/mL。较原始培养基活力提高了44.9%。4.在微小毛霉凝乳酶的提取及分离纯化研究中以酶液的凝乳活力为衡量指标,对粗酶液制备及其纯化过程进行优化:(1)对氯化钠浸提过程进行单因素分析,得到浸提最优参数为:氯化钠浓度为4%,浸提时间为2h,浸提温度为30℃,摇床转速为150rpm。(2)对硫酸铵盐析过程进行单因素分析,得到硫酸铵盐析纯化微小毛霉粗酶液的最优参数为:硫酸铵的浓度为70%,盐析时间为8h。(3)对乙醇沉淀粗酶液进行单因素分析,得到乙醇沉淀纯化微小毛霉粗酶液的最优参数为:乙醇的浓度为65%,醇沉时间为4h。(4)通过对比硫酸铵盐析和乙醇沉淀对粗酶液的纯化作用,得出乙醇比硫酸铵具有更好的纯化作用,且得到纯化酶液的凝乳活力更高。另一方面由于盐析得到的纯化酶液,硫酸铵的含量较高,还要经过透析、超滤等操作进行脱盐处理,实验更为繁杂;而经过乙醇沉淀得到的纯化酶液,基本不含无机盐,省去了脱盐等操作,所以对微小毛霉的纯化实验中选择乙醇沉淀作为初步的纯化操作。(5)经过乙醇沉淀和冷冻干燥后凝乳酶损失较少,回收率较高;经过凝胶过滤和阴离子交换色谱纯化后,微小毛霉凝乳酶的纯度有了较大幅度的提高,但是其回收率较低。5.在微小毛霉凝乳酶酶学性质及其应用研究中,以酶液的凝乳活力为指标考察各项因素对微小毛霉凝乳酶凝乳活力的影响;在模拟干酪制作工艺过程中将微小毛霉凝乳酶与商品酶进行对比,考察其对原料乳凝乳过程中粘度的变化及干酪质构的差异。(1)通过研究微小毛霉凝乳酶在不同温度下的凝乳活力,对比后发现微小毛霉凝乳酶的最适凝乳温度为65℃;通过研究微小毛霉凝乳酶在不同pH值条件下的凝乳活力,对比后发现微小毛霉凝乳酶在pH值为5.0时凝乳活力最大;将凝乳酶在不同温度和pH值条件下处理一定的时间,测定其凝乳活力,对比后发现微小毛霉凝乳酶在60℃以下耐热性较好,且其对酸性环境耐受性较好。(2)实验研究发现:乙醇对微小毛霉凝乳酶的凝乳活力有抑制作用,且随着乙醇浓度的增加对酶活力的抑制作用越大;EDTA在一定浓度范围内对微小毛霉凝乳酶的凝乳活力有促进的作用,当EDTA浓度过高时,脱脂乳出现絮凝现象;SDS低浓度时对微小毛霉凝乳酶的凝乳活力有促进作用,高浓度的SDS抑制其凝乳活力;巯基乙醇对微小毛霉凝乳酶的凝乳活力有着明显的促进作用,且其促进作用不随其的浓度变化而变化。Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(3+)、Mn~(2+)在一定浓度范围内均对微小毛霉凝乳酶有极大的促进作用,K~+、Na~+、Li~+在一定的浓度范围内对微小毛霉凝乳酶有微弱的促进作用,Co~(2+)、Ni~(2+)低浓度时对微小毛霉凝乳酶的凝乳活力有抑制作用;低浓度的Pb~(2+)对微小毛霉凝乳酶的凝乳活力有促进作用,低浓度的Cu~(2+)和Zn~(2+)对微小毛霉凝乳酶的凝乳活力有抑制作用,当脱脂乳中Cu~(2+)和Zn~(2+)浓度高于0.010 mol/L时,其对微小毛霉凝乳酶的凝乳活力有较小的促进作用。在相同的实验条件下,SO_4~(2-）对微小毛霉凝乳酶凝乳活力的影响较大,Cl-相对而言对微小毛霉凝乳酶的凝乳活力具有较小的影响。(3)通过研究发现:在pH值及浓度相同的情况下,PBS、醋酸、柠檬酸缓冲液对微小毛霉凝乳酶的凝乳活力有着明显的促进作用;微小毛霉凝乳酶活性随着在一定的范围内脱脂乳溶液浓度的增加而增加,当脱脂乳的浓度为12.5%时,微小毛霉的凝乳活性达到最大,之后随着脱脂乳浓度的增加微小毛霉的凝乳活力基本稳定。脱脂乳pH值对微小毛霉凝乳酶影响较大,随着脱脂乳液pH值的升高,微小毛霉凝乳酶凝乳活力迅速降低,当脱脂乳液pH值为7.8时,凝乳酶的几乎失活,仅有极小的凝乳活力。(4)通过模拟干酪制作工艺凝乳过程发现,凝乳酶的添加量影响原料乳凝乳过程的粘度,商品酶与微小毛霉凝乳酶产生的凝胶体系的变化不同,说明商品酶与微小毛霉凝乳酶具有不同的凝乳特性。采用TPA模型进行实验测定干酪的质构特性,微小毛霉凝乳酶作为凝乳剂所制干酪的硬度略高于商品酶作为凝乳剂所制干酪的硬度,两种干酪均具有较低的粘性且其粘聚性相当。由此可知微小毛霉凝乳酶和商品酶作为凝乳剂所制备干酪质构差异不大。
参考文献：
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[6]. 凝乳酶高产菌株的诱变选育及其发酵条件、产物酶学活性的相关研究[D]. 廖亮. 北京化工大学. 2010
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