甄允方王晓东张亚刘中书（苏州大学附属儿童医院骨科江苏苏州215003）
【摘要】目的研究应用兔脂肪间充质干细胞结合纳米组织工程骨治疗兔早期perthes病的效果。方法制备兔perthes病模型，应用兔脂肪间充质干细胞结合纳米组织工程骨进行早期治疗，观察股骨头修复情况。结果应用脂肪间充质结合纳米骨治疗组，股骨头修复效果明显。结论兔脂肪间充质干细胞结合纳米组织工程骨治疗兔早期perthes病，能促进兔股骨头坏死的修复。
【关键词】兔脂肪间充质干细胞纳米组织工程骨
【中图分类号】R68【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）34-0115-02
目前perthes病的治疗主要为保守治疗和手术治疗，但无论是哪种治疗方式，治疗的目的在于尽可能的防止股骨头变形，维持髋关节稳定性及正常的对位关系。随着对perthes病发生机理及疾病转归的认识，很多学者认为及早的对perthes病进行手术干预，以期尽快恢复血供，修复坏死，缩短病程。本实验研究的目的在于探索兔脂肪间充质干细胞复合纳米组织工程骨对兔早期perthes病的治疗作用。
1.材料和方法
1.1仪器与试剂
西门子MRI(MAGNETOMC10.35T)，菲利普500mAX线机，倒置显微镜（重庆光电总公司），CO2培养箱（美国SHELLAB），温控离心机（德国，HERAUS），RPMI1640（美国,Gibco）胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），谷氨酰胺（美国，Sigma），胰蛋白酶（美国，Sigma），Hepes(美国，Sigma)，BrdU(美国，Sigma)，血管内皮细胞Ⅷ因子鼠抗兔单克隆抗体（ADL公司）。
1.2支架材料
纳米相羟基磷灰石/胶原骨（NHAC）。将圆柱形材料制备成5×5×5mm大小。Co-60放射消毒备用。
1.3ADMSCs培养及细胞与支架复合（详见第三部分）
1.4兔perthes病模型制作
取2kg（三月龄）左右新西兰大白兔45只，随机分为三组：A组15只（单纯制模组），B组15只（制模后两周植入纳米骨组），C组15只（制模两周后植入细胞复合纳米骨组），将兔用戊巴比妥钠30mg/kg耳缘静脉注射麻醉后，左髋部剃毛并清洁皮肤，碘酒酒精消毒皮肤，铺洞巾，严格按照无菌原则进行手术。取髋关节后外侧切口，长约6cm，切开皮肤后沿股骨大粗隆肌间隙进入，到达关节囊后切开，切断圆韧带将股骨头脱位，切断支持带血供，并向下剥除支持带直达粗隆间线水平，将髋关节复位，逐层缝合，术后肌注青霉素80万u×3天，备用。
1.5手术修复兔perthes病
制模两周后，A组不做任何处理。B、C组将兔麻醉后，循原手术切口暴露出股骨头。在X线透视下在股骨头外下方做一3mm×3mm窗口，用自制刮匙沿开窗处进入，将股骨头内坏死骨刮除，尽量避免损伤骺板。刮除坏死骨后B组植入纳米骨，C组植入兔脂肪间充质干细胞及新型纳米材料的复合物。
2.观察及相关检测指标
三组在治疗后2、4、6周（即分别相当于制模后4、6、8周）进行观察检测。
2.1大体观察
观察术后动物生活情况，局部的伤口愈合情况，处死动物后与自身正常股骨头相比较肉眼观察股骨头情况。
2.2实验组X线检查情况
三组在制模后4、6、8周各处死5只动物行X线检查观察股骨头情况。
2.3实验组MRI检查
三组在制模后4、6、8周各处死5只动物行MRI检查观察股骨头情况。
2.4组织形态学检查
三组在制模后4、6、8周各处死5只动物，取标本后10%中性福尔马林溶液固定，脱钙一周，石蜡包埋切片，HE染色，封片后镜下观察。
2.5标本组织FⅧ-Ag免疫组化染色。
3.统计学方法
所得数据用SPASS10.0统计软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（x-±SD）表示，实验组与对照组之间比较采用t检验，p值＜0.05为有统计学意义。
4.结果
4.1大体观察
三组术后活动情况良好。45只兔子在麻醉过程中死亡两只（补做两只）其余都达到指定观察时间。
A组：四周后股骨头表面失去光泽，软骨部分失去半透明性状，稍显苍白。六周后苍白明显，尤以圆韧带附近明显，有一例标本呈现灰黄色。术后八周股骨头表面不光滑，软骨组织出现片状隆起及缺损，股骨头较正常稍小（图1）。
B组：术后四周股骨头表面软骨光泽稍差，六周时表现出软骨下苍白，股骨头圆形，八周时股骨头表面不光滑，软骨下苍白部略显红色，软骨组织出现轻度缺损（图2）。
C组：四周股骨头表面软骨光泽稍差，可见软骨下苍白变化。六周股骨头仍见苍白变化，但部分恢复红色，表面软骨无塌陷情况，八周时股骨头表面较正常略不光滑，股骨头软骨下骨恢复红色，未发现股骨头变小情况（图3）。
4.2X线检查情况
A组：四周后股骨头密度增高不明显，骨骺高度未见到明显异常，六周后股骨头密度稍有增高，骨骺高度较正常降低，八周股骨头密度增高，骨骺高度较正常降低，骺线不清晰（图4）。
B组：四周时植入物与周围组织界限可见，植入物呈现高密度影，骨骺高度无明显变化，六周时植入物与周围组织界限仍可见。八周时植入物与周围组织界限模糊，密度均匀，中心部位密度稍低，两例出现骺线不清，骨骺高度降低（图5）。
C组：所有股骨头外形表现正常。四周时植入物处高密度表现，六周时骨缺损区与周围组织分界不清，骨骺高度未见明显变化，八周时植入物与周围密度均匀，与正常组织无明显区别，骨骺高度正常（图6）。
4.3磁共振检查情况
A组：术后四周六周时在T1WI和T2WI像出现片状低信号，术后八周时股骨头低信号区域增加，有线样征，未见到明显的骨碎裂情况出现（图7）。
B组：术后四周，在T1WI和T2WI像较正常股骨头仍为低信号，八周时信号不均一，未见到骨碎裂情况（图8）。
C组：术后四周时T1WI和T2WI像较正常股骨头仍为低信号，六周时表现信号不均一，八周时较正常信号相当，未见到骨碎裂（图9）。
4.4组织形态学观察
A组：术后四周时骨小梁已经出现轻度断裂，骨陷窝空虚，可见到骨髓组织部分碎裂消失，未分化间充质细胞和毛细血管出现。六周时增生的未分化间充质细胞及毛细血管较四周时多见，有成骨细胞出现，骨小梁形成。八周时可见适量仍可见成骨细胞，血管减少，见多量散乱的骨小梁（图10）。
B组：术后四周时材料与周围骨质界限清晰，少量纤维结缔组织将材料分隔，见少量毛细血管，未见明显细胞出现。六周时材料仍清晰可见，材料被分隔，可见较多毛细血管，成骨细胞，出现散乱类骨质。八周时材料仍可见，血管减少，大片状骨小梁出现，部分处有髓腔形成趋势（图11）。
C组：术后四周材料分隔，期间充满大量毛细血管，间充质细胞分化成骨细胞。术后六周材料未被完全吸收，毛细血管量增多，成骨细胞增多，可见到大量散在骨小梁结构。术后八周材料吸收完全，修复活性较前查，修复情况良好，骨髓组织修复建立（图12）。
4.5FⅧ-Ag阳性细胞分布
建模后六周在A、B、C组可以见到不同程度的FⅧ-Ag阳性细胞。A组FⅧ-Ag阳性细胞数15.20±2.78/HP,B组FⅧ-Ag阳性细胞数24.00±2.87/HP，C组FⅧ-Ag阳性细胞数29.70±5.60/HP。C组较A、B组阳性细胞明显增多，有统计学意义（P﹤0.05）。B组较A组阳性细胞数增多，有统计学意义（P﹤0.05）。如下表
FⅧ-Ag阳性细胞数
A组15.20±2.78
B组24.00±2.87
C组29.70±5.60
4.6BrdU标记的ADMSCs在体内修复时的分布情况
C组，术后4-6周可见到少量的BrdU阳性细胞分布，术后八周，可见到较多的BrdU阳性细胞分布。
5.讨论
Perthes病因众说纷纭，随着研究的发展，发现其可能与创伤、一过性滑膜炎、生长发育异常、内分泌失调、自身免疫缺陷、遗传、环境等多种因素有关[1-2]为了更好的研究peerthes病，国内外很多学者采用各种法在动物身上建立perthes病的模型。Alpaslan等[3]通过阻塞犬股骨头血供成功制备perthes病模型。本实验中采用手术切断圆韧带和支持带的新术式来中断股骨头血供的方法[4]行模型建立。通过对股骨头分别在建模后的四、六、八周影像及病理相关检查得知：（1）X线股骨头密度增高，骨骺高度降低，骺线模糊，与人类perthes病的部分X线表现相似；（2）模型建立后股骨头在T1WI和T2WI像出现股骨头低信号变化，此表现类似于人类perthes病的线样征，随着时间推移，低信号与高信号并存，说明坏死与修复并存；（3）病理中可以看到骨髓组织及骨小梁坏死修复的变化。因此我们成功的建立了兔perthes病的试验模型，坏死率高，经济实用。
以支架材料复合种子细胞构建组织工程骨在修复程度，修复速度，新生骨形态等方面具有优越性[5]。纳米相羟基磷灰石/胶原骨作为种子支架材料，由其XRD谱可知，复合材料的无机项为羟基磷灰石，与天然骨类似[6]。为细胞提供了天然骨类似的微环境，有助于骨系细胞的黏附，增殖及功能发挥。在本实验中我们通过纳米相羟基磷灰石/胶原骨复合脂肪间充质干细胞来治疗兔早期perthes病，可以看到复合在材料上的细胞生长良好，代谢活跃。
组织工程化成骨过程中，细胞被接种到支架材料上后，植入材料修复主要是靠骨传导和骨诱导来实现，组织工程骨在材料周围和内部均有新骨形成[7-8]。
兔perthes病模型中股骨头坏死部分骨质刮除后植入细胞支架复合体，在体内正常营养环境和生物力学条件下，引导和诱导自身骨再生，支架材料降解，成骨细胞分泌的基质逐渐替代支架材料形成新骨[9]，以验证植入物对股骨头的修复能力。
Hsiong等[10]认为血运是骨组织发育和修复过程中的重要因素。组织工程骨的血管化程度与新骨形成的数量成正相关。血管化为新生骨的形成提供了丰富的营养物质，并将成骨所需要的前体细胞，生长因子等携带至局部微循环，带走新陈代谢的产物，血管化后血流量的增加为成骨处的矿物质沉积提供了条件，因此，在骨愈合过程中矿物质的沉积主要控制因素是血流量，而不是骨膜的生理代谢变化[11]。
最近报道，兔脂肪间充质干细胞复合支架材料修复兔尿道缺损[12]细胞复合支架组与单纯支架组相比，在缺损区可以加快血管生长、上皮生长、平滑肌的生长等。显示了ADMSCs作为种子细胞在体内缺损区进行修复的重要作用。本实验结果显示：细胞型纳米组织工程骨植入动物体内后比单纯植入纳米骨组对骨缺损有明显的修复能力，移植物与宿主骨整合良好，局部组织血管化程度，骨化程度都较单纯植入纳米骨组良好，使股骨头保持了较好的外形，可以维持髋关节良好的对位关系。在兔早期perthes病治疗过程中，缩短了病程，修复了坏死。实验为临床上及早地对perthes病进行手术干预，避免以后较大手术提供了实验依据。
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