猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA、ApxⅣA基因双重PCR方法的建立及多克隆抗体的制备

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的以急性肺脏出血或慢性纤维素性胸膜粘连等为特征的一种呼吸道传染性疾病。Apx外毒素是APP最重要的致病因子,且有ApxI、ApxII、ApxⅢ和ApxⅣ4种毒素因子,其中ApxⅠ可引起疾病出现肺部典型病变,也是引起猪传染性胸膜肺炎的最强毒力因子,而ApxⅣ毒力相对较弱,但可由所有的APP分泌,且只有APP在动物体内时ApxⅣ才会被诱导表达,因此当ApxI、ApxⅣ两种毒素因子同时存在时,则会对猪传染性胸膜肺炎的诊断具有十分重要的临床价值。通过提取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和ApxIVA基因组DNA,建立双重PCR方法检测并扩增ApxIA和ApxIVA基因片段,并采用TA克隆技术获得重组质粒,然后进行生物信息学分析目的基因片段特性并进筛选,再进一步的蛋白表达、纯化及多克隆抗体制备。试验结果如下:1、成功建立了毒素ApxIA和ApxⅣA基因双重PCR体系,ApxIA和ApxⅣA在DNA模板浓度为240μmol/L和150μmol/L、引物浓度为2ng/mL、Tm值55℃条件下可同时获得两条较亮目的条带,且特异性和稳定性检测效果极佳。2、成功获得了pMD18–ApxIA、pMD18–ApxIVA重组质粒,通过基因生物信息学分析筛选出了基因片段长度为1 209 bp的ApxIA和目的基因片段长度为972bp的ApxⅣA的两段蛋白表达强基因片段。与NCBI上的基因序列进行同源性比较发现相似度均有90%以上。3、获得高效价的ApxIA和ApxⅣA多克隆抗体,经ELISA检测的效价分别可高达1:200000和1:50000;在此效价经Western Blot检测为阳性。结论:成功建了ApxI A和ApxⅣA基因双重PCR方法,其特异性、稳定性较强;获得了ApxI A和ApxⅣA基因的多克隆抗体,效价分别可高达1:200000和1:50000,为今后猪传染性胸膜肺炎的诊断防控提供了参考。

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Abstract

缩略词表

第一章文章综述

1 概述

1.1 猪传染性胸膜肺炎的危害及流行病学特点

1.2 猪传染性胸膜肺炎的诊断

1.3 猪传染性胸膜肺炎的防治

1.4 胸膜肺炎放线杆菌的特征

2 生物学特性

2.1 外毒素

2.2 ApxⅠ相关特性

2.3 ApxⅣ相关特性

2.4 荚膜多糖

2.5 脂多糖

2.6 外膜蛋白

2.7 转铁结合蛋白

3 研究目的意义

第二章试验研究

试验一猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和 ApxⅣA基因双重PCR检测方法的建立

1 材料

1.1 供试菌株

1.2 培养基、酶、试剂盒及其它试剂

2 方法

2.1 引物设计

2.2 细菌的培养及DNA的提取

2.3 单重PCR体系的建立

2.4 双重PCR特异性和灵敏性检测

3 试验结果

3.1 单重PCR实验结果

3.2 双重PCR实验结果

3.3 特异性和稳定性检测结果

4 讨论

试验二猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIA基因克隆与生物信息学分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 ApxIA基因DNA的提取

1.2.2 ApxI A 基因的 PCR 扩增

1.2.3 PCR产物经胶回收纯化

1.2.4 ApxIA基因片段与pMD18–T的连接

1.2.5 连接产物转化感受态细胞

1.2.6 p MD18–ApxIA的鉴定

1.2.7 测序分析

1.2.8 ApxIA基因的生物信息学分析

2 结果与分析

2.1 ApxIA基因的扩增和T-A克隆与鉴定

2.2 ApxIA基因的生物信息学分析

2.2.1 ApxIA基因测序

2.2.2 ApxIA蛋白的理化性质分析

2.2.3 ApxIA蛋白磷酸化、糖基化位点的分析

2.2.4 ApxIA蛋白抗原肽与信号肽预测

2.2.5 ApxIA蛋白的亲/疏水性预测及跨膜结构域分析

2.2.6 ApxIA蛋白的二三级结构预测

3 讨论

试验三猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因克隆与生物信息学分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病菌来源

1.1.2 酶及其试剂

2 试验方法

2.1 引物设计与合成

2.2 细菌培养

2.3 p MD18-T-ApxⅣA重组质粒构建

2.3.1 ApxⅣA DNA提取

2.3.2 ApxⅣA基因序列的PCR扩增

2.3.3 PCR反应条件及电泳检测

2.3.4 胶回收以及重组质粒

2.3.5 ApxⅣA基因的生物信息学分析

3 结果与分析

3.1 ApxⅣA基因片段PCR扩增、克隆与鉴定

3.2 基因测序

3.3 ApxⅣA片段基因信号肽测定

3.4 ApxⅣA基因稀有密码子的分析

3.5 ApxⅣA基因疏水性与亲水性的分析

3.6 Coil区分析

3.7 二级结构预测

4 讨论

试验四猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和 ApxⅣA多克隆抗体制备

1 试验材料

2 方法

2.1 ApxIA和 ApxⅣA特征性抗原肽段的合成

2.2 合成多肽的溶解和分装

2.3 抗原与佐剂的乳化

2.4 免疫兔子制备

2.5 免疫前后采血

2.6 ELISA检测抗体

2.7 Western b Iot检测抗体

3 结果

4 讨论

第三章全文结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文

附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 程素芳

导师: 曹华斌,张彩英,叶俊华

关键词: 猪传染性胸膜肺炎,双重,多克隆抗体

来源: 江西农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 江西农业大学

基金: 国家自然科学基金(31460679),江西省科技支撑计划项目(20141BBF60035)

分类号: S852.61

DOI: 10.27177/d.cnki.gjxnu.2019.000319

总页数: 67

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