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橡胶草小橡胶粒子蛋白基因及其启动子的克隆与功能分析

2020-12-02阅读(323)

橡胶草小橡胶粒子蛋白基因及其启动子的克隆与功能分析

论文摘要

目的:天然橡胶在国民经济以及科技领域中占有重要地位,橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）根中所产橡胶质量与巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）的橡胶相当,由于其生育周期较短、易于进行遗传转化等优点,是研究天然橡胶产胶机理的理想模式植物。小橡胶粒子蛋白（Small Rubber Particle Protein,SRPP）是橡胶颗粒膜蛋白中重要的组成成分,在橡胶凝固和橡胶产量中均起到一定作用,因此研究橡胶草SRPP基因功能,鉴定控制SRPP基因表达的调控元件,为研究天然橡胶生物合成的分子作用机制奠定理论基础。方法:本研究以橡胶草为实验材料,利用荧光定量法分析TkREF/SRPPs基因家族的表达模式;以TkSRPP3基因为研究对象,分析其时空表达以及原核表达模式;利用转基因技术获得转TkSRPP3基因的橡胶草植株;在橡胶草基因组数据的基础上,克隆PTkSRPP3启动子,利用基因工程技术构建P0/P1/P2/P3/P4::GUS植物表达载体,通过组织化学染色法分析缺失启动子活性;激素及伤害处理P0/P1/P2/P3/P4::GUS转基因烟草,利用GUS酶活测定法检测GUS报告基因表达量的变化,分析启动子缺失元件对外界环境变化的影响。结果:（1）TkREF/SRPPs基因家族经茉莉酸甲酯（MeJA）处理后,TkREF/SRPPs家族中TkSRPP1和TkSRPP3的表达量显著上调;经脱落酸（ABA）处理后,TkREF/SRPPs家族中TkSRPP3的表达量显著上调;（2）克隆得到TkSRPP3基因,开放阅读框为690bp,编码229个氨基酸,TkSRPP3蛋白分子质量24.431kDa,属于酸性蛋白,具有REF保守结构域,是REF/SRPPs家族成员之一;系统进化树分析表明TkSRPP3与短角蒲公英TbSRPP3同源性较高;时空表达分析结果表明,TkSRPP3基因在六月龄的橡胶草根部组织中表达量最高;原核表达分析TkSRPP蛋白大小为24.3kDa,在浓度为1mM IPTG诱导表达6h为最佳诱导条件,可获得大量蛋白;构建pCAMBIA2300-TkSRPP3植物表达载体,成功获得5株转TkSRPP3基因橡胶草;（3）克隆得到PTkSRPP3启动子,序列长度为2188bp;序列分析表明启动子具有基础的启动子特征元件以外,还包含关于组织特异表达元件和响应光、激素、伤害、热等顺式作用元件;构建启动子融合GUS报告基因的植物表达载体,组织化学染色证明启动子具有启动活性,不具有组织特异性;构建P0（-2188bp）/P1（-1592bp）/P2（-1274bp）/P3（-934bp）/P4（-450bp）启动子缺失片段融合GUS报告基因的植物表达载体,GUS染色分析显示启动子缺失片段均有活性,缺失启动子活性随着片段的截短而活性减弱;（4）利用ABA、SA（水杨酸）、MeJA和伤害处理稳定表达GUS基因的烟草植株,GUS酶活表达量显示:含有ABA响应元件的P0（-2188bp）/P1（-1592bp）/P2（-1274bp）受ABA处理正调控;含有JA响应元件的P2（-1274bp）受MeJA处理正调控;含有SA响应元件的P1（-1592bp）/P2（-1274bp）受SA处理正调控;含有伤害响应元件的P3（-934bp）受伤害处理正调控。结论:（1）TkREF/SRPPs基因家族响应MeJA和ABA的表达模式各不相同,其中TkSRPP3基因同时受到两类激素的强烈诱导表达;（2）TkSRPP3基因的生物信息学分析表明TkSRPP3属于REF/SRPPs家族,且无跨膜结构域;TkSRPP3基因的时空表达分析显示六月龄橡胶草根部组织中TkSRPP3的表达量最高;（3）PTkSRPP3启动子具有启动活性,不具有组织表达特异性;PTkSRPP3缺失启动子中含有ABA响应元件的P0（-2188bp）/P1（-1592bp）/P2（-1274bp）受ABA处理正调控;含有JA响应元件的P2（-1274bp）受MeJA处理正调控;含有SA响应元件的P1（-1592bp）/P2（-1274bp）受SA处理正调控;含有伤害响应元件的P3（-934bp）受伤害处理正调控。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 中英符号缩略词表
  • 引言
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 天然橡胶
  •   1.2 橡胶草
  •   1.3 天然橡胶的生物合成
  •     1.3.1 橡胶生物合成途径
  •     1.3.2 橡胶生物合成相关基因
  •     1.3.3 REF/SRPPs家族
  •   1.4 启动子
  •   1.5 启动子的类型
  •     1.5.1 组成型启动子
  •     1.5.2 组织特异型启动子
  •     1.5.3 诱导型启动子
  •   1.6 本文研究的目的与意义
  • 第二章 小橡胶粒子蛋白基因的克隆及生物信息学分析
  •   2.1 材料
  •     2.1.1 实验材料
  •     2.1.2 菌种、载体与试剂
  •     2.1.3 主要的仪器设备
  •   2.2 方法
  •     2.2.1 材料处理及RNA的提取
  •     2.2.2 REF/SRPPs家族定量分析
  •     2.2.3 Tk SRPP3 基因克隆
  •     2.2.4 大肠杆菌感受态的制备及转化
  •     2.2.5 Tk SRPP3 基因的生物信息学分析
  •     2.2.6 Tk SRPP3 基因的实时荧光定量分析
  •     2.2.7 Tk SRPP3 蛋白原核表达载体构建
  •     2.2.8 TkSRPP3 蛋白的原核表达分析
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 REF/SRPPs家族定量分析
  •     2.3.2 Tk SRPP3 基因克隆
  •     2.3.3 Tk SRPP3 基因生物信息学分析
  •     2.3.4 Tk SRPP3 基因的时空表达特征分析
  •     2.3.5 TkSRPP3 蛋白的原核表达分析
  •   2.4 讨论
  • 第三章 小橡胶粒子蛋白基因在橡胶草中的遗传转化
  •   3.1 材料
  •     3.1.1 实验材料
  •     3.1.2 实验仪器
  •   3.2 方法
  •     3.2.1 Tk SRPP3 植物表达载体的构建
  •     3.2.2 Tk SRPP3 电转根癌农杆菌
  •     3.2.3 Tk SRPP3 遗传转化橡胶草
  •     3.2.4 Tk SRPP3 转基因型植株鉴定
  •     3.2.5 Tk SRPP3 转基因型植株形态学观察
  •   3.3 结果
  •     3.3.1 Tk SRPP3 的植物表达载体的构建
  •     3.3.2 Tk SRPP3 基因遗传转化
  •     3.3.3 Tk SRPP3 转基因型橡胶草根形态变化
  •   3.4 讨论
  • 第四章 PTkSRPP3 启动子的克隆与功能分析
  •   4.1 材料
  •   4.2 方法
  •     4.2.1 橡胶草根部DNA的提取
  •     4.2.2 PTkSRPP3 启动子克隆
  •     4.2.3 PTkSRPP3 启动子生物信息学分析
  •     4.2.4 PTkSRPP3 启动子融合GUS基因载体的构建
  •     4.2.5 PTkSRPP3 启动子瞬时表达验证启动子活性
  •     4.2.6 PTkSRPP3 缺失启动子融合GUS基因载体的构建
  •     4.2.7 PTkSRPP3 缺失启动子瞬时表达
  •     4.2.8 PTkSRPP3 缺失启动子的稳定遗传转化
  •     4.2.9 PTkSRPP3 缺失启动子验证活性
  •     4.2.10 植物激素处理烟草及缺失启动子活性分析
  •   4.3 结果
  •     4.3.1 PTkSRPP3 启动子克隆及其生物信息学分析
  •     4.3.2 PTkSRPP3 启动子融合GUS基因载体的构建
  •     4.3.3 PTkSRPP3 启动子活性验证
  •     4.3.4 PTkSRPP3 缺失启动子融合GUS基因载体的构建
  •     4.3.5 PTkSRPP3 缺失启动子活性分析
  •     4.3.6 PTkSRPP3 启动子稳定遗传转化
  •     4.3.7 PTkSRPP3 启动子组织化学染色
  •     4.3.8 PTkSRPP3 缺失启动子响应激素处理活性分析
  •   4.4 讨论
  • 第五章 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介
  • 附件

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张慧艳

    导师: 闫洁

    关键词: 橡胶草,小橡胶粒子蛋白,启动子,基因表达

    来源: 石河子大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 石河子大学

    分类号: Q943.2

    总页数: 70

    文件大小: 3540K

    下载量: 167

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