姜俊义[1]2004年在《对虾甲壳形成机理初步研究》文中研究指明本文以中国明对虾和凡纳滨对虾的甲壳为研究对象，应用X-射线衍射技术和傅立叶变换红外光谱技术、氨基酸组成分析以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对两种对虾甲壳无机相(碳酸钙晶体)的晶体组成特点和有机相(几丁质和蛋白质)的组分以及晶体的沉积规律进行了分析，旨在为对虾甲壳形成机理研究提供理论基础。研究结果总结如下： 用傅立叶变换红外光谱技术(FTIR)分析对虾甲壳结果显示，对虾甲壳中含有大量几丁质和其它多糖，几丁质为α—几丁质，特征光谱为3285cm~(-1)、2962cm~(-1)、2932cm~(-1)、2885cm~(-1)。碳酸钙晶体主要以方解石形式存在，特征光谱为1420cm~(-1) 、875cm~(-1)。对从对虾甲壳中提取出来的可溶性蛋白及不可溶性蛋白进行FTIR分析的结果表明，酰胺Ⅰ带分别位于1649-1652cm~(-1)、1656-1658cm~(-1)吸收区，酰胺Ⅱ带分别位于1519-1526cm~(-1)、1537-1540cm~(-1)吸收区。可以推测酰胺Ⅰ带都采取α-螺旋构象，酰胺Ⅱ带在可溶性蛋白中采取反式平行β-片层，在不溶性蛋白中采取平行β-片层。不溶性蛋白与可溶性蛋白相比，无酰胺Ⅲ带，但增加了酰胺Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ带。另外，不溶性蛋白的993-995cm~(-1)吸收区检测到一峰，可能为PO_4~(3-)。X-射线衍射分析图谱显示在d值为9.6677和4.4803埃处检测到几丁质的特征峰，表明有大量的α—几丁质存在；在d值为3.0436、2.4967埃等位置检测到方解石的特征峰；在凡纳滨对虾中，d值为3.4582、3.3803处检测到的微弱峰可能为霰石或球霰石，与中国明对虾相比，其(104)面生长的方解石峰显着较弱。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果表明，可溶性蛋白大多为小分子量蛋白质，分子量介于6-30kDa，不可溶性蛋白集中于中分子量范围，分子量介于20-60kDa，最小分子量大于11kDa；中国明对虾的不同生长阶段以及中国明对虾与凡纳滨对虾之间，可溶性与不可溶性蛋白都存在一定的差异，但总体上相似度较高。就提取方法而言，对于可溶性蛋白，HCl适合提取高及中分子量蛋白质，HAc和Tris适合提取低分子量蛋白质，但HAc效果比Tris更好；对于不可溶性蛋白，EDTA-Urea难以提取到高分子量蛋白质，SDS-DTT和巯基乙醇-饱和盐酸胍效果较好。几乎每种可溶性蛋白质提取物都可分离到位于20-21kDa、16-18kDa对虾甲壳形成机理初步研究和14一15kDa附近的叁条带，而几乎每种不可溶性蛋白质提取物都可分离到位于60一65kDa、44一48 kDa、33一36 kDa、29一32 kDa和17一ZOkDa(二条带)附近的六条带。 氨基酸组成分析数据显示，从对虾甲壳提取的可溶性及不可溶性蛋白均检测不到半肤氨酸，甲硫氨酸含量小于1%，即缺乏含硫氨基酸。可溶性蛋白富含小侧链氨基酸(Ala and Gly:24一26%)和酸性氨基酸(Asn and Glu: 24一27%)，经基氨基酸含量相对较高(Ser and Thr:11一13%);而不可溶性蛋白质富含小侧链氨基酸(Ala and Gly:25一27%)，酸性氨基酸(Asn and Glu:17一19%)和经基氨基酸含量相对较高(Ser and Thr:15一17%)。不可溶性蛋白的疏水氨基酸含量明显高于可溶性蛋白。
郭彪[2]2010年在《光照和温度波动对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）蜕皮和生长的影响及机制的初步研究》文中研究指明本研究以凡纳滨对虾为实验材料,通过一系列实验室养殖实验,初步研究了光照波动对凡纳滨对虾蜕皮、生长的影响,并对光照和温度波动对凡纳滨对虾生长影响的机制进行了初步探讨。主要结果如下：一、光照波动对凡纳滨对虾蜕皮和生长的影响及机制1、光照强度日节律波动对凡纳滨对虾蜕皮和生长的影响及机制本文在实验室条件下,研究了光照强度日节律波动对凡纳滨对虾蜕皮和生长的影响。实验设2700±600lx、2700±1200 lx、2700±1800 lx和2700±2400 lx四个不同的光照强度日节律性波动组,以2700 lx恒定光照强度为对照组,测定了不同处理组对虾的蜕皮、生长、能量收支及体组成。实验对虾的初始湿体重为(2.736±0.002)g,养殖周期为45天。主要实验结果如下：(1)光照强度日节律性波动组2700±600 lx、2700±1200 lx和2700±1800 lx对虾的相对增重率和特定生长率均显着高于恒定光照组(P<0.05)；而光照强度日节律性波动组2700±2400lx对虾虽然相对增重率显着高于恒定光照组(P<0.05),但其特定生长率与恒定光照组没有显着性差异(P>0.05)。(2)光照强度日节律性波动组2700±600 lx、2700±1200lx和2700±1800 lx对虾的摄食率显着高于恒定光照组(P<0.05),但2700±2400lx组对虾的摄食率与恒定光照组没有显着性差异(P>0.05)；在食物转化效率方面,除了2700±600 lx组对虾的食物转化效率显着低于恒定光照组外(P<0.05),其他各光照变化组对虾的食物转化效率与恒定光照组均无显着性差异(P>0.05)。(3)光照强度日节律性变化组2700±1200 lx和2700±1800 lx对虾用于生长的能量比例均显着高于恒定光照组(P<0.05),而其用于呼吸的能量比例显着低于恒定光照组(P<0.05)。(4)对虾的蜕皮率及用于蜕皮的能量比例在恒定光照组和四个光照强度日节律性波动组间均没有显着性差异(P>0.05)。(5)光照强度日节律性波动对凡纳滨对虾的体组成有显着的影响；与恒定光照相比,光照强度的波动显着降低了对虾体内粗脂肪的含量。2、光照强度周期变化对凡纳滨对虾蜕皮和生长的影响及机制在实验室条件下研究了光照强度周期性变化对凡纳滨对虾蜕皮和生长的影响。实验设计了60lx恒定光照组和600-60 lx、1500-60lx、3000-60 lx、6000-60 lx四个不同的光照强度周期性变化组。实验虾的初始湿体重为(2.733±0.017)g,养殖周期为48天。主要实验结果如下：(1)光照强度变化组1500-60 lx和3000-60 lx对虾的相对增重率和特定生长率均显着高于恒定光照组(P<0.05)；光照强度变化组600-60 lx对虾的相对增重率显着高于恒定光照组(P<0.05),但其特定生长率与恒定光照组没有显着性差异(P>0.05)；光照强度变化组6000-60 lx对虾的相对增重率与恒定光照组没有显着性差异(P>0.05),但其特定生长率却显着高于恒定光照组(P<0.05)。(2)各个处理组之间对虾的摄食率没有显着性差异(P>0.05),但光照强度变化1500-60 lx、3000-60 lx和6000-60 lx组对虾的食物转化效率显着高于恒定光照组(P<0.05)。(3)光照强度变化组1500-60 lx、3000-60 lx和6000-60 lx对虾的呼吸能和排泄能分配比例均显着低于恒定光照组(P<0.05),而用于生长的能量分配比例均显着高于恒定光照组(P<0.05)。(4)对虾蜕皮率和用于蜕皮的能量比例以光照强度变化组6000-60 lx最低,显着低于其他各处理组(P<0.05),但光照强度变化组1500-60 lx和3000-60 lx与恒定光照组间没有显着性差异(P>0.05)。(5)实验结束后对虾的灰分含量基本上与对虾的末干体重成正比,光照强度周期性变化提高了对虾粗脂肪的含量。3、光色日节律性波动对凡纳滨对虾蜕皮和生长的影响及机制本文在实验室条件下,研究了光色的日节律性变化对凡纳滨对虾蜕皮和生长的影响。实验设计了黄光(Y)、绿光(G)、蓝光(B)叁个恒定光照组,蓝光变黄光(BY)、蓝光变绿光(BG)、绿光变黄光(GY)叁个光色变化组。实验虾的初始湿体重为(1.212±0.010)g,养殖周期为45天。主要实验结果如下：(1)BG组和BY组对虾无论相对增重率还是特定生长率均显着高于蓝光组(P<0.05),GY组对虾的相对增重率显着高于蓝光组(P<0.05),但其特定生长率与蓝光组未出现显着性差异(P>0.05)。(2)对虾的摄食率在五个处理组之间未出现显着性差异(P>0.05),GY组对虾的食物转化效率与蓝光组也未出现显着性差异(P>0.05),但BG组和BY组对虾的食物转化效率却显着高于蓝光组(P<0.05)。(3)虽然对虾用于呼吸的能量分配比例没有显着性差异(P>0.05),但BG组和BY组对虾用于排泄的能量比例显着低于蓝光组(P<0.05),而用于生长的能量比例均显着高于蓝光组(P<0.05)。(4)光色的节律性变化显着提高了对虾用于蜕皮的能量,对虾的蜕皮率显着高于恒定光照组(P<0.05)。(5)实验结束后对虾的体组成中灰分含量基本上与对虾的末干体重成正比,粗蛋白没有明显的相关性,脂肪含量与水分含量基本呈负相关。4、光色周期性变化对凡纳滨对虾蜕皮和生长的影响及机制采用实验生态学方法研究了光色的周期性变化对凡纳滨对虾稚虾蜕皮和生长的影响。实验设计了黄光(Y)、绿光(G)、蓝光(B)叁个恒定光照组,蓝光变黄光(BY)、蓝光变绿光(BG)、绿光变黄光(GY)叁个光色变化组。实验虾的初始湿体重为(1.212±0.011)g,养殖周期为45天。主要结果如下：(1)BG组对虾的相对增重率和特定生长率均为最高,与Y组、B组和GY组均有显着性差异(P<0.05)。GY组对虾仅相对增重率显着高于Y组和B组(P<0.05),而其特定生长率与Y组和B组没有显着性差异(P>0.05)。(2)对虾的摄食率在五个处理组之间未出现显着性差异(P>0.05),GY组对虾的食物转化效率与Y组和B组也未出现显着性差异(P>0.05),但BG组和BY组对虾的食物转化效率却显着高于Y组和B组(P<0.05)。(3)BG组对虾用于呼吸的能量比例虽然与其他组在统计学上没有差异,但其比生长最差的B组低了大约4%；因而BG组对虾用于生长的能量比例显着高于Y组和B组(P<0.05)。(4)对虾的蜕皮率以GY组最高,各组对虾的蜕皮率与生长之间未出现明显的相关性。(5)实验结束后对虾体组成中灰分含量基本上与对虾的末干体重成正比,粗蛋白没有明显的相关性；光色的周期性波动降低了对虾体组成中粗脂肪的含量。二、光照波动对凡纳滨对虾生长影响机制的初步研究1、光照强度及周期性变化对凡纳滨对虾乳酸含量、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶活力的影响实验室条件下研究了光照强度及周期性变化对凡纳滨对虾乳酸含量、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶活力的影响。实验设600-60 lx、1500-60 lx、3000-60 lx和6000-60 lx四个光照强度周期性突变组及60 lx、600 lx、1500 lx、3000 lx和6000lx五个恒定光照组。光强突变组采用先高光强照射6天后再低光强照射2天的方式进行周期性波动,光照周期为14L:10D。所有处理组对虾经过16天的驯化后开始实验。恒定光照组取样的时间点分别为：光照0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、14 h；光强突变组取样的时间点为：一个光照周期开始后的0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、144 h、144.5 h(即光强改变后0.5 h)、145 h、147 h、150 h、156 h、168 h、192 h。每个取样点取5尾蜕皮间期的对虾,分别测定对虾肝胰脏中丙酮酸激酶(PK)活力、肌肉中乳酸脱氢酶活(LDH)活力和乳酸(LD)含量。主要实验结果如下：(1)光照强度周期性突变整体上降低了对虾肝胰脏中PK和LDH的活力,而对虾肌肉中的LD含量没有明显变化,这可能与光照强度周期波动提高了对虾机体有关酶的功效有关。(2)、恒定600 lx组和光强突变1500-60 lx组对虾的各种指标变化幅度较小,而6000 lx组和光照突变600-60 lx组对虾的各种指标波动幅度较大。(3)6000-60 lx组对虾肌肉中乳酸含量在高光照阶段一直维持在一个较高的水平,而600-60 lx组对虾在高光照后期和低光照开始阶段的肌肉中乳酸含量很高,说明这两种光照强度的波动给凡纳滨对虾造成了胁迫影响。(4)本实验中高光强向低光强波动时,对虾肌肉中LDH活力的波动比低光强向高光强波动时大,这可能与对虾对不同光照强度的适应不同以及光强波动周期中高光强照射时间较长有关。结果表明适宜的光照强度周期性波动使对虾机体内酶的功效提升,且其体内酶的波动幅度较小,有利于对虾的生长。2、光色及其日节律性变化对凡纳滨对虾葡萄糖、乳酸含量及肝胰脏中己糖激酶和丙酮酸激酶活力的影响本文在实验室条件下研究了光色及其日节律性变化对凡纳滨对虾葡萄糖、乳酸含量及肝胰脏中己糖激酶和丙酮酸激酶活力的影响。实验设蓝光向绿光日节律变化组、恒定蓝光和绿光共叁个光色处理组,分别在实验开始的第1、3、5、10、20和40天,于每天的7：00、9：00、13：00、14：00、16：00、20：00从各处理组中挑选蜕皮间期的对虾5尾用于葡萄糖、乳酸含量及肝胰脏中己糖激酶和丙酮酸激酶活力的测定。主要实验结果如下：(1)开灯刺激引起各组对虾葡萄糖含量有小幅度提升,但对对虾乳酸含量没有显着的影响；蓝光和绿光组对虾肝胰脏中己糖激酶活力在开灯后有所下降,光色变化组则有所增加,而对虾丙酮酸激酶活力不受开灯刺激的影响。(2)在实验开始阶段,光色的日节律性变化对对虾血清中的葡萄糖、乳酸含量及肝胰脏中己糖激酶和丙酮酸激酶活力都有一定的影响,随着实验进行,这种影响在20天内逐步消失。(3)蓝光组对虾肝胰脏中己糖激酶和丙酮酸激酶活力在一天内波动的幅度较大,且这种波动趋于稳定的时间较长；而绿光组对虾肝胰脏中己糖激酶和丙酮酸激酶活力在一天内相对平稳。叁、温度波动对凡纳滨对虾生长影响机制的初步研究1、温度周期性波动对凡纳滨对虾生长、糖酵解酶及HSP70的影响本实验以水温25℃为恒温对照,设计4个不同幅度的变温组,分别为25℃±1℃、25℃±2℃、25℃±3℃、25℃±4℃,研究了五种不同温度处理下凡纳滨对虾生长、摄食率及饵料转化率；并在实验结束时取样测定了对虾血清中的葡萄糖含量、肝胰脏中的己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)及肌肉组织中的热休克蛋白70的相对含量。结果表明：在平均温度为25℃时,变温幅度为±2℃和±3℃组对虾的特定生长率均高于恒温对照组,且以±2℃组最高；而变温幅度为±4℃组对虾的特定生长率显着低于其他各处理组。±4℃组摄食率最低,且其食物转化效率显着低于生长较好的±2℃和±3℃组。±2℃和±3℃组对虾的摄食率与其他处理组没有显着性差异,但对虾的食物转化效率显着高于其他组。由此可以推断：在平均温度为25℃时,适宜的变温幅度促进对虾生长的原因是提高了对虾的食物转化效率；而±4℃组对虾的摄食率和食物转化效率均低,这是导致对虾生长不良的原因。相关生理指标分析发现,±4℃组对虾血液中葡萄糖含量最低而丙酮酸激酶活力最高,说明对虾一直处于环境的胁迫下,需通过糖酵解代谢产生更多的能量用于抵抗不良的环境,影响了对虾用于生长的能量。±3℃组对虾血液中葡萄糖含量最高而已糖激酶的活力最低,表明机体没有出现对胁迫的响应机制,温度的波动并没有对凡纳滨对虾的生长产生不良的影响,对虾丙酮酸激酶的活力适中也进一步说明了此问题。相对于恒温组,各变温组对虾热休克蛋白没有显着性增高,可能与±4℃的温度波动幅度并没有诱导对虾热休克蛋白的高效表达有关。2、温度周期性波动过程中凡纳滨对虾糖酵解酶和热休克蛋白70的变化本实验以水温25℃为恒温对照,设计4个不同幅度的变温组,分别为25℃±1℃、25℃±2℃、25℃±3℃、25℃±4℃,研究了五种不同温度处理下凡纳滨血清中的葡萄糖含量、肝胰脏中的已糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)及肌肉组织中的热休克蛋白70的相对含量在一天内的变化。结果表明：在恒温组中葡萄糖含量和热休克蛋白70均存在昼夜变化规律,但在温度波动组中这种规律随着波动幅度的增大逐渐消失。恒温组的PK活力变化幅度不大,随着温度波动幅度的增大,其变化逐渐剧烈,以25℃±4℃组尤为明显。HK活力受到葡萄糖流量和糖酵解作用的影响,随着温度变化幅度的增加,其变化也有所趋于平稳,但没有葡萄糖明显。
王宝杰[3]2010年在《中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）血淋巴蛋白质组学的初步研究》文中提出中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）是中国近海特有种，主要分布于我国黄渤海和朝鲜西部沿海，是我国最具经济价值和营养价值的海产品之一。对虾的血淋巴承担着许多重要的生理机能，是内环境中重要的组成部分，通过消化吸收的营养物质和体内分泌的激素等，大多通过血淋巴运输到各组织细胞中，维持机体的基础代谢和生长发育。对虾的血淋巴是中间代谢的场所，其蛋白质的变化将有效揭示对虾生理和病理的变化机制。因此，要对复杂的生命活动有全面的认识，必然要在蛋白质水平上对生物体进行深入的研究。对虾血淋巴蛋白质组学作为功能基因组研究的重要内容之一，目前处于刚起步阶段，国内外报道不多。本论文是围绕当前血淋巴蛋白质组学研究中存在的问题开展工作的，首先对中国明对虾血淋巴中的2种最主要的高丰度蛋白（血蓝蛋白、凝血蛋白）进行了研究，以了解中国明对虾高丰度蛋白的性质以及在血淋巴中的组成与存在形式；在此基础上，建立起一套适合对虾血浆蛋白组分析的双向电泳技术，应用多种方法建立与评估了血浆高丰度蛋白的去除技术，为甲壳动物血淋巴蛋白质组研究提供了可靠的技术手段；进一步应用差异蛋白质组学的方法基于两种策略（2-DE、ClinProt）研究分析了对虾血淋巴在LPS免疫诱导下早期蛋白质表达的变化，筛选出一批与早期免疫防御相关的蛋白与多肽，在研究血淋巴蛋白质组学新方法的建立方面进行了有益的探索和研究。主要包括以下内容：一、中国明对虾血淋巴主要高丰度蛋白的研究应用超速离心、凝胶过滤层析与离子交换层析对中国明对虾血淋巴中不同多聚体的血蓝蛋白进行了分离纯化，得到了六聚体（450kDa）与十二聚体（900kDa）血蓝蛋白，研究发现，六聚体血蓝蛋白由3个亚基组成，十二聚体血蓝蛋白由4个亚基组成，其亚基分子量均约为75kDa，它们含有3个共同的亚基，十二聚体含有一特有亚基；通过对血淋巴中血蓝蛋白的多聚体存在形式分析，发现血蓝蛋白在天然血淋巴中主要以六聚体和十二聚体形式存在，六聚体存在形式非常稳定，而十二聚体在强碱、去除Ca2+以或添加还原剂等情况下会发生解离，各种形式的血蓝蛋白多聚体是对虾血淋巴中最主要的高丰度蛋白；将纯化的血蓝蛋白用于制备多克隆抗体，ELISA方法检测抗体效价高，蛋白印迹检测对虾血淋巴获得特异性条带与预期大小一致，可用于进一步科学研究。通过联合应用离子交换层析与疏水作用层析从中国明对虾的血淋巴中分离纯化出凝血蛋白（CP）。该CP在体外凝血实验中有HLS和Ca2+存在的情况下可以形成血凝块，从而揭示了中国明对虾的凝血反应也是由Ca2+依赖性的转谷氨酰胺酶所催化。经SDS-PAGE分析纯化的CP约为380kDa，其亚基的分子量约为190kDa，说明该蛋白是由两个相同的亚基组成的同源二聚体。N末端氨基酸序列分析表明，中国明对虾CP的N末端序列与凡纳滨对虾、保罗美对虾具有100%的相似性，与其他对虾的比对也具有66%至80%的较高相似性。利用同源克隆技术获得了CP基因518bp的cDNA片段，分析表明该基因序列与其他虾类CP基因序列的具有很高的同源性。通过RT-PCR对CP基因的组织表达谱进行了分析，发现心脏和表皮是该基因主要的合成表达部位。二、中国明对虾血淋巴双向电泳蛋白质组学平台的优化与建立本论文提出了中国明对虾血淋巴采集的标准化方式，中国明对虾的血淋巴经脱盐处理后，通过固相pH梯度胶条等电聚焦、SDS-PAGE垂直电泳对蛋白质进行分离，对不同pH范围IPG胶条、脱盐方式、上样方式、上样量等进行了优化，并分别利用硝酸银和胶体考染方法进行染色，应用PDQuest软件对图谱进行了初步分析，采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对主要的高丰度蛋白点进行了质谱鉴定。结果显示中国明对虾血淋巴在pH4～7范围、18cm的2-DE胶上得到了很好的分离，上样量为150μg左右，采用银染可以获得较好的分析胶图谱；而上样1000μg左右，采用胶体考染方法能获得较好的制备胶图谱；通过MALDI-TOF/TOF MS鉴定的11个最主要的高丰度蛋白点都是血蓝蛋白。本研究建立并优化了中国明对虾血淋巴蛋白质组学的双向电泳技术体系，为进一步开展对虾等甲壳动物的血淋巴蛋白质组学研究奠定了基础。应用超速离心技术、固定化金属亲和层析技术、PEG分级沉淀技术去除中国明对虾血淋巴高丰度蛋白—血蓝蛋白，首先进行了各种技术关键参数的筛选，制备了去除高丰度蛋白后的样品，进一步比较了去除前后对虾血淋巴2-DE图谱的差异以判断去除的效果，结果显示超速离心技术可有效去除对虾血淋巴高丰度蛋白（血蓝蛋白），提高低丰度蛋白的检出敏感性，初步解决了分析样品中的高丰度蛋白是影响蛋白质表达谱分析的重要障碍和技术瓶颈，为甲壳动物血淋巴蛋白质组研究提供了可靠的技术手段。叁、基于两种策略的中国明对虾免疫诱导的血淋巴差异蛋白质组（多肽组）学研究运用2-DE差异蛋白质组学的方法分析了LPS免疫诱导后早期对虾血淋巴中蛋白质表达水平的变化。用LPS免疫刺激对虾后，用双向凝胶电泳的方法来检测血淋巴中蛋白质的表达。在双向电泳图谱上的300多蛋白点中检测到5个蛋白质斑点在免疫诱导后上调，10个蛋白质斑点在免疫诱导后下调。利用MALDI-TOF MS对15个差异表达的蛋白质进行了鉴定，其中有6个为血蓝蛋白，上述结果表明，在免疫诱导的急性期血蓝蛋白可能以多种形式参与了对虾的急性感染期的免疫反应，是一种非常重要的免疫功能蛋白。本项目采用先进液体芯片飞行时间质谱技术（ClinProt系统）对不同采集方式的中国明对虾血淋巴样品进行了分析，初步建立起一套稳定的中国明对虾血清多肽组学分析的研究方法，并对注射LPS诱导的急性时相反应的血清多肽谱的变化进行了质谱分析，共检测到103个蛋白峰，蛋白范围集中于1000～10000Da，利用FlexAnalysis3.0和ClinProTools等相关支持软件筛选出对照组与注射LPS组组间有13个差异表达蛋白（多肽）且都是在免疫诱导呈后低表达(p<0.05)，通过遗传算法（GA）建模得出免疫诱导组的诊断组合模式，其诊断灵敏度为100%，特异性为100%。为从血淋巴中筛选出具有早期免疫防御功能的标志蛋白或多肽，从而进一步为对虾等甲壳动物的免疫反应机理研究奠定了基础。上述研究为了解中国明对虾独特的免疫防御机制提供了理论依据与新的技术手段，使我们对甲壳动物的天然免疫反应有了进一步的认识，同时也为今后开展大规模的中国明对虾血淋巴蛋白质组学研究工作奠定了良好的基础。
王金凤[4]2017年在《寄生性甲藻血卵涡鞭虫流行病学及致病机理初探》文中研究指明血卵涡鞭虫(Hematodinium)是一类感染多种海水甲壳动物的致病性寄生性甲藻。近年来,该藻导致的流行病频繁暴发,严重影响了全球多种野生经济甲壳动物的渔业生产,对我国海水养殖业的健康持续发展也造成了严重威胁。研究血卵涡鞭虫的发病规律、致病机制以及宿主对其免疫防御机制是防控该类病害的基础。因此,本论文分别从血卵涡鞭虫流行病学、生活史、致病机理及宿主免疫防御方面进行系统探究,以期为血卵涡鞭虫流行病的防控提供一定的数据参考和理论依据。本论文主要研究结果如下:1.采用血涂片和分子生物学方法对我国东部沿海地区野生和养殖蟹类感染血卵涡鞭虫状况进行调查,发现血卵涡鞭虫在我国分布十分广泛。在辽宁、山东、浙江地区的野生叁疣梭子蟹和广东的野生拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)中均发现了血卵涡鞭虫的感染;对山东青岛叁疣梭子蟹重要养殖基地虾蟹混养池塘的连续监测发现,血卵涡鞭虫病在叁疣梭子蟹整个养殖周期内持续发生,感染率呈现先上升后下降的变化趋势,最高值出现在7月末,可达90%。伴随着叁疣梭子蟹血卵涡鞭虫病的暴发,混养池塘中斑节对虾(Penaeus monodon)大批量死亡,经检测确定为血卵涡鞭虫感染所致,这在国内外尚属首次发现和报道。2.通过分子生物学和体外培养技术手段,研究了感染养殖叁疣梭子蟹和斑节对虾的血卵涡鞭虫的生物学特征。成功建立了血卵涡鞭虫的体外培养,观测到其生活史过程中历经的丝状滋养体、类变形虫状滋养体、团块状聚合体、裂殖体、蛛网状滋养体、孢子体、孢子母细胞、孢子前细胞和孢子生活史阶段。分子遗传分析结果显示感染叁疣梭子蟹和斑节对虾的血卵涡鞭虫的种群同源性高达99.2%,与我国其他地区发现的血卵涡鞭虫属于同一类群(Hematodinium perezi II)。3.通过血涂片法和H&E染色法初步探究了血卵涡鞭虫感染叁疣梭子蟹后的增殖过程和致病机理。发现血卵涡鞭虫主要寄生于宿主肝胰腺、心脏等主要器官的血腔和血窦内,其大量增殖可导致宿主肝胰腺、心脏、鳃和肌肉等重要器官、组织发生系统性病变,最终宿主消化、代谢、呼吸等功能的紊乱和丧失引发死亡。4.初步研究了叁疣梭子蟹抵御血卵涡鞭虫侵染的免疫响应中发挥重要作用的抗氧化酶GPx。首次克隆获得叁疣梭子蟹GPx基因全长c DNA序列,系统发育分析显示其优先与甲壳动物GPxs聚为一枝;叁疣梭子蟹GPx蛋白序列的预测叁维结构由3个α-螺旋和7个β-折迭片层组成,其催化位点为硒半胱氨酸(U),位于α1螺旋和β3折迭片层结构中;遭受血卵涡鞭虫侵染后,GPx基因在叁疣梭子蟹血细胞、肝胰腺、心脏和肌肉组织中的转录表达水平发生显着性变化,表明GPx在叁疣梭子蟹抵御血卵涡鞭虫的免疫响应过程中可通过缓解甲壳宿主体内的氧化应激反应从而对宿主产生重要的防护功能。
傅玲琳[5]2008年在《对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28枯草工程菌的构建与VP28卵黄抗体的制备及其抗病性研究》文中研究指明对虾白斑综合征(WSS)是全球对虾养殖业所面临的危害性最大的病害之一,至今已席卷了世界各国的对虾养殖地区,造成巨大的经济损失。但目前尚无有效的防治手段。因此,如何预防和控制该病毒病一直是近年来研究的热点。本研究在构建wssv重组VP28抗原蛋白枯草芽孢工程菌(B. subtilis-VP28)与卵黄抗体(VP28-IgY)的基础上,经口服途径免疫克氏原螯虾,进行保护螯虾抵抗WSSV感染的效果试验,并初步研究B.subtilis-VP28和VP28-IgY的抗病机理。主要研究内容和结果如下：1新型穿梭分泌性表达载体pBES的构建在多功能穿梭克隆载体pBEC(来源于B.subtilispUB1 10和Ecoli pGEM3载体)的基础上,引入B.subtilis强启动子PEσ43和一段新天然信号肽序列,构建了一新型Bsubtilis-E. coli穿梭分泌性表达载体pBES。为评价所构建载体的表达与分泌效率,引入β-葡聚糖酶报告基因,进行分泌量动态分析。经SDS-PAGE分析及不同时间酶活测定表明,β-葡聚糖酶报告基因成功获得分泌表达,在强启动子PEσ43作用下,其单位发酵液总酶活最高可达283.45 U／ml。然而,胞外酶活最高为116.95 U／ml,分泌比例为41.26%,可见此天然信号肽分泌能力有限,还需作进一步的突变筛选。2 B. subtilis信号肽结构区域氨基酸组成与分泌效率的关系从野生型天然信号肽N区正电荷数与H区疏水性改造的角度出发,构建了一系列(15个)信号肽突变体,研究信号肽结构区域氨基酸组成与信号肽功能的关系。实验结果表明,N区的正电荷有利于提高信号肽分泌能力,但过高的电荷反而使分泌效率有所下降；H区疏水性对分泌效率影响较大,过高或过低的疏水性都不利于分泌识别过程；同时具有N区高正电荷及H区高疏水性的信号肽,反而分泌效率低；在N区高正电荷的情况下,H区中度疏水性的信号肽分泌能力最强。本研究筛出了两条具有高分泌能力的突变信号肽：H3N2 (MRARKIAGM ATSGGVAQPSSAVA)、H3N23 (MRRRKIAGMATSGGVAQPSSAVA),报告基因胞外分泌量分别达到80.28%与80.66%,比亲本天然信号肽均提高1.95倍。本试验成功筛选并构建得到基于强启动子PEσ43与高分泌能力信号肽H3N2、H3N23的枯草芽孢杆菌高效分泌表达载体pBES-H3N2和pBES-H3N23。3 vp28基因的高效分泌表达及分泌动态分析利用构建的Bsubtilis高效分泌表达载体pBES-H3N2和pBES-H3N23,以低蛋白酶活性的B.subtilisWB600作为宿主菌,构建了重组VP28蛋白枯草芽孢工程菌B.subtilis (pBES(H3N2)-VP28)和B. subtilis (pBES(H3N23)-VP28),vp28基因成功获得胞外分泌表达。用兔抗anti-VP28 IgG检测,具有免疫反应性。对分泌效率进行动态分析,结果显示,两株高效表达菌株均在22 h时达到最大VP28蛋白分泌量,分别为45.6 mg／L和47.4 mg／L,22 h之后分泌量略有下降,最后趋于稳定。4特异性VP28-IgY的制备与稳定性研究将表达纯化的WSSV重组VP28抗原蛋白免疫150日龄的海兰白蛋鸡,免疫叁次,每隔2周免疫一次。对卵黄中特异性VP28-IgY的抗体效价及其变化规律进行检测。结果显示,在首免后第14天即可检测到特异性抗体(P/N=2.555,1：400)；第56天抗体效价达到最高(P/N=14.920,1：3200)；至120天试验结束时,抗体效价仍维持在较高水平(P/N=9.265,1：1600)。用水稀释法结合50%、33%饱和硫酸铵沉淀提纯IgY的方法,可得到特异性IgY估测纯度约为83.6%。SDS-PAGE分析提纯的IgY,发现重、轻链分别约为60 kDa与25 kDa,估算其总分子量约为170 kDa。对VP28-IgY稳定性研究表明,其在温度低于70℃、pH3.0-10.0范围内有较好的稳定性；对胃蛋白酶和渗透压具有较强的耐受性。5口服工程菌B.subtilis-VP28和VP28-IgY的螯虾体内保护效果制备芽孢期和营养期形式的工程菌Bsubtilis-VP28,并研究口服工程菌的保护效果。结果显示,以芽孢形式免疫组rVP28-bs的螯虾相对存活率均高于营养期形式组rVP28-bv,在免疫后第3、14、28天攻毒,前者相对存活率分别为65.4%、78.3%和59.7%,后者相对存活率分别为38.2%、51.7%和36.8%。为研究口服VP28-IgY中和病毒产生的保护效果,以0.01%、0.05%和0.1%的添加量添加至虾饵料,连续投喂20天后口服攻毒,相对存活率分别为48.3%、86.0%和88.3%。以上结果表明,工程菌Bsubtilis-VP28的芽孢形式,具有较理想的口服免疫效果；而以中和作用为主的VP28-IgY,其保护效果较为理想的最低添加量为0.05%。6B.subtilis-VP28和VP28-IgY抗病性机理初步研究对B.subtilis-VP28保护机理初步研究表明,工程菌Bsubtilis-VP28能特异性降低WSS的发病率,并同时激发螯虾体内非特异性免疫因子及提高抗氧化能力,从而增强虾体对WSSV的抵抗性。根据光镜、电镜观察结果推测,口服VP28-IgY(0.05%添加量)组,在攻毒后初期,螯虾体内大部分病毒被中和,另一小部分病毒侵入血细胞及其它组织细胞,但在未达到致死量或未使组织达到严重损伤时,即逐步被中和清除。Bsubtilis-VP28和VP28-IgY能中和与清除螯虾体内的病毒,并由此抑制或缓解WSSV引发的大量细胞凋亡。
郜卫华[6]2012年在《长期低盐胁迫诱导凡纳滨对虾肝胰腺差异表达基因的分析和鉴定》文中认为凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）广泛分布于太平洋沿岸水域秘鲁北部至墨西哥桑诺拉一带，以厄瓜多尔最为集中。作为一种广盐性的甲壳动物，凡纳滨对虾可以适应0.5~40的盐度范围。近年来，为了缓解海水养殖对沿海环境的污染并推进内陆盐碱地区养殖的发展，淡化苗种在内陆的低盐度养殖已经成为了水产养殖的一个重要发展方向，但极低盐度下养殖的对虾存在着叁个突出问题：生长速度慢、成活率低、免疫力低，对病原菌易感性增高，以上存在的现实问题制约了低盐度养殖的推广。开展长期低盐养殖对凡纳滨对虾的分子机理研究，不但可以为进一步为甲壳动物生理调节提供一定的理论依据，也为进一步从分子生物学水平进行相关的研究建立分子水平的检查平台。本研究利用抑制消减杂交技术构建了长期低盐诱导的凡纳滨对虾肝胰腺cDNA文库，对文库中拼接的序列进行了功能注释和分类，初步探明了长期低盐诱导后的凡纳滨对虾差异基因表达情况，并对筛选到的基因进行了长期不同低盐下转录水平变化的探讨，为从分子水平阐明长期胁迫机制奠定了基础。论文主要包括以下几方面内容：1．首次利用SSH技术构建了长期低盐诱导下凡纳滨对虾肝胰腺差异表达cDNA文库。实验用凡纳滨对虾初始体重为（0.27±0.01）g，饲养于盐度2和30中56天，取样后构建肝胰腺不同盐度养殖下的消减cDNA文库，随机挑选200个（正向80个，反向120个）阳性克隆进行测序，成功获得179个（正向64个，反向115个）ESTs序列，拼接后得到73个Unigenes，包括19个Contigs（正向7，反向12）和54个Singletons（正向19，反向35）。将正向文库26条Unigenes和反向文库的47条Unigenes分别用BlastX和BlastN程序与GenBank上的非冗余蛋白数据库（nr）和非冗余核酸数据库（nt）进行比对分析发现，75.34%的Unigenes（55/73）与公共数据库中已知的基因具有同源性。生物学信息分析表明，这些Unigenes所代表的相应基因的功能包括免疫相关、代谢相关、核蛋白、细胞凋亡和转移蛋白。这些基因信息也表明凡纳滨对虾在长期低盐胁迫诱导后，导致的生理变化非常复杂。文库中排第一位的是免疫相关基因，占47.06%（8/17），其中有5个来自反向文库，即在长期低渗胁迫中，文库中的62.5%免疫相关基因下调表达，以上结果为低渗胁迫和对虾免疫力之间的关系提供了有利的间接证据，也为对虾淡化养殖的免疫性能研究提供了研究方向。构建的差异表达cDNA文库可较好的反映长期低盐胁迫对凡纳滨对虾影响的基因信息，以上结果丰富了甲壳动物环境胁迫研究的基因信息。2．在长期盐度胁迫抑制性消减杂交文库构建的基础上，分析了反向文库编码血蓝蛋白、蜕皮类固醇调节蛋白、几丁质酶、胰凝乳蛋白酶1和胰蛋白酶5条基因mRNA表达量的变化情况，同时检验了这5条基因在短期盐度变化时（30→2/24h）mRNA表达量的变化情况。结果表明，反向文库中血蓝蛋白、几丁质酶、蜕皮类固醇调节蛋白、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶1基因转录水平下调表达验证了消减文库的构建是成功的。这5条基因mRNA表达量在胁迫24小时和56天后表达量变化明显不同，说明凡纳滨对虾对长期和短期盐度胁迫可能采取不同的应答策略，以上结果丰富了甲壳动物环境胁迫研究的基因信息。3．在长期盐度胁迫抑制性消减杂交文库构建的基础上，探讨了长期不同盐度养殖对凡纳滨对虾（平均体重0.27±0.01g）生长性能和胁迫响应相关基因（血蓝蛋白、几丁质酶、蜕皮类固醇调节蛋白、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶1）转录水平的影响，以期从分子机理上了解凡纳滨对虾长期低盐养殖生长性能和生理状态的关系。结果表明，降低盐度到一定程度可显着降低凡纳滨对虾的生长性能和成活率；不同的基因存在不同的盐度诱导范围；相对于海水对照组，血蓝蛋白和胰凝乳蛋白酶1转录水平与盐度呈正相关，因此，以上几种基因转录水平反映长期盐度胁迫的强度。4．本文利用SSH和RACE（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）技术，克隆了凡纳滨对虾儿茶酚-氧位-甲基转移酶（Catechol-O-methyltransferase，COMT，E.C.2.1.1.6）基因。该基因（LvCOMT）cDNA全长910bp（GenBank登录号：JQ345478），编码221个氨基酸，理论分子量74.9kDa，等电点4.98。经软件分析该成熟肽有12个磷酸化的氨基酸位点，不具信号肽，推测凡纳滨对虾COMT基因可能是依赖12个可能的氨基酸发生可逆的的磷酸化反应来进行调控作用的。LvCOMT基因与斑节对虾和中国明对虾的氧位-甲基转移酶具有高度的相似性，系统进化分析表明，LvCOMT在亲缘关系上更接近于哺乳动物的儿茶酚-氧位-甲基转移酶。应用RQ-PCR分析COMT在凡纳滨对虾中的组织特异性分布，结果显示COMT在肝胰腺组织中表达量最高，在鳃中的表达量最低。5．克隆了凡纳滨对虾对盐度胁迫应答的重要伴侣蛋白基因——钙网蛋白（calreticulin，CRT）基因（GenBank登录号：JQ682618）。LvCRT基因cDNA全长1866bp，编码406个氨基酸，具有保守的钙网蛋白家族标签（KHEQNIDCGGGYLKVF），信号肽（MKTWVFLALFGVVLVES）和保守的HDEL内质网回收标签。LvCRT基因与其它物种的钙网蛋白具有高度的相似性，系统进化分析表明，LvCRT在亲缘关系上更接近于昆虫的钙网蛋白。应用RQ-PCR分析CRT在凡纳滨对虾中的组织分布特异性，结果显示CRT在肌肉组织中表达量最低，在肠中的表达量最高。
崔浩[7]2017年在《养殖凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）细菌性白斑病的发生及其病原学病理学研究》文中认为凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国对虾的主养殖品种,随着养殖的深入开展,其产量近几年高居世界首位,为我国沿海乃至内陆地区的农业经济发展做出了突出贡献。然而,产业的发展也伴随着病害的发生。本文主要针对一种新型的对虾细菌性白斑病(Bacterial white spot disease,BWSD)进行了深入研究。2015~2016年,对浙江、河北、山东、江苏、天津五省市共9地区出现白斑症状的凡纳滨对虾150余口养殖池进行了调查,出现白斑症状的对虾检出率达84.7%。对调查中存在白斑症状的对虾进行取样,参照GB/T 28630.2-2012白斑综合症(WSD)诊断规程中套式PCR检测法,进行WSSV检测排查,各地甲壳上具有明显白斑的患病对虾均未被WSSV感染。调查发现养殖水温在26℃以上均有细菌性白斑病的发生,其发生不受养殖模式的影响,室外大塘、室外高位池、室外保温棚以及室内循环水工厂化四种主要养殖模式中均有检出。由于凡纳滨对虾一年四季均有养殖,养殖水温在26℃以上,故细菌性白斑病在一年四季均可发生。肉眼观察下,患细菌性白斑病(BWSD)对虾头胸甲出现的白色斑点与对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后的白斑极为相似,但不同的是,患细菌性白斑病初期,对虾健康状况良好,生长基本正常,活力比较旺盛,未出现明显死亡现象,而患病毒性对虾白斑综合征属急性死亡,2~3天内死亡率可达100%。由于养殖业者缺少区分细菌性白斑病和病毒性白斑综合征的技术,当白斑发生时往往采取消极措施,甚至紧急排塘,结束养殖,造成不必要的损失。本文对细菌性白斑病的组织病理学进行了研究。光学显微镜下观察,细菌性白斑呈圆形,具明显辐射肋,由白斑中心延伸至锯齿状的边缘;白斑的中心处通常呈暗褐色,后期此处虾壳被侵蚀穿孔;而由WSSV感染引起的白斑呈圆形,边缘光滑、规则,圆形中密集分布大量黑色小斑点,无明显中心。细菌性白斑病白斑处的组织病理学研究显示,白斑中心虾壳被细菌破坏、分解,壳下充满大量组织碎片和细菌,上皮组织以及结缔组织被严重破坏、侵蚀,出现断裂,最终在整体结构上形成明显凹陷与断层;高倍镜下观察发现,断裂的上皮组织与结缔组织得细胞核呈嗜碱性深染,壳下上皮组织与结缔组织伴有炎症、甚至坏死。电子显微镜下,细菌性白斑中心区域甲壳被细菌侵蚀,出现穿孔,穿孔四周甲壳呈絮状,并有大量的杆状细菌黏着、积聚。同时,白斑周围的健康甲壳也有大量杆状细菌附着。研究结果为区分细菌性和病毒性白斑奠定了基础。本研究从浙江、山东(2015年)、河北、天津、江苏和山东(2016年)患病对虾样品中的头胸甲白斑中心区域分离获得6株优势度达80%以上的优势菌,编号分别为ZJ201506、SD201508、HB201509、TJ201509、JS201510、SD201601。通过革兰氏染色、生理生化反应以及基于16s rDNA与基于gyr B的序列分析最终确定6株优势菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或其后期异型菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis);药敏实验结果为:6株优势菌对氧氟沙星、菌必治、头孢氨苄、盖博斯林、苯唑青霉素、头孢噻肟高度敏感;对青霉素、利福平、阿奇霉素、乙酰螺旋霉素不敏感。利用菌株JS201506对健康的凡纳滨对虾进行浸浴感染,浸浴浓度为5×102~5×106cfu/mL。同时设置创伤浸浴感染实验组,使用解剖刀对受试对虾甲壳进行创伤处理,以留下划痕不穿透为原则,创伤实验组浸浴浓度为5×104cfu/mL和5×105cfu/mL。结果显示,实际检测浓度为2×104cfu/mL感染组的受试对虾于27d出现与自然患病对虾相同的早期细菌性白斑;检测浓度为6.7×105cfu/mL感染组和9.1×105cfu/mL感染组分别在12d和10d出现早期白斑,在29d和25d时出现中、后期白斑。创伤实验组对虾头胸甲上均出现了沿创伤部位生长的白斑,且白斑较为明显,以上患病对虾均表现出活力正常,摄食状况良好,未出现明显死亡。因此,当水体中的解淀粉芽孢杆菌浓度高于104cfu/mL时,对虾存在感染细菌性白斑病的风险。从回感患病对虾白斑中心区域进行细菌分离得到一株优势度为87.1%的细菌,该菌革兰氏阳性,杆状,具芽孢。通过生理生化和16s r DNA的序列分析得出结论,分离的优势菌与菌株JS201506为同一株菌。本研究使用市场销售的3种不同品牌的以芽孢杆菌为主要成分菌的微生态制剂粉末充氧活化后,对健康凡纳滨对虾进行高浓度浸浴实验,施用量按照指导用量的4~5倍。结果显示:3种微生态制剂感染受试健康对虾分别在16d、20d和18d时,甲壳出现了典型的细菌性白斑症状,而受试对虾摄食状态良好,未出现死亡现象。因此,市售以芽孢杆菌为主要成分菌的微生态制剂高浓度施用会导致细菌性白斑病,故养殖过程中应合理的使用微生态制剂。综上,本文研究病毒和细菌两种对虾白斑症状的不同,正确的区分了细菌性白斑病与病毒性白斑综合征,对开展对虾健康养殖和相关病害防控具有重要的指导意义。通过对浙江、山东、河北、天津、江苏五省市对虾细菌性白斑病调查和致病原分析,发现解淀粉芽孢杆菌或其后期异型菌贝莱斯芽孢杆菌是的主要致病原,并且该病的发生与以芽孢杆菌为主要成分菌的微生态制剂过量施用存在关联。同时,本论文所得结论也为提高水产养殖的生态安全意识和正确使用微生态制剂提供了理论依据。
邬育龙[8]2017年在《感染WSSV后南美白对虾和罗氏沼虾生长及免疫调控机理初步研究》文中指出南美白对虾(Litopenaeus vannamei)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)已经成为我国主要养殖品种。本实验主要探讨了感染WSSV后罗氏沼虾及南美白对虾生长及免疫调控机理。首先在免疫方面,本实验初步研究了罗氏沼虾感染不同浓度WSSV 45天后,体内3种Toll样受体基因及免疫相关基因在不同组织中的表达情况,以及南美白对虾感染WSSV病毒14天后,体内相关免疫基因表达水平的变化情况。在生长方面本实验初步揭示了罗氏沼虾感染不同浓度WSSV 45天后,3种生长相关基因在肝胰腺中的表达情况及南美白对虾感染WSSV 14天后,3种生长相关基因在肝胰腺中的表达情况。叁方面研究结果如下:(1)罗氏沼虾感染不同浓度WSSV后3种Toll样受体基因及相关免疫基因在不同组织中的表达情况首先通过RT-PCR检测养殖45d后,各试验组虾3种Toll样受体基因在鳃和血淋巴中的表达情况。试验结果发现WSSV的感染浓度会影响罗氏沼虾3种Toll样受体基因在鳃和血淋巴中的表达情况。随着感染WSSV浓度的增加,罗氏沼虾3种Toll样受体基因在不同组织的表达量会上升。在第五组(1x103copy/ul)中3种Toll基因表达量均达到最大值。从第6组开始,感染WSSV浓度的上升会抑制叁种Toll样受体基因的表达量。从不同感染组在不同养殖时间的死亡率上看,随着感染浓度的增加,养殖时间的推迟,罗氏沼虾的死亡率呈上升趋势,当养殖到45d后第八组死亡率达到了70%是对照组的2.8倍。其次本实验中得到pro PO及PO基因的表达量变化趋势同3种Toll基因相似。结果表明,罗氏沼虾的叁种Toll基因均可以参加WSSV感染的免疫应答,在本试验第5组(1x103copy/ul)前,3种Toll样受体基因的表达量会随着感染WSSV的浓度增加而增加,在第5组浓度时达到最大值,但是感染WSSV浓度的进一步上升会抑制3种Toll样受体基因的表达。(2)罗氏沼虾感染不同浓度WSSV后组织蛋白酶L、几丁质酶、胰凝乳蛋白酶基因在肝胰腺中的表达情况本实验发现养殖45d后,罗氏沼虾的组织蛋白酶L、几丁质酶和胰凝乳蛋白酶基因在肝胰腺中表达情况出现随着感染WSSV浓度升高而下降的趋势。其中第五组(1x103copy/ul)3种基因出现了最低值,表明罗氏沼虾在这个感染浓度下3种基因的表达量受到强烈抑制。从表中不同养殖阶段相对增重率和相对生长率可以看出,随着感染WSSV浓度的增加和养殖时间的延长,罗氏沼虾出现生长缓慢现象。(3)感染WSSV 14天后南美白对虾组织蛋白酶L、几丁质酶和胰凝乳蛋白酶基因及相关免疫基因在肝胰腺中的表达情况本试验表示了南美白对虾在感染WSSV(1×103 copy/ul)14d后,相关免疫基因及生长基因分别在不同组织中的表达情况。感染WSSV 14天后,南美白对虾的鳃和血淋巴中pro PO及PO基因的表达量明显高于对照组和空白组(P<0.05)。3个生长相关基因的表达量明显低于对照组(P<0.05),说明存活个体可以通过提高并维持自身免疫相关基因的表达量来维持自身的免疫正常。
李红霞[9]2007年在《CpG寡脱氧核苷酸对中华绒螯蟹免疫功能调节作用的研究》文中指出CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN)，是人工合成的能够模拟细菌DNA的免疫刺激活性的含有CpG基序的ODN，大量研究表明，它们能激活人类、哺乳类及鱼类等动物的免疫系统，是一类良好的非特异性免疫增强剂与特异性免疫佐剂。但是，迄今为止，尚未见有关CpG ODNs对中华绒螯蟹免疫功能影响及其作用机理的研究报道。为探讨CpG ODNs对中华绒螯蟹蟹免疫功能及抗病力的影响，进行试验一。将ODN-1670(含1个CpG基序)和ODN-R(含1个反向CpG基序，即GpC)按1、5、25μg／kg体重的剂量体腔注射中华绒螯蟹，在注射之前(0d)和注射后第1、3、5、8d采样，同时以注射0.1mL生理盐水组与未进行任何处理的空白组作为对照，进行一系列免疫学指标的测定；并在第二次采样(第3d)时，从每个处理组中取蟹6只，以1.2×10~7cfu／kg体重的剂量体腔注射蟹致病性嗜水气单胞菌CL99920菌株，记录接种7d后各组蟹的累积死亡率。结果显示，注射适量的ODN-1670能显着地增加中华绒螯蟹的血细胞总量(THC)、透明细胞(HC)、小颗粒细胞(SGC)和颗粒细胞(GC)数量，显着地增强血细胞的吞噬活性和呼吸爆发活性，显着地增强血清酚氧化酶(PO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、溶菌酶(LSZ)、溶血素(Hemocytin)及抗菌活性(Ua)(P＜0.05)。此外，本试验条件下，ODN-1670还能明显提高中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的抗感染能力。与此同时，试验剂量的ODN-R除能使血清酚氧化酶活性显着增加(P＜0.05)外，对其他免疫指标的影响均不显着。本试验表明，适量的ODN-1670能增强中华绒螯蟹的免疫功能和抗病力，是适合中华绒螯蟹的新型潜在免疫增强剂，可进一步加以研发和利用。为初步探讨CpG ODN激活中华绒螯蟹血细胞酚氧化酶原(proPO)激活系统的信号转导途径，进行试验二。用适量的CpG ODN和几种细胞信号转导的激活剂或抑制剂处理M-199培养的离体中华绒螯蟹血细胞，通过检测血细胞胞内外酚氧化酶(PO)的增减情况，对CpG ODN触发proPO激活系统的信号转导途径进行评价。结果表明，本次试验所选ODN-1670与ODN-R均可触发蟹血细胞proPO激活系统。两者的信号转导途径相似，有可能都包含了G-蛋白介导的蛋白激酶C(PKC)途径，酪氨酸蛋白激酶(RTK)途径对ODN-1670的触发proPO激活系统的活化过程进行负调控。而依赖于cAMP的蛋白激酶A(PKA)途径可能不参与两种ODN诱导的proPO系统的活化过程。
潘清清[10]2008年在《锯缘青蟹免疫增强剂的筛选及在病害防控中的应用》文中研究说明锯缘青蟹(Scylla serrata)是我国主要的海水甲壳类养殖品种,总产量达到10.85万吨,占世界总养殖产量的88.14%。近年来养殖锯缘青蟹发生大规模疾病和死亡。青蟹发生的疾病有黄水病、弧菌病、纤毛虫病、白芒病、褐斑病、黄斑病等,病原包括细菌、病毒、环境因素及不明病因的疾病。2006年青蟹全国平均发病率为13.77%左右,全年经济损失为2.29亿元,严重制约了青蟹养殖健康可持续发展。作者研究了温度、pH、促进剂、抑制剂、菌体及免疫多糖对锯缘青蟹血细胞裂解物(HLS)酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活力的影响。试验结果表明:锯缘青蟹PO的最适作用温度为25℃,最适pH值为7.8;SDS、Ca~(2+)、Mg~(2+)均可提高PO的活力,其中Ca~(2+)和Mg~(2+)的最佳反应浓度分别为50 mmol/L和150 mmol/L,SDS的最佳反应浓度为2.5 mg/mL;迭氮钠、二乙基二硫代氨基甲酸钠、乙二胺四乙酸、Cu~(2+)对PO活力有不同的抑制作用。发现拟态弧菌SS060818、气单胞菌MrM0602、金黄色葡萄球菌ATCC25923、溶壁微球菌AS1.634对PO有激活作用,其中拟态弧菌和气单胞菌激活作用显着,金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌对PO有弱激活作用;肽聚糖、拟态弧菌脂多糖粗提物可显着提高PO活力,肽聚糖、脂多糖的最佳激活浓度2.7 mg/mL、0.5 mg/mL。此外,建立了超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、吞噬等青蟹非特异性免疫指标的测定方法。通过酚氧化酶体外增强试验,开展了青蟹免疫增强的筛选试验。选择了30多种中草药和食用菌,提取其免疫多糖,测定了免疫多糖对青蟹血淋巴酚氧化酶(PO)的增强作用。结果表明白术多糖、木耳多糖、金银花多糖、大黄多糖、猪苓多糖、陈皮多糖、CIS-1、CIS-2等均可显着提高PO活力,其最佳激活浓度范围为0.03 125μg/mL—0.125 mg/mL,其他多糖对PO促进作用较弱或无作用。选择CIS-1、CIS-2、连翘多糖分别以7.5×10~(-3)mg/mL、0.031 mg/mL和1.25×10~(-4)mg/mL对锯缘青蟹进行免疫注射实验,定期测定青蟹血淋巴的超氧化物岐化酶(SOD)、碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(POD)、酚氧化酶(PO)、血清抗菌活力和血细胞吞噬活力等指标。CIS-1、CIS-2、连翘多糖注射后,青蟹过氧化物酶(POD)、酚氧化酶(PO)活力和血细胞吞噬活性比对照组均有不同程度的提高;注射CIS-124h后,血淋巴SOD活性比对照提高了18.2%(由12.76 U/mgprot提高到15.08U/mgprot),ALP比对照组提高了75%(0.52 U/mL提高到0.91 U/mL);青蟹注射CIS-2和连翘多糖后,血淋巴SOD和ALP活性无明显提高。青蟹注射免疫多糖后,连翘多糖的抗菌活力未见明显提高,表明上连翘多糖对青蟹血清抗菌活力无明显增强作用。青蟹注射免疫多糖后,各组养殖箱中投入青蟹有较强致病力的拟态弧菌SS060818(V.minicus),终浓度为1×10~7cfu/mL。试验表明,注射CIS-1、CIS-2、连翘多糖组青蟹平均存活期比对照组分别增长55.92%、139.35%、12.43%。表明免疫多糖可提高青蟹对拟态弧菌的抵抗力。根据锯缘青蟹免疫增强剂注射试验结果,选择能显着提高锯缘青蟹免疫指标和存活率的CIS-1、CIS-2、PG、LPS作为免疫增强剂添加到饲料投喂青蟹,结果表明:投喂CIS-1、CIS-2、PG、LPS后,青蟹血淋巴过氧化物酶、酚氧化酶、碱性磷酸酶活力比对照组均有不同程度的提高;CIS-2试验组第6d ALP、POD和PO活力显着高于对照组,其中ALP活力达0.74U/mL,比对照提高155%;SOD活力第11d比对照提高了180%,显着高于对照组;投喂CIS-1和PG后青蟹血清中ALP活力在11d达到最高值,投喂PG、LPS第15d血清中的SOD活力显着高于对照组;各免疫组血清抗菌活力在第6d达到最大值,但差异不显着。投喂免疫多糖20d后,投入青蟹有较强致病力的拟态弧菌SS060818(V.minicus),终浓度为1×10~7cfu/mL感染青蟹,投喂CIS-1、CIS-2、PG、LPS组青蟹平均存活期比对照组分别增长了44.57%、104.51%、31.59%、78.70%,表明免疫多糖可提高青蟹对拟态弧菌的抵抗力。锯缘青蟹越冬养殖用CIS-1、CIS-2、PG、LPS注射免疫锯缘青蟹,测定青蟹血淋巴中ALP,SOD,PO,POD,血清抗菌活力等指标,结果表明:试验组ALP活力均高于对照组,其中以CIS-2效果最好,SOD、POD和PO的活力最高值分别可达18.55U/mgprot、0.16 U/mL和38.16 U/mL,分别比对照提高了50%、100%、176%,ALP活力仍处于较高水平;注射CIS-1和LPS的POD活力都在16d达到最高值为0.14 U/mL,比对照提高75%,作用效果显着;注射LPS后血清中ALP、PO活力在与对照组相比变化不明显;越冬45d后计算各试验组青蟹存活率,CIS-1、CIS-2、PG存活率分别为73%、82%、70%,均高于对照组。在生产性青蟹越冬池中,注射CIS-1和CIS-2,15d后测定青蟹血清的各免疫指标ALP、PO、SOD活力跟对照相比均有所提高,30d后CIS-1和CIS-2注射组的存活率为71%、88%,比对照组提高分别20.33%、49.15%,表明免疫多糖可提高青蟹的免疫力和存活率,有良好的应用前景。
参考文献：
[1]. 对虾甲壳形成机理初步研究[D]. 姜俊义. 中国海洋大学. 2004
[2]. 光照和温度波动对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）蜕皮和生长的影响及机制的初步研究[D]. 郭彪. 中国海洋大学. 2010
[3]. 中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）血淋巴蛋白质组学的初步研究[D]. 王宝杰. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2010
[4]. 寄生性甲藻血卵涡鞭虫流行病学及致病机理初探[D]. 王金凤. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所). 2017
[5]. 对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28枯草工程菌的构建与VP28卵黄抗体的制备及其抗病性研究[D]. 傅玲琳. 浙江大学. 2008
[6]. 长期低盐胁迫诱导凡纳滨对虾肝胰腺差异表达基因的分析和鉴定[D]. 郜卫华. 中国海洋大学. 2012
[7]. 养殖凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）细菌性白斑病的发生及其病原学病理学研究[D]. 崔浩. 上海海洋大学. 2017
[8]. 感染WSSV后南美白对虾和罗氏沼虾生长及免疫调控机理初步研究[D]. 邬育龙. 上海海洋大学. 2017
[9]. CpG寡脱氧核苷酸对中华绒螯蟹免疫功能调节作用的研究[D]. 李红霞. 苏州大学. 2007
[10]. 锯缘青蟹免疫增强剂的筛选及在病害防控中的应用[D]. 潘清清. 华中农业大学. 2008
标签：水产和渔业论文; 对虾论文; 光照强度论文; 分泌蛋白论文; 蛋白质结构论文; 基因合成论文; 甲壳论文; 血淋巴论文;