论文摘要
背景中间链球菌（Streptococcus intermedius）是一种兼性厌氧性、嗜微氧性、革兰氏阳性和β-溶血性微生物,通常栖息于口腔、咽喉和胃肠道菌群中。它与星座链球菌和咽峡链球菌一起属于咽峡链球菌菌群（Streptococcus anginosus group,SAG）。它们的特征都是分泌蛋白水解酶,破坏组织,促进脓肿形成。当机体免疫力降低时,该菌群感染的机会增加。在该菌群中,中间链球菌的致病性最强,表现为低生存率和较长的住院时间。由SAG菌群引起的化脓性感染主要发生在口腔和上体区。然而,中间链球菌更容易导致严重的脑和肝脓肿,最常见的是在口腔牙齿操作之后。由中间链球菌引起的脑脓肿的发病机制与肺炎链球菌相似,对人类的健康造成严重的威胁。鼻窦炎、发绀性先天性心脏病、中耳炎、龋齿等是中间链球菌感染的危险因素。随着越来越多中间链球菌引起各个部位的脓肿病例报道的出现,让人们越来越清晰地认识到中间链球菌与机体各个系统感染的临床关系,识别鉴定该菌种对患者的及时治疗有重要意义。无形体属、埃立克体属、新立克次体属和沃尔巴克氏体属细菌属于无形体科立克次体目a-变形菌纲变形菌门细菌界。无形体属细菌种类繁多,目前包括嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum,AP）、中央无形体（Anaplasma centrale）、边缘无形体（Anaplasma marginale）、绵羊无形体（Anaplasma ovil）、牛无形体（Anaplasma boivs）、山羊无形体（Anaplasma capra）、血小板无形体（Anaplasma platys）和尾状无形体（Anaplasma caudatum）等。无形体病（anaplasmosis）是无形体属的各种细菌成员引起的威胁人类健康的急性发热性经蜱传播的人畜共患自然疫源性疾病。嗜吞噬细胞无形体、山羊无形体、绵羊无形体可感染人类,对人类造成严重的疾病。而中央无形体、边缘无形体、绵羊无形体、牛无形体和血小板无形体可以感染羊、牛、鹿和狗等哺乳类动物。无形体需要依赖于在宿主动物体内的持续性感染来维持其自然循环。野生哺乳动物、许多小型兽类和家畜等都可作为病原体的携带者和传染源,并且不同地区不同种类的病原体具有不同的优势宿主。蜱虫是无形体最重要的传播媒介。无形体主要通过蜱虫叮咬的方式传播,蜱虫叮咬携带病原体的宿主动物后,将病原体经期传播至下一个阶段,如幼蜱获得病原体后可以将病原体传播至稚蜱和成蜱阶段,并在再次叮咬宿主动物时,病原体随之进入下一个宿主动物引起疾病。目前已有大量的文献报道在不同地区不同蜱种内检测到无形体核酸序列。由于生态环境的变化,蜱的分布范围越来越广泛,人的生活环境和宿主动物的生态的改变使人类与蜱的接触越来越多,关系也越密切,而且由于病原体的不断变异和进化,促使新发蜱媒传染病的增加和新的人畜共患病的发生,因此了解此类疾病的传播媒介和宿主的流行病学特征,对于做好新发传染病的预防和控制具有重要的作用。汉坦病毒（Hantavirus,HV）主要引起两种疾病:肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）和汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome,HPS）。HV的主要宿主是啮齿类和食虫目动物,可造成宿主终生携带病毒的持续性隐性感染状态。人类吸入带病毒的宿主动物的排泄物,如尿液、粪便、唾液等的气溶胶,或者食入被感染的食物和被携带病毒的宿主动物抓咬造成伤口等的接触感染。HV具有宿主特异性,并且与其宿主动物共进化,如鼠亚科相关的汉滩病毒（HTNV）、汉城病毒（SEOV）、多布拉伐病毒（DOBV）,田鼠亚科相关的普马拉病毒（PUUV）、希望山病毒（PHV）,主要分布于欧洲和亚洲,可引起HFRS。棉鼠亚科相关的辛诺柏病毒（SNV）和安第斯病毒（ANDV）,主要分布于美洲,可引起HPS。食虫动物相关的汉坦病毒分布广泛,其致病性尚未知,如索托帕拉雅病毒（TPMV）。HFRS在世界范围内不断发生,成为一个严重的世界性的公共卫生问题。我国是世界上HFRS发病率最高的国家,每年新报道病例数占全球新报道病例数的九成以上,迄今为止我国累计发病人数超过100万,平均发病率估计在3.5/10万左右,流行期间可造成30%的感染者死亡,该病在我国分布广泛且疫区类型复杂,成为我国重点防治的传染病之一。目的1.运用基因组学的方法分析中间链球菌的基因组特征、毒力因子、泛基因组特征等,揭示其致病机制及遗传多样性,为临床诊断和治疗提供理论依据以及引起医务工作者对中间链球菌感染的重视及预防医院内感染。2.通过检测、分析自然状态下传播媒介蜱类携带无形体的感染状况,以及对蜱中是否携带新型无形体进行筛查,为无形体病的预防控制提供理论基础以及引起卫生工作者和普通人对新型致病菌的重视。3.通过检测食虫目鼩鼱类动物中携带汉坦病毒的感染状况,对山东省内食虫动物相关汉坦病毒进行筛查,进一步分析鼩鼱是否同时携带食虫动物相关汉坦病毒MJNV和鼠类媒介传播的HTNV和SEOV,以及对食虫动物相关汉坦病毒的致病性进行初步分析,为汉坦病毒的预防控制提供理论依据。方法1.中间链球菌泛基因组学分析（1）中间链球菌株收集及分离培养,中间链球球菌感染病人的组织样本由法国马赛市地中海传染病机构收集提供,收集时间为2014年8月到2016年11月。从NCBI GenBank数据库搜索并下载中间链球菌菌株的基因组序列信息,纳入分析的菌株序列需要是整个基因组的全长序列。（2）菌种鉴定,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）方法对获得的菌株进行细菌种属鉴定。（3）提取中间链球菌基因组DNA,基因组DNA在MiSeq Technology测序仪器（Illumina,Inc,San Diego CA 92121,USA）上进行测序。基因组测序后获得到reads,使用软件A5-miseq和SPAdes对基因组reads序列进行组装获得scaffolds序列文件。使用NCBI-BLAST对序列进行比对,结合参考序列,删除污染序列,获得最终的基因组序列。使用Prodigal软件对基因组进行开放阅读框（ORF）预测,软件Prokka和在线工具RAST对格式为fasta文件的全基因组序列进行功能注释。使用软件AGIOS（Average ofgenomic identity of orthologous gene sequences）、OrthoANI（Average nucleotide identity,ANI）、在线工具GGDC（Genome-to-Genome Distance Calculator）分别对基因组核酸系列相似性进行分析。采用NCBI-BLAST软件将菌株蛋白质序列与毒力因子数据库VFDB进行比对筛选,确定中间链球菌的毒力因子。使用在线工具ResFinder和ARG-ANNOT（Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation）数据库分别鉴定中间链球菌的耐药基因。使用在线工具PHASTER预测该菌株基因组中有可能存在的前噬菌体序列。使用软件GETHOMOLOGUES、Roary、Proteinortho分别对中间链菌进行泛基因组分析,设置参数identity≥70%、coverage≥700%,确定其泛基因组特征。在线工具CRISPRCasFinder程序可以对提交的基因组序列数据进行分析,鉴定CRISPRs（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）序列和cas基因,并且确定CRISPR-Cas的类型和亚型。使用COG（Clusters of Orthologous Groups）数据库来对中间链球菌直系同源序列进行功能分类,参数设置为E-value le-03,coverage 0.7,identity percent 30%。利用软件DNAPlotter按照COG功能分类生成彩色圆形基因组图谱,并且生成G+C含量沿基因组分布以及GC-skew值（（G-C）/（G+C））沿基因组的分布。2.动物标本的采集及检测（1）2013年6月-7月,以山东省青岛市黄岛区野外草地为调查点,使用布旗法采集蜱样本,并对蜱虫的生长周期及形态学进行鉴定,将蜱虫分类保存。自碑虫内提取总DNA,使用种属特异性引物,巢式聚合酶链式反应（PCR,Polymerase Chain Reaction）扩增无形体的16S rRNA（rrs）基因片段,并对阳性PCR产物进行转化,筛选阳性克隆进行测序。测序结果使用NCBI-BLAST与nr数据库进行比对分析,判断其是否为无形体序列以及无形体的类型,并将所得的无形体序列上传到GenBank数据库中,获得访问号码。根据PCR阳性结果,计算蜱虫的最小阳性感染率。（2）扩增该无形体的gltA基因、groEL基因、msp4基因、msp2基因分别与GenBank数据库中的其他类型的无形体参考株序列进行比对分析,使用软件MEGA 5.0 Clustal W程序进行比对,使用最大似然法（Maximum Likelihood Method）、选择“Kimura 2-parameter model”模型、“use all sites”参数、“lSt+2+3+Noncoding Sites”、Bootstrap方法、1000 为系数对mas格式数据文件进行运算分析,构建系统发育树。（3）2014年1月-12月（除9月外）,同样以山东省青岛市黄岛区为调查点,使用鼠笼及鼠夹的方法,捕获宿主动物,并对宿主动物进行种属和性别鉴定,无菌条件下采集动物的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及心脏血标本。设计合成简并引物,RT-PCR及巢式PCR,扩增食虫动物相关汉坦病毒及汉滩病毒和汉城病毒的S片段部分序列,测定序列。根据PCR阳性结果,计算宿主动物的感染率。对确定的汉坦病毒进行扩增L和M片段,并且构建系统发育树。3.对MJNV致病性的初步分析,收集疑似HFRS病人的急性期血清,血清来自山东省青岛市疾病预防控制中心与山东省淄博市疾病预防控制中心。提取病人血清中的总RNA,RT-PCR扩增病人血清中MJNV核酸,初步筛查MJNV的致病性。对比SEOV与MJNV核衣壳蛋白氨基酸序列,找出两种病毒各自特异的氨基酸部分,构建原核表达载体,表达并纯化核衣壳蛋白部分片段。结果1.一共得到实验室分离出13株与GenBank中的14株的中间链球菌基因组序列。27株中间链球菌基因组的直系同源基因序列的基因组一致性的平均值（AGIOS）为50.96%-77.l10%,平均核苷酸序列一致性（OrthoANI）为97.78%-100.000%,基因组与基因组距离GGDC数值（dDDH）为 80.5%-99.3%。27株中间链球菌共含有252个毒力因子基因,其中有69个核心毒力因子和79个菌株特异的毒力因子。仅在29.6%（8/27）的菌株中鉴定出耐药基因:erm（B）和/或tet（M）基因。所有中间链球菌均含有前噬菌体序列。在51.85%（14/27）的中间链球菌株中预测到CRISPRs序列,其中3株菌株含有不止一段CRISPRs序列。2.27株中间链球菌的泛基因组大小为4020,其中包含1355个核心基因,约占基因家族总数的33.7l1%,平均每个菌株中72.45%的基因为核心基因,核心基因的平均序列一致性为97.79%。1611个非必需基因,约占基因家族总数的40.07%。1054个菌株特有基因,约占基因家族总数的26.220%,平均每个菌株中含有39个菌株特有基因。中间链球菌的泛基因组为开放型泛基因组（open）。中间链球菌泛基因组菌株特异基因仅有44.4%的基因与COG数据库匹配,而超过90%的核心基因具有COG功能分类。27株的COG功能分布非常相似。在所有中间链球菌菌株中大约79.72%的蛋白质存在于COG家族中。数量最丰富的类别是与碳水化合物转运、代谢（G）和翻译、核糖体结构和生物合成（J）相关的蛋白质类。3.捕获蜱种构成及感染状况2013年6月-7月在山东省青岛市黄岛区共采集到蜱样本3,300只,其中成蜱1,620只（49.09%）、稚蜱1,560只（47.27%）、幼蜱120只（3.64%）。所采集的蜱样本全部为长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）。按照5只成蜱、20只稚蜱、40只幼蜱分别为一组提取DNA,山东省青岛市黄岛区有69组A.bovis阳性,其中有46组成蜱、22组稚蜱、1组幼蜱。使用最小感染率计算,A.bovis的阳性率为2.09%（69/3,300）,成蜱、稚蜱、幼蜱A.bovis的阳性率分别为2.84%（46/1,620）、1.41%（22/1,560）、0.83%（1/120）。山东省长角血蜱中A.capra的阳性率为0.24%（8/3,300）。稚蜱中A.capra的阳性率为0.06%（1/1,560）,成蜱中A.capra的阳性率为0.43%（7/1,620）,幼蜱中没有检测到A.capra。4.捕获鼩鼯类和啮齿类动物种属构成及感染状况（1）2014年1月-12月（除9月外）,在山东省青岛市黄岛区一共捕获178只鼩鼱（雄性54只,占30.34%,雌性124只,占69.66%）,均为麝鼩属,其中大麝鼩164只,占92.13%,灰麝鼩7只,占3.93%,山东小麝鼩7只,占3.93%。优势种为大麝鼩。一共检测2014年啮齿鼠类样本475只（雄性176只,占37.05%,雌性299只,占62.95%）,共有7种,包括黑线姬鼠163只,（34.32%）,小家鼠102只（21.47%）,褐家鼠88只（18.53%）、大仓鼠62只（13.03%）,灰仓鼠29只（6.11%）,黑线仓鼠29只（6.11%）,黄胸鼠2只（0.42%）。优势种为黑线姬鼠,其次为小家鼠。（2）经过PCR检测,共有19只鼩鼱样本为MJNV阳性,包括17只大麝鼩和1只山东小麝鼩。鼩鼱携带MJNV的阳性率为10.67%（19/178）。共有2只鼩鼱（均为大麝鼩）样本为SEOV阳性,阳性率为1.12%（2/178）。没有在鼠类动物样本中检测到食虫动物相关汉坦病毒。没有发现鼩鼱类宿主动物同时携带两种汉坦病毒。5.成功构建原核表达载体,表达并纯化MJNV与SEOV NP部分片段蛋白。结论1.中间链球菌的基因组模型为开放型,具有一定的从外界获取新基因的能力,从而不断增加其遗传多样性和进化。2.27株中间链球菌的COG分布相似,但核心基因和菌株特异性基因之间存在差异。在基因组大小、G+C含量、原噬菌体序列、CRISPRs、耐药基因和感染类型之间没有发现统计学关联。3.山东省青岛市黄岛区野外地区蜱虫的优势种为长角血蜱。该蜱虫携带新型致病性无形体即山羊无形体,长角血蜱为山羊无形体的传播媒介和自然宿主。山东省青岛市黄岛区野外蜱虫有较高的山羊无形体的阳性率。4.在山东省青岛市黄岛区捕获的鼩鼱MJNV感染率较高,并未发现有啮齿类宿主动物感染MJNV。5.山东省黄岛区捕获的鼩鼱中,SEOV阳性携带率为1.12%,表明我国鼩鼱类动物携带SEOV,进一步证实汉坦病毒存在宿主转化现象。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 孙喜凤
导师: 于学杰,Pierre-Edouard Fournier
关键词: 中间链球菌,基因组学分析,无形体,汉坦病毒,鼩鼱
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学,基础医学
单位: 山东大学
分类号: R378;R373
总页数: 188
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