梁秀芝[1]2007年在《杜氏盐藻六个藻种生化指标的研究以及D.Salina中ACCase Beta亚基的克隆》文中指出本论文通过扩大培养杜氏盐藻藻种进行研究。实验准确的记录了盐藻的生长周期并绘制成生长曲线，六个藻种细胞生长速度差异不大，均在大约140h后进入对数生长期，约210h后进入稳定期，这和其他报道一致。对六种盐藻的生化指标进行研究，结果表明：所研究的6种杜氏盐藻均含大量营养元素，Dunaliella parva油脂含量高达细胞干重的44.30％，Dunaliella salina油脂含量为细胞干重的12.47％。叶绿素的含量在19.7μg／ml到29.2μg／ml之间。同时采用3，5-2硝基水杨酸法测定杜氏盐藻细胞中的多糖含量，在对蛋白质含量的测定上与以往采用了同样的Bradford法，但对样品的处理方式不同，本研究直接以离心收集的湿藻细胞进行，迄今为止还没有这方面的报道。由于盐藻总脂含量较高，结合目前的研究热点：生物柴油，实验首次从D.salina中克隆了乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA Carboxylase，ACCase，EC 6.4.1.2)的Beta亚基。乙酰辅酶A羧化酶属于生物素包含酶(biotincontaining enzyme)的类型Ⅰ(typeⅠ)。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步，是脂肪酸合成的限速酶。乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)具有催化乙酰辅酶A形成丙二酸单酰辅酶A的羧化作用，是在脂肪酸合成和代谢中起重要作用的中间代谢物。ACCase包括不同的形式，被不同的基因编码，本试验选择油脂含量最少，但目前研究的最多的藻种Dunaliella salina进行乙酰辅酶A羧化酶Beta亚基的克隆。根据真核生物NP_045833.1(chloroplast Chlorella vulgaris)、YP_635822.1(chloroplast Oltmannsiellopsis viridis)、YP_636254.1(chloroplast Pseudendoclonium akinetum)以及YP_635920.1(plastid Helicosporidium sp.ex Simulium jonesii)等的ACCβ基因的氨基酸高度保守序列，设计一对简并引物，利用TRIzol试剂提取杜氏盐藻(Dunaliella salina)细胞的总RNA，通过RT-PCR，得到的一段长为400bp左右的cDNA片段，该片段与其他物种的ACCB基因具有很高的相似性。在此基础上进行5’和3’RACE扩增盐藻ACCβ基因的末端，得到全长为1288bp的盐藻ACCβ基因，产物与T载体连接后转化至大肠杆菌Top10中，经筛选后测序，将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析。结果表明在盐藻中所获得的该cDNA片段，核苷酸长度为1288bp，编码349个氨基酸，genebank登录号分别为EF363909，ABO33321.1，推导的氨基酸序列与下列物种的ACCβ基因进行同源性比较：NP_045833.1(chloroplast Chlorella vulgaris)为84％、YP_635822.1(chloroplast Oltmannsiellopsis viridis)为82％、YP_636254.1(chloroplast Pseudendoclonium akinetum)为80％。乙酰辅酶A羧化酶是一多亚基的酶，本实验成功克隆的Beta亚基，对以后的研究奠定了坚实的基础。
张冬鑫[2]2011年在《杜氏盐藻生理生化鉴定及高质量cDNA文库表达序列标签分析》文中研究表明杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种生长于海水等高盐环境中的单细胞真核绿藻,属于杜氏藻科杜氏藻属,无细胞壁结构却能在0.5～5.5 mol/L的高盐环境下生存。杜氏盐藻细胞中富含β-胡萝卜素等大量有价值的生物活性物质,另外在盐胁迫条件下能产生大量的油脂。杜氏盐藻是能进行光合自养的最耐盐的真核生物,并且细胞结构简单,因此成为研究耐盐分子机制最好的模式生物。目前,关于杜氏藻各个藻种的室内培养体系,显微形态结构及细胞生长曲线等方面的研究报道还比较少,这对盐藻的大规模生物技术开发利用和基础理论研究造成很大的障碍。本研究收集到杜氏藻的六个藻种Dunaliella salina,Dunaliella parva,Dunaliella primolecta,Dunaliella bardawil,Dunaliella tertiolecta及Dunaliella sp. ,建立和完善了该六种盐藻的培养体系。在实现室内成功养殖的基础上,利用倒置显微镜进行显微形态观察,发现六个藻种细胞都为单细胞绿藻,形状呈现圆形,椭圆形和纺锤形,细胞里面都有大型杯状叶绿体,细胞顶端都生出两条等长的鞭毛,不同藻种细胞的大小各异,其中Dunaliella salina的细胞体积最大。然后,选取其中叁种杜氏藻Dunaliella parva, Dunaliella primolecta和Dunaliella Salina,分别测定其在0.75M, 1.5M, 3M和4M盐浓度条件下的生长曲线,结果表明随着盐浓度的升高,叁种藻的生长状态依次变弱,叁种藻都在大约10天左右进入对数生长期,50天左右进入平台期,对该叁种藻在1.5M盐浓度条件下的生长曲线比较后发现parva的长势最好, primolecta次之, salina最差。现在杜氏盐藻的基因组测序计划尚未完成,在NCBI的Genbank数据库中关于盐藻的核苷酸序列及表达序列标签(ESTs, Expressed Sequence Tags)信息也十分有限。因此,为了全面开展杜氏盐藻的功能基因组学研究,更清楚地了解其耐盐的基本分子机制,需要构建一个具有代表性的高质量cDNA文库,并进行大规模的EST分析。我们在研究中采用Clontech公司的SMART?技术及其cDNA文库构建试剂盒,成功构建了1.5 mol/L NaCl盐胁迫条件下的杜氏盐藻cDNA噬粒文库。文库质量鉴定的结果均表明我们所构建的cDNA文库符合高质量全长cDNA文库标准。为了获取功能基因和耐盐机理方面的重要信息,本文鉴定了487个质量较好的ESTs,发现295个EST序列(61%)与已知杜氏盐藻ESTs或已知基因和蛋白序列有高度同源性,而高达192个ESTs(39%)未见与已知序列有任何相似性,代表盐藻细胞中大量未鉴定的新基因。大约21%的ESTs(功能注释ESTs的44%)编码与蛋白质合成和加工功能有关的蛋白(主要是蛋白质合成装置的成分核糖体蛋白),表明核糖体蛋白在盐藻细胞生命过程和耐盐调节中的重要作用。ESTs分析中除发现了大量与杜氏盐藻的蛋白质合成和加工功能有关的ESTs外,还发现了许多编码能量代谢与光合作用(功能注释ESTs的21.2%)以及初级代谢(功能注释ESTs的5.5%)功能相关的ESTs。此外,也发现了一些与细胞转运,细胞信号和细胞周期,细胞结构组分以及细胞抗逆性等功能有关的ESTs。同时将该研究中得到的ESTs与莱茵衣藻,团藻进行功能基因组学对比,发现其中245个ESTs与两者的已知功能序列具有同源性,提示其余ESTs很可能代表耐盐相关的特异性新基因。最后对这些ESTs所进行的简单全长分析还得到几个未在杜氏盐藻中报道过基因的全长编码序列。
侯桂琴[3]2004年在《杜氏盐藻（Dunaliella salina）叶绿体atpA片段的克隆及杂交分析》文中提出近些年来，人们在转基因植物方面进行了大量的研究。与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比，转基因植物不需要昂贵的设备和严格的培养条件，具有光合自养、成本较低，植物病毒不感染人类等优点，已成为一类比较廉价和安全的生物反应器。然而高等植物培养周期过长，生长受季节性限制，许多研究兴趣集中到生长迅速，培养简单的单细胞绿藻上。近几年来，莱茵衣藻的遗传背景已逐步研究清楚，有多种外源性蛋白质在衣藻中表达成功。遗憾的是，与衣藻比较，更具有优点的盐藻作为生物反应器的研究至今国内外尚缺乏。盐藻属绿藻门团藻目，是一种原生质裸露的嗜盐性浮游单细胞真核藻，长约6～15μm，呈椭圆形或梨形，无细胞壁只有细胞膜，且有双鞭毛，能在水中游动。有一个大型杯状叶绿体约占细胞体积的48％左右，可以进行光和自养，叶绿体的基部有一个淀粉核。盐藻是一种没有细胞壁的单细胞真核藻类，也是真核植物中抗逆性最强的一种藻类。该藻的突出优点在于培养条件极其简单，光合自养，抗盐性极佳，可在0.05-5M的盐水中生长，最佳生长繁殖盐度为2-3M。其强大的渗透调节能力，被认为可能是耐盐机理研究的模式植物。同时它又是单细胞光合自养生物，适于研究光合作用机理。 以细胞核为外源基因受体的传统植物基因工程虽已发展趋于成熟并得到广泛应用，但由于细胞核基因组大，背景复杂，外源基因的整合位点和整合的拷贝数难以人为控制，造成外源基因表达效率低，容易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象；同时转入多个基因时操作步骤过于复杂，所表达的原核基因必须经过修饰改造，环境郑州大学2以吟年硕士学位论文杜氏盐藻(D“nal曰lasa如“)叶绿体atPA基因片段的克隆分析及杂交安全难以保证等。叶绿体转化系统的出现为克服这些困难带来了希望。与核基因转化系统相比，叶绿体基因组小，遗传操作简单，外源基因是通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组。这样有利于人为控制外源基因的插入位点，可以将目的基因定位在适于表达的位点，能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等类的基因沉默问题。由 于叶绿体中DNA分子有多个拷贝，同时叶绿体对表达产物的积累有较强的承受能力，保障了外源基因在叶绿体中的高效表达。另外，由于叶绿体基因组的原核性质，对来自原核生物的外源基因无需改造就可以在叶绿体中高效表达，而且可以将多个外源基因采取“多顺反子”的原核表达形式同时弓!入，并由共同的启动子控制，既方便操作又可避免由于存在多个相同的启动子所带来的“共沉默”。这是核基因转化无法做到的。 要建立杜氏盐藻叶绿体转化体系，最关键的是构建一个稳定的叶绿体表达载体。因此选择理想的启动子是至关重要的。研究表明，在莱因衣藻中atPA基因(编码叶绿体ATP合成酶u亚基)簇(包括 atpA，psbl，CemA和atpH四个基因)共用一个启动子，这个强启动子位于。tpA基因的仁游，它可以榨为叶绿体载体表达系统的必要元件。本研究室曾采用莱因衣藻叶绿体atpA基因启动子作为盐藻叶绿体转化系统的启动子，虽然也有转录起始活性，但表达效率不高。若能把盐藻叶绿体自身的atPA基因强启动子克隆出来并用于其叶绿体表达载体无疑是最理想的。故本研究根据近缘藻类atpA基因的氨基酸高度保守序列，设计简并引物，用PCR方法扩增得到了盐藻叶绿体atpA部分核昔酸序列(GenBank ACceSSion AY435096)，旨在为下一步启动子的克隆和盐藻高效叶绿体表达载体的构建打下基础。同时还通过设计简并引物，用PCR方法直接从叶绿体基因组中克隆了atpA基因片段，这为从叶绿体中克隆某些基因提供了一种快速而简便的途径。 方法 从GenBank卜搜索五种藻类莱因衣藻(ch/二厂成咖，nas二盯助a刀t，’l’)、普通小球藻(乙为了。厂。11a。u1朋r1’s)、肠sost，’那失2叮厂j陇】、卵形肾藻(从岁为二s曰。1’Lvo1，’二cea)和〔F叔nfdl’osc汽口on、rojae叶绿体的atpA全基因所编码的氨基酸序列进行比对，找出两段比较保守的序列，设计简并引物，以提取的CtDNA为模板，用PC尺方法扩增atPA基因片段。并把其与pMD一18T一veCt()r(全长2.69kb)载体连接进行体外重组和转郑州大学20汉年硕士学位论文杜氏盐藻(D期。肠llasa枷。)叶绿体at衅基因片段的克隆分析及杂交化，用含Amp、X一gal和工PTG的LB平板筛选，挑取阳性菌落提质粒，后用EcoRI和HindIH进行双酶切鉴定，将含有插入片段的重组质粒送上海基康公司测序，序列结果与GenBank七其他藻类的atPA基因片段进行分析较。最后利用克隆的片段为探针分别与盐藻叶绿体基因组和核基因组进行southern杂交，证实其是否来自盐藻叶绿体，为下一步启动子的定位打下基础。 结果 1.pcR扩增产物 经PCR扩增后，电泳检测在约4oobp处有一明显亮带，与预期扩增的片段大小一致。 2.盐藻叶绿体atpA基因的克隆及重组质粒的鉴定 将PCR扩增后获得的片段经琼脂糖凝胶回收后与PMD一18T一vector相连进行体外重组和转化，用含Amp、X一gal和IPTG的LB平板筛选，挑取14个阳性菌落进行快速DNA鉴定，用Ec0RI和Hin
潘卫东[4]2003年在《杜氏盐藻（Dunaliella salina）叶绿体转化研究》文中进行了进一步梳理近些年来，人们在转基因植物方面进行了大量的研究。与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比，转基因植物不需要昂贵的设备和严格的培养条件，具有光合自养、成本较低，植物病毒不感染人类等优点，已成为一类比较廉价和安全的生物反应器。然而高等植物培养周期过长，生长受季节性限制，因此许多研究兴趣集中到生长迅速，培养易的单细胞绿藻上。 杜氏盐藻属绿藻门绿藻纲团藻目，除缺乏细胞壁外，其形态和结构特征与衣藻十分相似，是一种原生质裸露的嗜盐性浮游单细胞藻，长约6-15μm，呈椭圆形或梨形，有双鞭毛，能在水中游动。有一个大型杯状叶绿体约占细胞体积的48％左右。该藻的突出优点在于抗逆性极佳，可在0.05M-5M的盐水中生长，最佳生长繁殖盐度为2-3M，是目前已知最耐盐的真核生物。由于杜氏盐藻可在高渗盐溶液中生长，这是许多其它生物难以生存的环境，故其大规模培养不需昂贵的发酵罐或其他培养装置，可以直接采用开放式培养，大大降低生产成本。因此，杜氏盐藻是生产药用蛋白的良好宿主。 植物的细胞核转化技术已发展成熟并得到广泛应用，但核基因组的遗传转化仍存在一系列至今尚未解决的问题：例如由于核基因组大，背景复杂，外源基因的整合位点和整合的拷贝数难以人为控制，造成郑州大学2003年博士学位论文杜氏盐藻(Dunaliella salina)叶绿体转化研究外源基因表达效率低，容易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象;同时转入多个基因时操作步骤过于复杂，所表达的原核基因必须经过修饰改造，环境安全难以保证等。 叶绿体转化系统的出现为克服这些困难带来了希望。与核转化相比，叶绿体基因组小，遗传操作简单，外源基因是通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组。定点整合有利于人为控制外源基因的插入位点，可以将目的基因定位在适于表达的位点，能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等类的基因沉默问题。由于叶绿体中DNA分子有多个拷贝，同时叶绿体对表达产物的积累有较强的承受能力，保障了外源基因在叶绿体中的高效表达。另外，由于叶绿体基因组的原核性质，对来自原核生物的外源基因无需改造就可以在叶绿体内高效表达，而且可以将多个外源基因采取“多顺反子”的原核表达形式同时引入，并由共同的启动子控制，既方便操作又可避免由于存在多个相同启动子所带来的“共沉默”。这是核基因转化无法做到的。 为建立杜氏盐藻叶绿体转化体系，我们研究了杜氏盐藻对7种基因工程研究中常用的抗生素及除草剂的敏感性;利用绿色荧光蛋白(E血anced盯een nuoreseent protein，EJP)为报告基因，验证了莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性，并构建载体转化盐藻，初步建立了杜氏盐藻叶绿体转化体系，为今后转基因盐藻生物反应器的建立和应用打下基础。 方法: 根据杜氏盐藻的近缘藻类的叶绿体基因组序列资料，在基因编码区的高度保守区域设计引物，克隆了杜氏盐藻叶绿体165识NA基因、咖L基因和ch】N基因，并分别以165识NA基因和chlN基因序列为同源片段，以CAT和bar基因为筛选标记基因构建了叁套杜氏盐藻叶绿体转化载体: 2郑州大学2003年博士学位论文杜氏盐藻(D~Iiella salina)叶绿体转化研究pDS 165一eAf、pTN1269一bar和psp72一5一bar一3，用基因枪法转化杜氏盐藻，初步建立起杜氏盐藻叶绿体转化体系。 结果: 1.研究了杜氏盐藻对氯霉素、新霉素、链霉素、卡那霉素、G4 18、壮观霉素和除草剂草丁嶙(P hosphinotricin，PPT)等7种基因工程研究中常用的抗生素及除草剂的敏感性。实验结果表明，杜氏盐藻对卡那霉素、新霉素、G418和链霉素极不敏感，当这些抗生素用量高达600p创ml时，仍不能抑制杜氏盐藻的生长;壮观霉素对杜氏盐藻的生长有一定抑制作用，但用量较高，浓度为200、岁ml以上才能明显抑制杜氏盐藻的生长，并且即使用量高达600p留ml时仍不能完全杀死杜氏盐藻;杜氏盐藻对氯霉素敏感，50协留ml的氯霉素即可明显抑制杜氏盐藻的生长;100协留ml的氯霉素可杀死杜氏盐藻，200协留ml以上的氯霉素经10天左右即可杀死杜氏盐藻。此外，杜氏盐藻对除草剂草丁磷高度敏感，当培养液中草丁嶙浓度为1协留ml时，杜氏盐藻的生长就受到明显的抑制;草丁嶙浓度达到4协留ml时，培养3至5天即可明显观察到杜氏盐藻细胞的白化和死亡。 2.莱茵衣藻叶绿体吻A启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性 我们选取绿色荧光蛋白为报告基因，将报告基因插入殉A启动子与rbcL终止子之间，构建了质粒pSP71一atPA一EGFP，通过基因枪法转入杜氏盐藻，在荧光显微镜下观察到EGFP基因在杜氏盐藻叶绿体中得到了表达。 3.杜氏盐藻叶绿体165出NA基因的克隆和转化载体的构建 根据杜氏盐藻的近缘藻类的叶绿体基因组序列资料，克隆了杜氏盐藻叶绿体16SrRNA基因部分序列1100bp，并利用克隆的16SrRNA郑州大学2003年博士学位论文
张鑫鑫[5]2014年在《杜氏盐藻（Dunaliella salina）对UV-B辐射增强的响应及基于活性氧和钙离子信号通路变化的作用机制探讨》文中认为臭氧层变薄导致更多的UV-B辐射到达地面，从而给海洋生态系统带来显着的生态学和生物学效应。微藻是较为古老的物种，在整个进化过程中，其周围环境中的UV-B辐射不断增强；作为初级生产者和食物链的基础，海洋微藻是海洋生态系统的重要组成部分，逐渐增强的UV-B辐射对其的影响将通过食物链传递到其他营养级，并对整个海洋生态系统造成显着影响；此外海洋微藻在调节全球气候变化中也发挥着重要的作用。研究海洋微藻对UV-B辐射增强的响应变化对揭示海洋微藻进化的本质、规律及其适应机制具有重要的理论意义。本研究以海洋模式微藻—杜氏盐藻（Dunaliella salina）为实验对象，以UV-B辐射增强为胁迫因子，从最基础的生长、细胞结构、生理、生化等层面阐明杜氏盐藻对短期UV-B辐射增强的响应特征，并基于活性氧信号通路和钙离子信号通路探讨响应机制和机理；同时基于Fluctuation analysis进化模型，从进化和遗传角度探讨微藻对长期UV-B辐射增强的适应性。研究结果将进一步完善UV-B辐射对水生浮游微藻的影响及机理研究，为评估生物在UV-B辐射不断增强环境中的生存提供有关适应机制和保护进化的理论依据。结果如下：1.杜氏盐藻对短期、适量的UV-B辐射增强的响应（1）UV-B辐射增强能够抑制杜氏盐藻微藻种群密度的增加，UV-B辐射剂量组的日生长速率（DGRs）均极显着低于对照组，停止生长的时间提前；但UV-B辐射能够诱导细胞干重和细胞内可溶性蛋白含量的上升，并具有显着的剂量-效应关系；（2）利用倒置显微镜和透射电子显微镜技术发现，在UV-B辐射增强条件下，杜氏盐藻细胞体积增大，细胞形状由椭圆形变为圆形；细胞核周围的空泡逐渐增多，原生质膜发生裂解，细胞核结构遭到破坏，淀粉鞘松散，叶绿体片层结构发生断裂或缺失，越来越多的油脂小球出现，其中叶绿体和细胞核等结构是主要的靶位点；（3）通过光合色素测定、叶绿素荧光技术以及1，5-二磷酸核酮糖羧化酶活性变化发现杜氏盐藻的光合生理受到UV-B辐射增强的影响：UV-B辐射增强影响光合色素含量和光合色素之间的比值，降低杜氏盐藻的光合效率及强光下的光能利用效率，改变微藻对过量光能的分配特征，但增强其在强光下的耐受能力和固碳能力。UV-B辐射降低杜氏盐藻对硝酸盐的吸收速率、提高其对磷酸盐的吸收速率，改变与营养盐代谢相关的酶活，诱导细胞内甘油含量的升高，从而干扰渗透压平衡。研究结果表明，UV-B辐射影响了杜氏盐藻的生长、细胞结构、光合生理、营养盐吸收与代谢以及渗透压平衡，但杜氏盐藻对UV-B辐射增强是一个损伤与防御之间的动态过程。2.基于信号氧和钙离子信号通路探讨UV-B辐射对短期的、适量的UV-B辐射的响应机制（1）UV-B辐射可以诱导杜氏盐藻发生膜脂过氧化反应，造成氧化损伤；SOD、GPx、GR、GST和CAT等抗氧化酶活性以及GSH/GSSG、AsA/DHA等抗氧化剂含量均发生了变化；可以推断活性氧信号通路系统在杜氏盐藻对短期的、适量的UV-B辐射响应过程中发挥了一定的作用。（2）UV-B辐射可以诱导杜氏盐藻质膜上的钙泵活性发生变化，因此可以推断：钙离子信号通路系统参与了UV-B辐射对杜氏盐藻的影响过程；（3）在杜氏盐藻对UV-B辐射响应过程中，外加钙离子效应剂CaCl2和LaCl3对抗氧化酶活性无影响；加入胞内钙离子抑制剂BAPTA显着抑制了酶的活性（P<0.05）；加入活性氧抑制剂NAC后，钙泵活性显着降低（P<0.05），可以推测在UV-B辐射条件下，钙离子参与了杜氏盐藻的氧化应激反应，且游离钙离子并非通过质膜钙离子通道进入细胞，而是来源于胞内钙库；活性氧参与钙离子信号通路的作用过程。因此活性氧和钙离子信号通路之间具有交联关系，并且可能通过谷胱甘肽的循环和代谢偶联在一起。3.杜氏盐藻对长期的、致死剂量的UV-B辐射的响应（1）基于进化模型（Fluctuation analysis）研究杜氏盐藻对长期的、致死剂量的UV-B辐射的响应发现，微藻种群内由于敏感细胞的存在而发生大规模细胞死亡的现象，后因抗UV-B辐射细胞的出现促使种群重新生长和繁殖；（2）分析不同处理组之间的发现，抗性细胞来源于自然种群在进化过程中偶然地、随机地产生的突变，因此可以推断在进化过程，因偶然的、随机的突变产生的抗UV-B辐射细胞的存在保证了杜氏盐藻这一物种在UV-B辐射增强环境中的生存和繁殖。
高慧玲, 刘宝玲, 高宇, 张飞, 薛金爱[6]2019年在《杜氏盐藻DsKASⅢ基因的分离鉴定及其在氮胁迫下的表达分析》文中研究说明分离鉴定杜氏盐藻(Dunaliella salina)β-酮脂酰-ACP合酶Ⅲ(β-ketoacyl-ACP synthase Ⅲ,DsKASⅢ)基因并解析其编码蛋白理化特征及功能。依据同源克隆,分离杜氏盐藻DsKASⅢ基因编码序列,采用生物信息学方法解析DsKASⅢ编码蛋白的理化特性及功能,qRT-PCR检测缺氮条件下DsKASⅢ的表达谱,并检测细胞总油脂和β-胡萝卜素含量的变化。结果表明,杜氏盐藻KASⅢ基因含有9个外显子,ORF为960 bp,编码蛋白为319 aa。DsKASⅢ蛋白理论等电点pI为6.21,分子量为33.3 kD。亚细胞定位预测DsKASⅢ蛋白呈镶嵌状锚定在叶绿体内膜上,这种构象有助于利用能量高效率催化生化反应。DsKASⅢ蛋白二级结构主要由α-螺旋(35.11%)、β片层(25.71%)和无规则卷曲(27.90%)组成。叁维模拟显示,DsKASⅢ蛋白以同源二聚体形式发挥催化功能的。系统发育分析表明,DsKASⅢ蛋白与莱茵衣藻KASⅢ蛋白亲缘关系最近,暗示其可能有共同的进化来源。qRT-PCR分析揭示,氮胁迫培养条件下,DsKASⅢ基因的表达显着升高,且在缺氮第3天时,表达量达峰值,比正常氮充足培养高1.1倍。氮胁迫培养的藻细胞总脂含量和β-胡萝卜素含量分别比正常氮充足培养的藻细胞提高49.05%和33.20%。氮胁迫能诱导DsKASⅢ基因的上调表达,进而促进杜氏盐藻细胞合成和积累高量油脂和β-胡萝卜素。研究为全面阐明氮胁迫条件下杜氏盐藻油脂及β-胡萝卜素合成及调控机制提供了科学依据。
周丽[7]2006年在《Ca～（2+）在杜氏盐藻（Dunaliella salina）渗透胁迫反应过程中的作用研究》文中研究指明Ca~(2+)作为植物细胞中的第二信使,广泛参与植物体内的生理生化反应,其在陆生动植物细胞对逆境胁迫反应中作用的研究报道较多,而在低等海洋生物中的研究较少。本论文以杜氏盐藻(Dunaliella salina)为材料,采用生理测定方法和细胞定位技术,在0.6、0.8、2、3和4 mol/L NaCl 5种浓度以及外源Ca~(2+)、EGTA和La~(3+)分别处理的条件下,对盐藻的生长、细胞内甘油含量、甘油代谢相关酶的活性和疏松结合态Ca~(2+)的分布进行了研究。盐藻在2 mol/L NaCl条件下生长良好,3、4 mol/L NaCl高渗胁迫初期其生长受到抑制,且与渗透胁迫强度成正相关;高渗胁迫条件下盐藻细胞内甘油的含量迅速增加,3-磷酸甘油磷酸酶(GPase)的活性和二羟丙酮还原酶(DHA-RD)催化二羟丙酮转化为甘油的活性明显提高。外源Ca~(2+)处理在一定程度上可提高高渗胁迫条件下GPase和DHA-RD催化甘油合成活性,增加盐藻细胞内甘油含量,减缓高渗胁迫引起的盐藻生长初期的延滞,并与渗透胁迫强度成负相关,但外源Ca~(2+)处理引起盐藻细胞的过早衰退,说明Ca~(2+)具有双重作用。外源EGTA和La~(3+)分别处理,均在一定范围内降低高渗胁迫条件下GPase和DHA-RD催化甘油合成的活性的升高,减弱细胞内甘油含量的增加,抑制盐藻生长,且与渗透胁迫强度成正相关。上述结果表明外源Ca~(2+)内流参与盐藻对高渗胁迫反应过程。低渗(0.6、0.8 mol/L NaCl)胁迫条件下,盐藻生长初期均出现延滞现象,且延滞期与胁迫强度成正相关;低渗胁迫条件下盐藻细胞内甘油的含量迅速降低,
李克锦[8]2007年在《杜氏盐藻外源基因转化系统的建立》文中研究表明本文以杜氏盐藻(Dunaliella salina)为研究对象，建立了杜氏盐藻外源基因的转化系统，为下一步杜氏盐藻转化植酸酶基因的研究奠定了基础。本文主要的研究内容及结果如下：本文从盐藻培养液中分离到5种菌，选择了卡那霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素、氯霉素、链霉素、新霉素7种常用的抗生素对其进行敏感性实验，筛选出链霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素，氯霉素5种菌较敏感的抗生素，并通过实验得出这几种抗生素之间的作用是累加的。考察了不同浓度的链霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素，氯霉素对盐藻生长状况的影响，结果表明氯霉素对盐藻的生长有很大的抑制作用，盐藻对于氯霉素最为敏感，而其它4种抗生素浓度达到1600μg／mL，培养10天时，藻的生长状态仍较好；选用链霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素进行联合除菌，结果显示当每种抗生素的浓度均为800μg／mL、处理3次后，用平板法分离纯化盐藻可得到无菌的盐藻。选择了氯霉素、G418、潮霉素3种抗生素做盐藻基因工程选择标记实验。结果表明氯霉素可以作为盐藻基因工程的筛选抗生素，CAT基因为其阳性筛选标记基因，固体培养基筛选浓度为80μg／mL。优化了无菌盐藻的培养条件。对C、N、P叁种大量元素和维生素进行了优化。在单因素实验的基础上做了四因素叁水平正交实验，得到优化组合为NaNO_3和NaH_2PO_4为f／2培养基的10倍、NaHCO_30.4g/L、V_(B1)100μg／L、V_(B12)1.0μg/L，其他营养盐按f／2培养基添加。利用电击法将GFP基因转入到无菌杜氏盐藻细胞中，研究了电击转化条件、藻的生长状态对转化率的影响，结果得出培养7天的盐藻细胞在3KV的脉冲电压、3ms的脉冲时间下可获得较高的转化率，为转化的最优条件。
侯桂琴, 刘红涛, 潘卫东, 薛乐勋, 姜东亚[9]2006年在《杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段的克隆及序列分析》文中研究指明根据莱因衣藻、卵形肾藻、普通小球藻等10种藻类的atpA全基因氨基酸高度保守序列,设计简并引物,利用PCR方法从盐藻叶绿体DNA中扩增出约400bp的片段,将该片段连接到T-vector上进行序列测定。结果表明,核苷酸长度为405bp,编码135个氨基酸。推导的氨基酸序列与莱因衣藻的同源性为92%,普通小球藻88%,Mesostigmaviride87%,卵形肾藻86%,Cyanidioschyzonmerolae85%。以所克隆的DNA片段为探针,与盐藻叶绿体基因组进行SouthernBlot杂交结果有明显的杂交信号。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段。该基因序列已被GenBank收录,接受号为AY435096。
王俊[10]2012年在《杜氏盐藻、青岛大扁藻对营养盐变化的生理生态学响应机制》文中研究指明杜氏盐藻（Dunaliella salina）属绿藻门（Chlorophyta）、绿藻纲（Chlorophyceae）、团藻目（Volvocales）、盐藻科（Dunaliellaceae）、盐藻属（Dunaliella）。青岛大扁藻(Platymonas subcordiformis.(wille)Hazen)在分类学上属绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、团藻目(Volvocales)、衣藻科(Chlamydomonadaceae)、扁藻属(Platymonas)。这2株微藻是重要的饵料和经济微藻，具有较好的研究和开发利用价值。本文主要通过考察不同N浓度、P浓度、N:P、盐度、温度、光照强度和培养液pH下杜氏盐藻和青岛大扁藻细胞密度、生长速率及对数生长期末细胞内叶绿素a、可溶性多糖、可溶性蛋白含量的变化，以期为进一步探讨杜氏盐藻和青岛大扁藻高密度培养时的优化营养条件提供实验理论与依据。研究结果如下：（1）在一定氮浓度范围内提高氮浓度，有利于杜氏盐藻和青岛大扁藻生物量的增加；2株微藻的叶绿素a含量与氮浓度正相关，藻体稳定期细胞密度越大，叶绿素a含量越高；2株微藻胞内、胞外可溶性多糖积累量均在N浓度为1.2g/L最大；2株藻细胞内可溶性蛋白含量随N浓度增加而增加；SOD活性随着N浓度的增加先降低再升高。（2）低磷条件，有利于杜氏盐藻和青岛大扁藻生物量的提高。杜氏盐藻的最适P浓度为0.025g/L，青岛大扁藻的最适P浓度为0.03g/L；2株微藻的叶绿素a含量与P浓度正相关；2株微藻胞内、胞外可溶性多糖积累量均在P浓度为0.015g/L最大；2株藻细胞内可溶性蛋白含量随P浓度增加先增加再降低；无P组SOD活性最高，SOD活性随着N浓度的增加先降低再升高。（3）通过实验数据，杜氏盐藻生长的适宜N:P约为16:1，青岛大扁藻约为80:1；2株微藻的叶绿素a含量与N:P正相关，藻体稳定期细胞密度越大，叶绿素a含量越高；2株微藻胞内、胞外可溶性多糖积累量均在N:P为160:1最大，多糖的积累量随N:P的增加而增加；杜氏盐藻和青岛大扁藻在不同N:P下生长稳定期的蛋白质含量从高到低的变化规律为：160:1>80:1>16:1>4:1>1:1；SOD活性随N:P浓度的增大先减小后升高。（4）低盐度有利于提高杜氏盐藻和青岛大扁藻的生长速率并延长对数生长期，培养液盐度为30-40时生长稳定期得到最大细胞密度，并且能叶绿素a含量越高；盐度为30时，杜氏盐藻细胞可溶性多糖的含量最大；盐度为40时，青岛大扁藻可溶性多糖的含量最大；盐度为40时，杜氏盐藻细胞可溶性蛋白的含量最大；盐度为30时，青岛大扁藻可溶性蛋白含量最大；SOD的活性随盐度升高先升高后降低。（5）当温度为25℃时，杜氏盐藻和青岛大扁藻终培养密度值最高；杜氏盐藻在温度为30℃时叶绿素a含量最高，青岛大扁藻在盐度为25℃时叶绿素a含量最高；温度为30℃时，杜氏盐藻可溶性多糖的含量最大，温度为25℃时，青岛大扁藻细胞可溶性多糖的含量最大；温度为30℃时，杜氏盐藻可溶性蛋白的含量最大，温度为25℃时，青岛大扁藻可溶性蛋白的含量最大，但随着温度增加藻体蛋白减少；随着温度的升高SOD活性先升高后降低。（6）不同光照强度梯度杜氏盐藻终培养密度值由高到低为：4000lx＞3000lx＞5000lx＞6000lx＞2000lx＞1000lx＞7000lx，不同光照强度下青岛大扁藻生长稳定期的细胞密度依次为：5000lx>3000lx>7000lx>9000lx>11000lx>1000lx；杜氏盐藻在光照强度为5000lx时叶绿素a含量最高，青岛大扁藻在光照强度为9000lx时叶绿素a含量最高，随着光照强度的增高，叶绿素a含量增加，光照强度继续增加，叶绿素a含量反而降低；光照强度为4000lx时，杜氏盐藻藻细胞可溶性多糖的含量最大，光照强度为7000lx时，青岛大扁藻可溶性多糖的含量最大；光照强度为4000lx时，杜氏盐藻可溶性蛋白的含量最大，光照强度为7000lx时，青岛大扁藻可溶性蛋白的含量最大，但随着光照强度继续增加藻体蛋白减少；随着光照强度的增强，杜氏盐藻SOD的活性先增强再减弱；随着光照强度的增强，青岛大扁藻SOD的活性增大。（7）不同培养液pH杜氏盐藻终培养密度值由高到低为：7＞8＞9＞6＞11＞10＞5；不同培养液pH下青岛大扁藻生长稳定期的细胞密度依次为：8>7>6>9>10>5；杜氏盐藻和青岛大扁藻都在pH为7时叶绿素a含量最高，随着pH的增高，叶绿素a含量先增加后减少；随着pH的增大，杜氏盐藻和青岛大扁藻藻细胞可溶性多糖的含量先增加后减少；随着pH的增大，藻细胞可溶性蛋白的含量先增大再减小；随着pH的增大，SOD活性先减弱后增强再减弱。
参考文献：
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[3]. 杜氏盐藻（Dunaliella salina）叶绿体atpA片段的克隆及杂交分析[D]. 侯桂琴. 郑州大学. 2004
[4]. 杜氏盐藻（Dunaliella salina）叶绿体转化研究[D]. 潘卫东. 郑州大学. 2003
[5]. 杜氏盐藻（Dunaliella salina）对UV-B辐射增强的响应及基于活性氧和钙离子信号通路变化的作用机制探讨[D]. 张鑫鑫. 中国海洋大学. 2014
[6]. 杜氏盐藻DsKASⅢ基因的分离鉴定及其在氮胁迫下的表达分析[J]. 高慧玲, 刘宝玲, 高宇, 张飞, 薛金爱. 生物技术通报. 2019
[7]. Ca～（2+）在杜氏盐藻（Dunaliella salina）渗透胁迫反应过程中的作用研究[D]. 周丽. 中国海洋大学. 2006
[8]. 杜氏盐藻外源基因转化系统的建立[D]. 李克锦. 大连理工大学. 2007
[9]. 杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段的克隆及序列分析[J]. 侯桂琴, 刘红涛, 潘卫东, 薛乐勋, 姜东亚. 广西植物. 2006
[10]. 杜氏盐藻、青岛大扁藻对营养盐变化的生理生态学响应机制[D]. 王俊. 浙江海洋学院. 2012