张枫[1]2003年在《电离辐射诱导细胞周期检查点蛋白p27～（Kip1）表达及其调控机制研究》文中研究指明细胞周期进程决定于称之为调节亚基的周期素(cyclins)和称之为催化亚基的周期素依赖的蛋白激酶(CDKs)的结合与相互作用，同时也受到细胞周期的负调控因子—CDKs的抑制因子CDIs家族成员的调控。CDIs包括CIP／KIP(p27~(kip1)、p21~(Cip1)及p57~(Kip2))和INK4(p15、p16、p18、p19)两个家族。在细胞周期进程中，调控G1期进程和G_1→S期相转换的分子事件主要涉及：周期素蛋白—cyclin D和cyclin E的表达，分别与搭配分子—CDK4／CDK6；CDK2激酶结合形成：cyclin D-CDK4／CDK6和cyclin E／CDK2复合物，cyclin D-CDK4／CDK6主要在G1中期和后期发挥作用，而cyclin E／CDK2活性主要在G_1→S期行使功能，cyclin E是G_1→S转换中主要的限速因子之一。而外源性或内源性损伤信号，直接对G1、G2期进行负调控的，主要是具有多种重要生物学功能的CDKs抑制因子—p27~(kip1)、p21~(WAF／cip1)蛋白家族分子。p21~(WAF／cip1)和p27~(kip1)能与cyclin D-CDK4／CDK6和cyclin E／CDK2复合物结合，参与细胞周期G1期检查点的调控。 真核细胞在长期进化中形成了一套在细胞周期中保证基因组DNA得以忠实复制，染色体质量得以精确分配的检查机制，通常被称为细胞周期检查点。其中，发生在G1／S和G2／M期的DNA damage checkpoint的调控对于细胞命运的抉择具有重要意义!这是因为细胞在受到诸如电离辐射等基因毒应激损伤时，细胞最先作出的细胞学反应：一，起始DNA damage checkpoint使细胞周期阻滞(arrest)在G1期，赢得时间识别与修复损伤，避免损伤的DNA进行错误的复制，或／和阻滞在G2期，避免缺陷的染色体进一步分裂；二，损伤严重而修复无望启动细胞死亡程序，清除那些带有病变倾向的细胞危害机体。 p27~(Kip1)是一种广谱的CDKs抑制因子，在静止的细胞和G1期细胞，它能抑制cvclin D-CDK4／CDK6和cyclin E／CDK2的活性。p27~(Kip1)水平升高时形成p27~(Kip1)-cyclin E／CDK2复合体，直接并完全抑制cyclin E／CDK2复合物的酶活性，与p15协同使细胞周期阻滞在G1晚期。然而，在不同条件下，p27~(Kip1)参与周期调控的机制也不相同，例如：TGF-β处理的细胞，p27~(Kip1)以对cyclin E／CDK2结合为主。另博士论弈_......一一一一一一一一一一一一一立左鱼制也不相同，例如:TGF一p处理的细胞，p27Kip，以对eyelin EzeD心结合为主。另一方面，p27KIP’的活性水平及功能作用，因细胞类型不同而各异，又受多种因素的影响，如一些有丝分裂原cAMP、雷帕霉素可以上调p27Kip，的表达，而IL一2等则与p27Ki”‘的表达下降有关，受电离辐射(IR)照射的成纤维细胞瘤及用1，25一二经基D3处理的HeLa细胞系在Gl期均有游离的p27脚‘的积累，细胞周期阻滞在Gl期;而在痣癌伽BccS)细胞中，Y一射线能诱导p27吻‘表达水平的显着下调，细胞周期阻滞在G2舰期。Craig等人的大量研究进一步揭示p27Ki”，还参与细胞增殖、分化和凋亡等重要细胞活动。然而最重要的是，在DNA损伤反应中，P2尹”’的表达水平是它能否发挥其检查点蛋白功能的关键。 在本论文中，我们主要进行了以下叁个方面的研究:一不同剂量电离辐射(!R)对细胞周期G1/S检查点的影响 cycnn E/CDKZ激酶活性在ZGy照射后lh略有下降，3h略有回升，12h活性达到最大;10Gy照射后其活性从lh开始增加，12h活性达到最大。 cyclinE蛋白表达水平在ZGy照射后略有增加，1 OGy照射后lh开始增加，持续到24h，但IR后cdkZ蛋白水平未发生变化，通过免疫共沉淀检测了10Gy照射后edkZ与cydinE结合，发现随着照射时间的延长，cyclinE与cdkZ结合量增多，这说明cyclinE蛋白水平的增加能反映cyclin E/CDKZ的激酶活性。 eyClinE/enKZ的负调控因子p27K，p’蛋白表达水平在Zoy照射后lh略有增加，6一9h开始下降;10Gy照射后3h开始下降，持续到24h，可见，随着IR剂量的加大和处理时间的延长，p27KIP‘蛋白表达水平下降的程度加大。1 OGy照射后cyclinE/cDKZ复合物中p27KIPI蛋白结合量减少，这表明IR诱导p27Ki”，蛋白表达水平的下降，进而失去对cyclin E/CDKZ的抑制活性。 与p27Ki”，表达水平不同，pZI蛋白表达水平在ZGy照射后略有增加，6一gh略有下降，在照后24h达到最大;10Gy照后1一3h开始增加，持续到24h，并且cyclin E/CDKZ复合物中pZI蛋白结合增多，但cyclin E/CDKZ激酶活性并未受到抑制，除了因IR诱导cydinE蛋白表达水平增加外，另一重要的原因就是与pZI同一家族的p27KIP，蛋白表达水平下降，失去了对cyclin E/cDKZ的抑制活性。表明:p27Ki”‘是更主要的调控cyclinE/cDKZ激酶活性的周期检查点调控蛋白。二泛素化蛋白酶体途径参与IR诱导周期检查点蛋白p27Ki”表达的下调 已有的研究报道揭示:在真核细胞中，泛素化蛋白酶体降解系统调控着p27KIP’博士论文中文摘要的适时表达和表达水平。我们知道IR能激活泛素化蛋白酶体途径，那么，泛素化蛋白酶体途径是否参与IR诱导p27物’蛋白表达的调控?我们通过初步的研究结果揭示:Northem检测结果表明IR对p27KIP‘mRNA水平无明显影响;IR诱导p27KIP
张枫, 孟祥兵, 宋宜, 梅柱中, 董燕[2]2004年在《DNA损伤反应中细胞周期检查点蛋白p27~(Kip1)表达及其调控机制》文中认为为了研究DNA损伤反应中p2 7Kip1的表达及其调控机制 ,应用免疫印迹的实验结果表明 :10Gy 60 Coγ射线照射后 3h ,HeLa细胞中p2 7Kip1蛋白水平开始下降并持续到 2 4h ,进而失去它对CDKs的抑制功能 .Northern印迹结果显示 ,电离辐射 (IR)对p2 7Kip1mRNA表达水平无明显影响 ,说明电离辐射诱导p2 7Kip1表达水平的降低主要与蛋白质降解相关 ,但其具体的调控机制还不清楚 .已知在G1—S期p2 7Kip1蛋白的降低主要依赖细胞周期蛋白E Cdk2激酶将其磷酸化后的泛素化蛋白酶体途径 (ubiquitin proteasomepathway) .酶动力学研究结果揭示 :电离辐射后细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性增高 ,12h细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性达到最大 .当在照前用细胞周期蛋白E Cdk2抑制剂olomoucine (10 μmol L)抑制细胞周期蛋白E Cdk2激酶活性时 ,p2 7Kip1蛋白表达水平增加 .此外 ,还观察到电离辐射可诱导p2 7Kip1泛素化水平的增高 ,而在使用蛋白酶体抑制剂MG 132 (5 μmol L)处理HeLa细胞后 ,可抑制辐射诱导p2 7Kip1蛋白水平的下调 .研究结果提示 :泛素化蛋白酶体途径参与了辐射诱导P2 7Kip1蛋白表达下调的降解机制 .
莫玉珍[3]2005年在《不同分割剂量～（60）Coγ射线对鼻咽癌细胞株CNE-2增殖与细胞周期动力学改变的实验研究》文中认为目的:研究(60)~Coγ射线对鼻咽癌细胞株(CNE-2)细胞周期和细胞周期素(cyclin) D1、B1,增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase,CDK)1、4 的影响,动态观察辐射对细胞生长增殖与细胞周期动力学的影响,探讨γ射线对CNE-2 细胞增殖与细胞周期动力学影响的分子机制,为肿瘤大分割放疗方案的制定提供基础资料。方法:采用(60)~Coγ射线照射,剂量率为108~111mGy/min,设对照(未照射)组和分割剂量为4.0、6.0、8.0 Gy×5 次/5 天组,每次照射间隔24小时。采用PI 单染,用流式细胞术检测细胞周期分布;逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)结合半定量分析方法测定cyclin B1、CDK1、cyclin D1、CDK4 和PCNA mRNA 的表达情况。结果:①4.0、6.0、8.0 Gy (60)~Coγ射线分割照射CNE-2细胞第一天(次)后3 h,各组CNE-2 细胞均出现明显的S期和G_2/M 阻滞,表现为S期和G_2M 期细胞比例明显增大。照射第3 天(次),G_1期细胞比例增高,S 期、G_2期细胞数量减少。4.0、6.0Gy 分割照射第5 天(次),G_1期细胞数量下降,G_2期细胞数量上升,同时可见异倍体细胞;8.0Gy 照射第5 天(次),出现轻微的G_1和G_2期细胞比例升高,同时S期细胞数下降。②4.0、6.0、8.0 Gy 60Coγ射线分割照射CNE-2 细胞cyclin B1 mRNA 表达较对照组均有明显的下降(P<0.05),但各照射组间cyclin B1 表达水平无差别(P>0.05)。CDK1 mRNA 在所有照射组中均无表达,而对照组正常表达。4.0、6.0、8.0 Gy (60)~Coγ射线分割照射CNE-2 细胞cyclin D1 较对照组均有明显的下降(P<0.05);4.0、6.0、8.0 Gy 组分割照射CNE-2 细胞第3 天(次)cyclin D1mRNA 表达水平各照射组间无明显差别(P>0.05);6.0、8.0 Gy 组细胞在照射第5 天(次)后cyclin D1 mRNA 不表达。各照射组CNE-2 细胞CDK4 mRNA 表达较对照组无明显改变(P>0.05)。各照射组PCNA mRNA 表达水平较对照组无明显差别(P>0.05)。结论:①4.0、6.0、8.0 Gy (60)~Coγ射线分割照射CNE-2 细胞可使细胞发生G_1、S、G_2阻滞。G_1阻滞程度呈剂量依赖性升高,照射剂量越大,阻滞程度越明显。②4.0、6.0、8.0 Gy (60)~Coγ射线分割照射CNE-2 细胞诱发的G2/M 阻滞与CDK1 活性受抑及cyclin B1 mRNA 表达水平下降有关;G_1 阻滞
马玉花[4]2017年在《极光激酶A对宫颈鳞状细胞癌的影响及其机制研究》文中研究说明目的:根治性放射治疗(有或无DPP为基础的化疗)是宫颈鳞状细胞癌最有效的治疗方法之一,但是因为治疗抵抗导致治疗效果仍然非常有限。在这项研究中,我们探讨极光激酶A表达与放射治疗反应和宫颈鳞状细胞癌患者预后的相关性。探讨用极光激酶A选择性小分子抑制剂MLN8237联合DPP、多西他赛对宫颈鳞状细胞癌细胞系(HCC94、SiHa)的体外影响,并检测MLN8237对宫颈永生化细胞系H8的影响以检测MLN8237对正常细胞的毒性反应,同时探讨用极光激酶A抑制剂对宫颈鳞状细胞癌放射治疗的影响及对化放疗增敏的机制。方法:1)采用免疫组化方法检测极光激酶A在未接受任何治疗的129例初始接受根治性放射治疗的维吾尔族宫颈鳞状细胞癌患者组织中的表达水平,放射治疗给予外照射+内照射(A点剂量70-85Gy)伴或不伴顺铂为基础的化疗,分析极光激酶A不同表达水平对预后意义。2)以MLN8237,DPP,多西他赛,各单药组作用于HCC94、Si Ha细胞,并设调零组及不加药对照组,采用MTT比色法测各组HCC94、SiHa细胞的增殖抑制率;3)以MLN8237高剂量处理H8细胞,MTT比色法检测细胞的增殖抑制率。4)以各药物小剂量浓度联合作用24h,采用MTT比色法测各组HCC94、Si Ha细胞的增殖抑制率。5)以叁者1/2 IC50(48h)组合,IC50(48h)组合,采用MTT比色法测各组HCC94、SiHa细胞的增殖抑制率。6)以克隆形成实验验证以上MTT结果。7)以2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy放射剂量单独或联合MLN8237观察HCC94、Si Ha细胞平板克隆形成率,利用单击多靶模型拟合生存曲线,并计算外推值N,平均致死剂量D0和准阈剂量Dq以及放射增敏比SER。8)流式检测MLN8237处理HCC94、SiHa细胞后细胞周期、凋亡。MLN8237处理HCC94、SiHa细胞,设立对照,划痕检测迁移能力。MLN8237处理HCC94、Si Ha细胞,Q-PCR检测极光激酶A mRNA的变化,蛋白印迹检测极光激酶A蛋白、磷酸化(T288)极光激酶A蛋白的变化。结果:1)极光激酶A表达水平与宫颈癌不良预后相关的因素相关,包括淋巴转移(P<0.001),肿瘤体积大(P<0.001),低血红蛋白水平(P=0.011)和复发(P<0.001)。极光激酶A高表达和低表达临床放射治疗反应有差异,极光激酶A高表达患者放射治疗反应相对抗拒(P<0.001)。单因素分析显示淋巴转移、肿瘤大、低血红蛋白水平、极光激酶A过表达影响无复发生存和总生存。然而,多因素分析显示只有极光激酶A高表达可作为无复发生存(hazard ratio,3.953;95%CI,1.473-10.638;P=0.006)和总生存(hazard ratio 9.091;95%CI 2.597-32.258;P<0.001)的独立预后因素。2)MLN8237单药处理细胞时,各组对HCC94、Si Ha细胞生存率均比对照组降低(P<0.05),随着给药时间延长,细胞存活率逐渐降低(P<0.05)。DPP、多西他赛也呈同样趋势。与对照相比,MLN8237的浓度高达80uM时没有引起H8细胞活性降低(P>0.05),甚至高达320u M时仅导致小量毒性(细胞存活率85%)。3)MLN8237与DDP或者多西他赛联合处理各细胞24h时,各浓度联合作用组均较相同浓度单药存活率降低(P<0.05)。MLN8237与DDP或者多西他赛联合组各药物之间有交互作用,各药物最高浓度联合组效果最好。叁药1/2 IC50(48h)浓度联用HCC94、SiHa细胞存活率分别仅为15.859±4.657%,18.678±5.387%;叁药IC50(48h)联用HCC94、Si Ha细胞存活率更低分别仅为6.957±5.846%,9.561±6.241%。进一步在平板克隆形成实验中也得到证实。4)单击多靶模型绘制出细胞辐射存活曲线,可见无论是HCC94细胞,还是SiHa细胞,联合组曲线较单纯照射组左移,且较为平直,“肩区”不明显。5)划痕实验检测MLN8237处理24h细胞,与对照组比较,明显抑制细胞迁移。流式细胞周期检测MLN8237处理HCC94、SiHa细胞,与对照组比较,G2/M期明显增加,多倍体细胞比例明显增高,G0/G1+S期比例明显降低(P<0.05);流式细胞凋亡检测MLN8237处理HCC94、SiHa细胞,与对照组比较,凋亡细胞明显增多(P<0.05),并随时间和剂量增加,变化越明显。6)MLN8237处理前后极光激酶A mRNA未见显着性差异,极光激酶A蛋白也未见明显变化,(T288)磷酸化极光激酶A蛋白表达显着被抑制,甚至表达消失。结论:1)极光激酶A高表达可预测放射治疗反应相对抗拒和预后相对差。2)在临床应用中,对不能耐受大剂量顺铂或多西他赛的患者,我们可以加适当剂量MLN8237,适当减少顺铂或多西他赛剂量,以期在不增加毒副反应的情况下,达到相同甚至更好的治疗效果。而对于毒副反应耐受的患者,我们应在机体耐受范围内,尽可能提高MLN8237和顺铂或者多西他赛的剂量,以充分发挥抗肿瘤效果。3)在临床应用中,小剂量选择性极光激酶A抑制剂MLN8237对宫颈鳞状细胞癌均有放疗增敏作用,相同剂量选择性极光激酶A抑制剂MLN8237对放射抵抗宫颈癌的放射增敏比与相对敏感的肿瘤相比相对更大;同时适当增大MLN8237剂量可增强放射增敏效果。4)MLN8237体外对化放疗的增敏机制可能通过显着抑制肿瘤细胞迁移能力,诱导肿瘤细胞G2/M周期阻滞、多倍体形成,诱导凋亡实现的。5)MLN8237在体外并不抑制转录水平,也不影响翻译水平,而是改变了极光激酶A空间构象从而影响了其活性。
赵国伟[5]2005年在《组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡的分子机制研究》文中研究说明本论文旨在对应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylaseinhibitors, HDIs)之制滴菌素A(Trichostatin A, TSA)诱导肿瘤细胞周期阻滞和诱发凋亡的分子机制开展研究。首先,通过流式细胞术考查了Jurkat、K562、HL60、Namalwa、Molt-4 等血液病细胞系以及人宫颈癌HeLa 细胞系对TSA的敏感性,结果表明所有被检细胞在TSA 处理后均发生周期阻滞和/或凋亡。进一步通过Western blot 及Northern blot 检测上述细胞中周期检查点蛋白表达的变化,表明各细胞系中均显示细胞周期检查点(cell cycle checkpoint)关键的负调控因子p21WAF1/CIP1可有周期性改变,而与p21WAF1/CIP1同家族的p27KIP1及其下游分子Gadd45 则没有变化。肿瘤抑制蛋白p53 的表达由于各细胞系的遗传背景不同而表现不同,K562、HL60 细胞中未检测到p53,Jurkat、Namalwa和Molt-4 细胞中p53 表达不变,而HeLa 细胞中p53 的表达发生周期性变化。RT-PCR结果表明TSA对p21WAF1/CIP1的诱导表达作用为转录水平;为探讨TSA对p21 转录激活的分子机制,构建了p21WAF1/CIP1启动子区缺失体的荧光素酶报告质粒,利用双荧光素酶系统分析,确定TSA 的主要作用位点为p21WAF1/CIP1启动子区富含Sp1 结合位点的3’端;利用构建的p53 效应元件的荧光素酶报告质粒及p53 真核表达质粒共转染实验表明:TSA 能增强p53 与其效应元件的结合能力。综上所述,本论文研究证明TSA 作为新型的抗癌药物具有一定的广谱性,p21WAF1/CIP1是TSA 发挥抗癌作用的主要效应分子之一,在TSA 诱导HeLa 细胞发生周期阻滞过程中,p53 极可能参与了TSA 对p21WAF1/CIP1的诱导表达作用。
韩艳勤[6]2016年在《DNA-PKcs在放射诱发HeLa细胞自噬中的作用及抑制自噬对细胞周期检查点的影响研究》文中进行了进一步梳理DNA依赖的蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)是一个分子量大约为460k D的蛋白激酶,其属于磷脂酰肌醇-3-激酶相关蛋白激酶家族成员,是一种被DNA激活的丝氨酸/苏氨酸激酶,其与KU70/KU80组成的异源二聚体调节亚基一起组成了异源叁聚体DNA依赖的蛋白激酶(DNA-dependent kinase,DNA-PK)。DNA-PKcs的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性不仅可以激活调节损伤修复的相关蛋白和参与细胞周期调控的蛋白,而且还可以通过自身活化的方法调节其激酶活性。研究证实DNA-PKcs是一个具有多功能性的酶,其最主要的也是人们研究最透彻的一个功能就是通过非同源末端修复途径参与DNA双链断裂损伤修复。除此之外,DNA-PKcs的沉默或缺失还会引起电离辐射或化学药物引起的细胞不正常的分裂,细胞非正常的G1期或G2/M期阻滞和自噬。近年来随着对DNA-PKcs研究的不断研究,发现其在肿瘤组织中的表达要超出正常范围。很多研究已经表明DNA-PKcs的抑制是一个增加肿瘤细胞对抗电离辐射,肿瘤试剂拓扑异构酶II毒性物质和顺铂等敏感性的非常可行的方法。有研究表明,DNA-PKcs在胶质瘤细胞中参与电离辐射诱发自噬的调节,但是关于DNA-PKcs如何调节自噬的研究很少。细胞自噬是真核细胞中非常关键且保守的物质的分解与循环利用的过程,有助于降解细胞内长寿命的蛋白质,细胞溶质的成分,损伤老化的细胞器以及某些病原体使得它们得以循环重复利用,从而有助于保持细胞的内稳态,这是自噬最基本的作用。在面对错乱复杂的环境比如必需营养物质的缺乏,电离辐射以及内源性的活性氧,复制压力等,机体的细胞需要作出各种反应来应对不利环境,自噬会通过消耗自身的物质来使细胞获得临时的供应从而促进细胞存活。但是,细胞自噬在肿瘤的治疗过程中依然是一个十分有争议的话题,因为自噬可以刺激细胞存活,也可以诱导细胞死亡。研究表明当细胞遭遇某一种生理变化或者某一种特殊的处理比如致死性的药物剂量,细胞自噬就可以促进细胞的死亡。研究证实自噬的功能失调与许多疾病的起始和发展有很大关系。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA)是一个被研究学者广泛使用的细胞自噬抑制剂,主要作用能够通过抑制细胞自噬的正性调节子Ⅲ型PI3K来抑制自噬。目的1.以DNA-PKcs敲低的He La细胞系为对象,观察照射后细胞的放射敏感性以及自噬蛋白的表达情况,探讨DNA-PKcs调节自噬作用及其可能的分子机制;2.电离辐射可以诱发宫颈癌He La细胞G2/M期的周期阻滞,探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤在电离辐射诱发He La周期阻滞中的调节作用。方法利用实验室前期构建的DNA-PKcs沉默的表达载体,采用慢病毒介导的小干扰RNA技术,通过Lipofectamin 2000作为介质,包装慢病毒颗粒并感染He La细胞,使用嘌呤霉素抗性筛选获得稳定敲低DNA-PKcs的宫颈癌He La细胞系,并且经过免疫印迹鉴定;Hela-sh NC和Hela-sh DNA-PKcs经过单独照射或者与自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤联合作用处理细胞,在照射后不同时间点(0、12、24、48和72h)采用细胞增殖与毒性试验检测细胞的增殖与细胞的放射敏感性变化;He La细胞经过单独照射或者与自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤联合作用处理,通过细胞平板克隆形成实验检测照射后He La-sh NC和He La-sh DNA-PKcs在不同剂量射线下存活率变化;通过流式细胞术检测6Gy照射后0、2、4、6、8和12h后的细胞周期变化及有丝分裂期磷酸化组蛋白H3的变化;DNA-PKcs的激酶抑制剂NU7026与自噬的激动剂雷帕霉素共同处理细胞并通过免疫印迹实验检测多功能的泛素结合蛋白P62、微管轻链蛋白LC3、哺乳动物雷帕霉素的靶蛋白m TOR并且He La经过单独照射或者与自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤联合作用处理,通过免疫印迹检测周期检验点激酶2(Chk2),Cdk1及磷酸化酶Cdc25C的变化;利用分子克隆技术构建GFP-LC3表达载体并通过激光共聚焦免疫荧光技术检测绿色荧光GFP-LC3焦点的形成。结果1.免疫印迹验证He La-sh NC和He La-sh DNA-PKcs,发现DNA-PKcs在敲低细胞中表达很少,这说明DNA-PKcs稳定敲低的细胞系构建成功;2.细胞增殖与毒性检测结果显示,DNA-PKcs敲低的细胞放射敏感性增强,细胞的增殖速度减慢;在照射处理的基础上在细胞中加入自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤,无论是对照细胞还是DNA-PKcs敲低的细胞,其细胞的放射敏感性进一步增强;3.免疫印迹结果得到:与Hela-sh NC而言,DNA-PKcs敲低的细胞中,微观相关蛋白LC3蛋白表达增多而p62蛋白表达减少,m TOR在2481位点的磷酸化水平下调;4.使用自噬的激动剂雷帕霉素和DNA-PKcs的激酶抑制剂NU7026处理Hela细胞,通过免疫印迹实验得到DNA-PKcs的激酶活性被抑制后,细胞自噬蛋白LC3表达增加且加入雷帕霉素后自噬水平进一步增加;5.激光共聚焦免疫荧光法得到DNA-PKcs蛋白敲低后,平均每个细胞的GFP-LC3荧光斑点数目增多,加入自噬的抑制剂3MA细胞自噬被抑制,加入自噬促进物RAPA,细胞自噬增加;6.细胞经过6Gy照射处理并通过流式细胞术检测在照射后不同时间细胞周期的变化,发现细胞周期被阻滞在G2/M期,这与实验室前期的实验结果一致;在照射的基础上辅以自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤发现细胞的阻滞现象被破坏,这说明3MA参与了电离辐射诱导的周期阻滞的调节;7.细胞经过照射和自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤共同处理,通过流式细胞术检测3-甲基腺嘌呤处理后磷酸化的组蛋白H3表达增多,这说明3MA可以促进细胞从G2期进入到M期;8.免疫印迹检测在不同的时间点细胞周期相关蛋白,发现在加入自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤后,磷酸化的ATM(S1981)、Chk2(T68),Cdc2(T15)和Cdc25C(S216)蛋白的水平均有所下调。结论1.DNA-PKcs蛋白敲低后细胞的放射敏感性增加且电离辐射诱发的细胞自噬增加;2.DNA-PKcs可能是通过m TOR信号通路来调节自噬;3.3-甲基腺嘌呤通过ATM/Chk2/Cdc25c/Cdk1的信号通路来调节电离辐射诱发的细胞周期G2/M检查点功能。
焦旸[7]2007年在《乳癌抑制基因Tob1的功能与辐射增敏作用研究》文中研究说明乳癌是女性最常见的恶性肿瘤,具有发病率高、侵袭性强、发病早期即可发生远处转移等特点,是危害女性健康的主要恶性疾病之一。乳癌的发生机制错综复杂,涉及大量基因或基因以外的变化和众多相互交通的细胞信号通路,这为人们寻找安全理想的乳癌诊疗方法带来极大挑战。因此,对乳癌发生、发展机制的研究一直是近年来乳癌研究中的主要方向之一。肿瘤抑制基因主要的生物学功能是通过抑制细胞的恶性转化从而抑制肿瘤的发生,其编码蛋白产物主要参与对细胞周期进程的调控并能诱导细胞凋亡,此外还可参与对细胞间粘附力、蛋白酶活性等与肿瘤侵袭性或转移性相关的功能调节;肿瘤抑制基因的突变或其正常功能的改变往往引起细胞恶性转化,最终导致癌变。近年来对肿瘤抑制基因广泛、深入的研究为乳癌的临床诊治提供了重要的理论依据和实验基础,肿瘤抑制基因也因此成为乳癌发生机制中的一个研究热点。Tob1基因(transducer of ERBB2, 1)属于TOB/BTG抗增殖家族,已知该家族所有成员都具有抗细胞增殖活性和细胞周期负性调控作用。众多研究报道Tob1基因可通过对cyclin D1的表达调控参与对细胞周期进程的调控,并在多种人类肿瘤中均具有肿瘤抑制基因特征。然而Tob1在恶性肿瘤发生中的具体作用机制至今尚不完全清楚,其在乳癌发生、发展中的相关功能研究也未见报道。本研究首先通过Western Blot法、Northern Blot法以及免疫组化染色法对多种人类乳癌细胞及乳癌组织中Tob1的表达情况进行了检测,结果发现在多种乳腺肿瘤细胞及多数乳癌组织中Tob1的表达水平均有不同程度的下降或缺失。采用MTT生存分析法发现由重组腺病毒介导的外源性Tob1能显着抑制乳癌细胞的生长;而在实验动物模型中,Tob1的高水平表达还可以显着抑制乳腺肿瘤的生长以及肿瘤新生血管的形成。综合体内、体外以及动物实验结果,首次证实Tob1在乳癌的发生、发展过程中发挥肿瘤抑制因子作用。随后,为阐明Tob1发挥乳癌抑制功能的具体作用机制,采用流式细胞术分析了Tob1的高水平表达对细胞周期进程及细胞凋亡的影响,结果显示外源性Tob1可引起乳癌细胞中细胞周期G0/G1期以及G2/M期阻滞,并能显着增加细胞凋亡的发生,这一结果与采用Western Blot法和RT-PCR法检测到的细胞周期G1期调控关键因子cyclin D1的表达下降以及凋亡相关因子Bax的表达水平的下降相一致。雌激素(estrogen)/雌激素受体(estrogen receptor, ER)信号通路的异常激活是乳癌发生的重要机制之一,本实验采用GST捕获法、免疫共沉淀法等检测了Tob1与ER间的相互作用。实验中采用自行构建的一系列可表达Tob1全长、各片段缺失体以及“LXXLL”模序突变体的重组表达质粒载体进行Tob1的功能研究,结果发现Tob1可以和ER发生相互结合,而且这种结合作用与Tob1的氨基末端有关,但并不完全依赖于LXXLL模序。此外,荧光素酶活性测定结果显示Tob1可显着抑制ER的转录活性。上述结果共同提示Tob1可能通过雌激素/ER信号通路在乳癌的发生过程中发挥重要生物学作用。采用相同实验方法,还检测到Tob1不仅与ER信号通路下游关键调控因子cyclin D1存在体内外相互作用,并能显着抑制cyclin D1的转录活性。综合Tob1对cyclin D1不同表达水平的调控作用,初步阐明了Tob1对乳癌的细胞周期进程及细胞生长产生影响的具体分子机制。最后通过集落形成实验、TUNEL法、宿主细胞修复实验以及Western Blot法,首次证实重组腺病毒介导的Tob1高水平表达可通过对受照射细胞中凋亡相关基因的表达调控,增强辐射诱导的细胞凋亡;外源性Tob1通过对DNA损伤修复通路中关键因子的表达调控,抑制受照射细胞的DNA损伤修复能力;Tob1可能分别通过上述机制增加人类乳癌细胞对电离辐射的敏感性。总之,本研究首次证实Tob1可分别通过对细胞周期进程的调控以及对细胞周期凋亡的诱导发挥乳癌抑制因子作用,同时Tob1可通过对乳癌细胞中DNA损伤修复的调控作用而增强乳癌细胞对放射治疗的敏感性。这些研究结果为乳癌的发生机制提供了新的理论基础和实验依据,结合后续动物模型实验和临床前实验,将为人类征服这一恶性肿瘤性疾病提供新的研究手段和工具。
刘百龙[8]2016年在《DICER介导的Let-7调控肿瘤细胞对放化疗反应的作用及机制》文中提出目的:DICER作为mi RNA成熟过程中的关键酶,其功能复杂,与肿瘤的关系密切。本研究旨在明确DICER在放化疗所致的DNA损伤反应中的作用并进行机制上的探讨。方法:人成纤维细胞MRC5SV,宫颈癌细胞He La,人胶质瘤细胞M059J(ATM低表达、DNA-PKcs表达缺失存在NHEJ缺陷),ATM-/-(HRR缺陷细胞),180BRM(Ligase4突变的NHEJ缺陷细胞),将上述细胞应用si RNA技术敲除DICER,经CPT处理,克隆形成实验观察Si DICER对CPT敏感性变化及上述细胞敲除DICER后对射线的敏感性变化。Western Blot检测了DICER敲除后电离辐射HRR通路的关键蛋白:磷酸化ATM、Rad51、Rad54、XRCC2和XRCC3,NHEJ通路的关键蛋白:磷酸化DNA-PKcs,Artemis,Ku70,Lig4和XRCC4的表达情况。MRC5SV和He La细胞敲除DICER后,2Gy电离辐射后不同时间点ATM的磷酸化水平及Foci形成情况。Micro RNA array检测MRC5SV DICER敲除前后mi RNA的表达变化。流式细胞术检测DICER敲除前后细胞周期变化。Western Blot检测细胞周期调控关键蛋白Cyclin E、Cyclin A、Cyclin D1、p21Waf1/Cip1/p27Kip1的表达情况。Real-Time PCR检测DICER敲除前后p21/p27m RNA的表达情况。荧光素酶检测p21和p27 3’UTR是否存在Let-7b的潜在作用位点。U2OS HRR reporter cells及293FT NHEJ reporter cells分别检测DICER敲除后HRR及NHEJ修复效率。结果:(1)DICER敲除致使细胞对CPT抵抗敲除DICER使MRC5SV、He La细胞对CPT抗拒。进一步行恢复实验,即内源性DICER敲除后,将Si RNA抵抗的FLAG标签的DICER转入细胞中,发现对CPT的敏感性恢复。这些结果有力的证实DICER缺陷是细胞对CPT抗拒的主要原因。此外,其他细胞株:ATM-/-、180BRM、M059J敲除DICER后均对CPT抗拒。(2)DICER敲除使p21 Waf1/Cip1/p27 Kip1表达增加介导G1/S期阻滞敲除DICER后引起细胞数下降。G1期细胞对CPT更抗拒,我们检测敲除DICER后对细胞周期的影响。敲除DICER后,在CPT处理的细胞中可介导G1/S阻滞。进一步检测了调节细胞周期的相关基因表达,敲除DICER后p21 Waf1/Cip1/p27Kip1、Cyclin E及Cyclin A的表达明显增高,而敲除p21 Waf1/Cip1/p27Kip1后Cyclin E及Cyclin A的表达下降,表明Cyclin E及Cyclin A的表达依赖于p21 Waf1/Cip1/p27Kip1的存在。更重要的是,敲除DICER后,在CPT处理的细胞中介导的G1/S阻滞,如敲除p21 Waf1/Cip1/p27Kip1,G1/S阻滞消失,表明敲除DICER后,在CPT处理的细胞中介导的G1/S阻滞是由于p21和p27表达增加所致。(3)DICER依赖的Let-7合成减少致使p21 Waf1/Cip1/p27 Kip1表达增高敲除DICER后细胞p21和p27 m RNA水平无改变,但蛋白水平明显升高,表明p21和p27水平增高发生在转录后阶段。比较了人MRC5SV敲除DICER前后mi RNA表达变化,发现敲除DICER后Let-7家族合成明显减少。而Let-7b处理后的细胞p21和p27的表达水平明显下降,表明p21和p27是Let-7的靶基因。p21和p27 3’UTR存在Let-7的潜在作用位点,荧光素酶报告检测表明当细胞转染对照RNA时,荧光素酶活性无变化,但当细胞转染Let-7b时,荧光素酶活性严重受抑制,然而当p21和p27 3’UTR Let-7b结合位点突变时这种抑制作用可被逆转。除Let-7b外,人Let-7家族其他成员,都可以调控p21和p27,表明Let-7家族通过调控p21和p27来调节细胞周期。敲除DICER后过表达Let-7b,G1/S阻滞现象消失。(4)DICER敲除不影响细胞的放射敏感性将人M059J、180BRM、MRC5SV和He La细胞分别分别给予Ct RNA和Si DICER处理,分别给予X射线照射后,其生存率无变化。鼠细胞系,Ku80+/+(野生型)和Ku80-/-(NHEJ缺陷)也得出了相同的结果。DICER敲除后电离辐射HRR通路的关键蛋白:磷酸化ATM、Rad51、Rad54、XRCC2和XRCC3,NHEJ通路的关键蛋白:磷酸化DNA-PKcs、Artemis、Ku70、Lig4和XRCC4的表达未见明显变化。MRC5SV和He La细胞敲除DICER后,给予2Gy电离辐射后不同时间点ATM的磷酸化水平及Foci形成情况与对照组无差异。这排除了敲除DICER介导的CPT抵抗与ATM蛋白水平或活性变化的可能。(5)G1/S期阻滞致使HRR效率下降,S期细胞数目减少,细胞对CPT耐药DICER敲除后我们将Let-7b过表达或抑制p21/p27,DICER敲除的细胞对CPT的耐药消失。HR reporter试验显示,敲除DCIER后,HR修复效率降低,当转染Let-7b或抑制p21和p27的表达,DICER敲除所致的HRR效率下降这一现象即被逆转。NHEJ reporter细胞株敲除DICER后其NHEJ效率增加,而敲除p21或Let-7b上调后增加的NHEJ效率消失。这些结果充分证明DICER敲除所致的HRR效率下降是由于DICER敲除后Let-7合成下降,致使p21/p27过表达,G1/S期阻滞,进入S期减少是细胞对CPT耐药的主因。结论:(1)DICER依赖的Let-7合成减少致使p21 Waf1/Cip1/p27 Kip1表达增高,介导细胞周期G1/S阻滞,致使细胞对CPT抵抗。(2)肿瘤细胞DICER缺乏,通过上述机制介导对S期周期特异性化疗药耐药,是拓扑异构酶I耐药的新机制。(3)DICER敲除不影响细胞的放射敏感性。综上所述,本研究明确了DICER在放化疗所致的DDR中的作用,发现了新的调控细胞周期的mi RNA,且揭示了DICER介导的拓扑异构酶I耐药的新机制,为mi RNA功能和机制的研究提供新的视角。该研究提示DICER在肿瘤的治疗中有非常重要的地位,可能为根据DICER的表达情况开展肿瘤个性化治疗方案提供依据。
孙志强[9]2008年在《Celecoxib增强胶质瘤细胞SHG44和U87-MG对γ射线的敏感性及其机制研究》文中认为目的:本课题通过研究COX-2选择性抑制剂celecoxib对胶质瘤细胞SHG44和U87-MG增殖能力的影响,探讨celecoxib对细胞辐射敏感性的影响;通过对celecoxib作用后细胞COX-2 mRNA表达水平及~(60)Co-γ线照射后细胞周期以及周期调控相关蛋白p53,cyclinD_1,cyclinB_1表达水平的检测,对celecoxib增敏机制进行初步探讨。方法:(1)利用MTT法检测celecoxib对胶质瘤细胞SHG44和U87-MG存活分数的影响;(2)克隆形成法检测胶质瘤细胞的辐射敏感性、celecoxib对细胞辐射敏感性的影响;(3)应用反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase PCR,RT-PCR)法检测celecoxib对~(60)Co-γ线照射后细胞COX-2 mRNA表达水平的影响;(4)用流式细胞仪检测celecoxib对~(60)Co-γ线照射后细胞周期分布改变;(5)应用Western Blot法研究celecoxib对~(60)Co-γ线照射后细胞周期调控相关蛋白p53,cyclin D_1,cyclin B_1的影响;结果:(1)Celecoxib的细胞增殖抑制作用具有浓度依赖性,其抑制作用随浓度升高而增加;相同照射剂量下,细胞克隆形成率随celecoxib浓度增加而减小,相同celecoxib浓度下,细胞克隆形成率随照射剂量增加而减小,celecoxib浓度与辐射剂量对胶质瘤细胞的辐射增敏效应存在交互作用;存活率为0.5时,SHG44和U87-MG细胞的辐射增强系数均随celecoxib浓度增加而升高;(2)与对照组相比,celecoxib抑制细胞COX-2 mRNA表达水平;与单独照射组相比,celecoxib抑制~(60)Co-γ线照射后细胞COX-2 mRNA表达水平;(3)与对照组相比,celecoxib处理两种细胞后G1期细胞比例均上升;与单独照射组相比,celecoxib能降低辐射诱导的细胞G_2/M期阻滞;(4)Celecoxib处理后细胞cyclinD_1蛋白水平均明显降低,p53、cyclinB_1蛋白水平均无明显变化;celecoxib联合~(60)Co-γ线照射相比于单独照射,细胞cyclinB_1蛋白水平明显降低。结论:(1)低浓度celecoxib对脑胶质瘤细胞无增殖抑制作用,较高浓度celecoxib剂量信赖性抑制细胞增殖;celecoxib能提高两种脑胶质瘤细胞对~(60)Co-γ射线的辐射敏感性,50μmol/L celecoxib对两种细胞均有较好的辐射增敏作用;(2)Celecoxib对胶质瘤细胞的辐射增敏机制与其抑制COX-2 mRNA表达水平密切相关,可能通过影响COX-2蛋白表达或其上游的底物、酶,抑制了射线诱导的COX-2蛋白上调,导致对胶质瘤细胞的辐射增敏作用;(3)Celecoxib能诱导两种胶质瘤细胞G1期阻滞,celecoxib抑制辐射诱导活化的细胞G_2/M期阻滞效应,使更多辐射损伤细胞直接进入有丝分裂期,没有得到足够修复时间而死亡;(4)Celecoxib降低胶质瘤细胞cyclinD_1蛋白表达水平;celecoxib联合照射降低辐照后细胞内cyclinB_1蛋白表达水平,提示celecoxib可通过对G_2期调控关键因子cyclinB_1的抑制,减弱辐射诱导的G_2/M期阻滞效应,发挥辐射增敏作用。
黄莉[10]2009年在《不同照射模式对CNE-2细胞周期和细胞周期素的影响研究》文中研究表明目的:通过给予人鼻咽低分化鳞癌细胞株(CNE-2)不同模式照射,探索不同照射模式对CNE-2细胞周期和细胞周期素Cyclin B1、Cyclin D1的转录水平及蛋白表达的影响。方法:运用流式细胞术检测不同照射模式下放射线诱导的细胞周期阻滞;运用PT-PCR、Western blotting方法检测不同照射模式下,与细胞周期调控相关的Cyclin B1、Cyclin D1的转录水平及蛋白表达。结果:1.流式细胞术检测细胞周期分布(%):CNE-2在2、4、6、8Gy剂量点,1)G2期细胞比例随照射剂量的增加而逐渐增加;在相同剂量点,模拟IMRT组G 2期细胞比例低于常规照射组。2)S期细胞比例随照射剂量的增加而逐渐减少;在相同剂量点,模拟IMRT组的S期细胞比例高于常规照射组。3)G1期细胞比例随照射剂量的增加而逐渐减少;在相同剂量点,模拟IMRT组的G1期细胞比例高于常规照射组。2.PT-PCR、Western blotting方法检测CNE-2 Cyclin B1、Cyclin D1的转录水平及蛋白表达:CNE-2在2、4、6、8Gy剂量点,1)Cyclin B1的转录水平随照射剂量的增加而降低;在相同剂量点,模拟IMRT组Cyclin B1的转录水平高于常规照射组,Cyclin B1的转录水平差异均有统计学意义(P均<0.05)。2)不同照射方式及不同照射剂量下,Cyclin D1的蛋白表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。Western blotting方法检测CNE-2 Cyclin B1、Cyclin D1的蛋白表达均得到相似结果。结论:模拟IMRT照射时间延长,对CNE-2细胞G2期阻滞程度减弱,Cyclin B1的表达相对升高,导致放射敏感性下降,放射生物效应降低。
参考文献：
[1]. 电离辐射诱导细胞周期检查点蛋白p27～（Kip1）表达及其调控机制研究[D]. 张枫. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
[2]. DNA损伤反应中细胞周期检查点蛋白p27~(Kip1)表达及其调控机制[J]. 张枫, 孟祥兵, 宋宜, 梅柱中, 董燕. 中国生物化学与分子生物学报. 2004
[3]. 不同分割剂量～（60）Coγ射线对鼻咽癌细胞株CNE-2增殖与细胞周期动力学改变的实验研究[D]. 莫玉珍. 广西医科大学. 2005
[4]. 极光激酶A对宫颈鳞状细胞癌的影响及其机制研究[D]. 马玉花. 新疆医科大学. 2017
[5]. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导肿瘤细胞周期阻滞和凋亡的分子机制研究[D]. 赵国伟. 吉林大学. 2005
[6]. DNA-PKcs在放射诱发HeLa细胞自噬中的作用及抑制自噬对细胞周期检查点的影响研究[D]. 韩艳勤. 中国人民解放军军事医学科学院. 2016
[7]. 乳癌抑制基因Tob1的功能与辐射增敏作用研究[D]. 焦旸. 苏州大学. 2007
[8]. DICER介导的Let-7调控肿瘤细胞对放化疗反应的作用及机制[D]. 刘百龙. 吉林大学. 2016
[9]. Celecoxib增强胶质瘤细胞SHG44和U87-MG对γ射线的敏感性及其机制研究[D]. 孙志强. 苏州大学. 2008
[10]. 不同照射模式对CNE-2细胞周期和细胞周期素的影响研究[D]. 黄莉. 新疆医科大学. 2009