谭燕双[1]2003年在《水曲柳组织培养外植体的筛选及植株再生的途径》文中研究表明本项研究首次对适合水曲柳组织培养的各种外植体进行筛选，并研究通过多种途径进行水曲柳植株再生的可行性。最终通过下胚轴增生不定芽和腋芽增生的途径建立了两套较为完整的水曲柳组织培养再生系统。首次选用将MS培养基中的所有元素都减半的MS1／2培养基作为水曲柳腋芽增生的专用培养基。 以不同休眠程度和处理的水曲柳种子进行离体培养试验。结果表明，采用切开种子的方法进行离体培养可提高种子发芽率，其中横切1／2的种子萌发最好。经过层积处理的种子优于未经催芽处理的种子。通过对四种不同培养基和0.1mg／L～5.0mg／L浓度范围内的BA培养效果的对比，认为切开种子在附加蔗糖2％，3mg／L BA的MS培养基中生长最好。 通过不定芽增生的途径获得再生植株时，初步选用无菌苗的下胚轴、子叶、胚根、叶柄和茎段等营养器官，以及种子的下胚轴、幼嫩的花序轴和茎段几种外植体进行培养。其中，直接从种子中剥离的下胚轴不定芽诱导效果最好。在MS+TDZ0.1mg／L+IBA0.01～0.1mg／L培养基中不定芽诱导率为89.6％，不定芽的存活率达到48.7％。 在腋芽增生的研究中，外植体包括无菌苗和成年树上的节，休眠芽和展叶芽。统计结果表明，以无菌苗的节作为外植体，MS1／2+1.5mg／LBA+0.1mg／L NAA培养基中腋芽增生效果最好，腋芽的增生率可达到61.5％。 在愈伤组织诱导实验中，采用无菌苗的子叶、胚根、无节茎段、带顶芽茎段和下胚轴以及种子下胚轴、幼嫩的花序轴和茎段分别进行诱导。带顶芽茎段愈伤组织的诱导率达到90.5％，愈伤组织直径大于1.3cm，绿色，颗粒状，长势最好。 水曲柳无菌苗生根相对容易。组培苗采取直接生根和间接生根两种方式进行生根。生长素的添加对水曲柳的生根起决定作用，细胞分裂素对水曲柳的生根有抑制作用。NAA比IBA诱导生根的效果好，在NAA0.5mg／L时，达到最大生根率63.7％。生根苗容易诱导成活。
张丽杰[2]2006年在《取材时期对水曲柳合子胚外植体体细胞胚胎发生的影响》文中认为水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)为木犀科白蜡树属的落叶乔木,是东北林区珍贵的3大硬阔叶树种之一,同时也是我国东北地区重要的用材树种和园林绿化树种。本研究以不同耿材时期水曲柳合子胚的子叶为外植体诱导体细胞胚胎发生,确立合子胚的最佳取材时期,并对体细胞胚的成熟、萌发、生根的影响因素如培养基的种类、激素的浓度和种类以及蔗糖和琼脂的浓度等进行了探讨,探索了体细胞胚萌发到实现正常转株的可能性途径。首次在有关水曲柳体细胞胚胎发生研究的基础上针对取材时期这一影响因素进行系统的研究,逐步完善体细胞胚胎发生体系,为实现植株再生奠定基础。研究结果如下: (1) 取材时期是水曲柳合子胚体细胞胚胎发生的关键影响因素之一。7月中旬(授粉后大约9周)取材的未成熟合子胚其体细胞胚诱导率较高,而且体细胞胚的质量较好;而7月初(授粉后8周左右)和9月中旬(授粉后大约17周)取材的合子胚体细胞胚发生率较低。因此,我们确定了水曲柳合子胚的最佳取材时期是7月中旬。 (2) 不同取材时期水曲柳合子胚的子叶在MS1/2基本培养基上同时添加不同浓度的生长素NAA和细胞分裂素BA即可诱导出体细胞胚,二者浓度适当时体细胞胚的发生多以直接发生为主,诱导的体细胞胚数量多、质量高;当初生体细胞胚发生后,较易产生次生胚。最终筛选出诱导水曲柳体细胞胚发生的最佳激素组合:MS1/2+BA0.5 mg.L~(-1)+NAA1.5,2.5mg.L~(-1),诱导率达到35.32%; (3) 水曲柳体细胞胚萌发培养基选取MS和MS1/2,并附加不同浓度的NAA,结果表明体细胞胚在MS1/2培养基上萌发率较高,并且在子叶胚的胚根及下胚轴处可以不断产生大量的次生胚;筛选出体细胞胚萌发的最佳组合是MS1/2+NAA 0.01mg.L~(-1),萌发率可达24.8%。 (4) 水曲柳的体胚苗生根难是一个亟待解决的难题。在体胚苗生根培养中,确定了体胚苗生根的最佳组合:MS1/2+NAA0.01mg.L~(-1)+20g.L~(-1)蔗糖+7g.L~(-1)琼脂。 (5) 进一步验证了水曲柳体细胞胚胎的发生有单细胞和多细胞起源两种起源方式,发生于子叶外植体表面或愈伤组织表面的体细胞胚为单细胞起源,发生于愈伤组织内部的体细胞胚则为多细胞起源。体细胞胚的发生经历了原胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚阶段。在球形胚后期至心形胚发育前期可见胚柄的形成,随着心形胚的发育,胚柄逐渐退化消失;同时,在心形胚阶段已经出现维管束的分化,鱼雷胚后期可见维管束呈明显的“V”字形,与母体组织相独立,表现出明显的极性。
冯丹丹[3]2006年在《外植体的母树来源对水曲柳体细胞胚胎发生的影响》文中提出研究体细胞胚胎发生是基因工程以及突变体筛选的基础,是优良品系的快繁体系得到实际生产应用的前提。水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)外植体的母树来源对体细胞胚胎发生的影响,这一研究是判断植物增生途径的有效方法和手段。本文就东北地区重要的用材树种和园林绿化树种水曲柳的不同母树来源的成熟、未成熟子叶体细胞胚发生以及植株再生进行了系统研究,主要结果如下: 以同一地点不同母树来源的水曲柳未成熟合子胚子叶为外植体,进行体细胞胚胎发生研究,研究结果表明,不同的母树来源的子叶体细胞胚发生诱导需要不同的最适激素组合,其诱导频率也不同,分别为:母树3,NAA2mg/L+BA0.5mg/L,其诱导频率为54%;母树1,NAA1.5 mg/L+BA0.5mg/L,18%;母树4,NAA1mg/L+BA0.5mg/L,16%;母树2,NAA1.5mg/L+BA0.5mg/L,12%。 对分别采自哈尔滨实验林场、露水河林业局以及帽儿山实验基地36株不同母树来源的成熟合子胚子叶为外植体进行体细胞胚胎发生研究,以MS1/2为基本培养基,附加NAA5mg/L、BA2mg/L、水解酪蛋白400mg/L、蔗糖70g/L、琼脂6g/L,pH值高压灭菌前调至5.8。研究结果表明,不同采种地区母树来源的子叶体细胞胚诱导频率不同:同一采种地区不同母树来源的子叶体细胞胚胎诱导频率相差较大;从最大诱导率15.00%到未能诱导体细胞胚胎发生。 球型胚、心型胚、鱼雷型胚体细胞胚以及胚性愈伤在MS1/2+0.01mg/L NAA+200mg/L水解酪蛋白、蔗糖20g/L、琼脂7g/L、pH值高压灭菌前调至5.8的培养基上增殖最佳:单独接种子叶型体细胞胚于上述培养基上可繁殖成苗。 通过细胞组织学方法研究体细胞胚的起源与发生部位,采用石蜡切片法,结合艾氏苏木精整体染色,在光学显微镜下,发现水曲柳体细胞胚为单细胞起源,直接发生于外植体的表皮层细胞。间接发生的体细胞胚则形成于愈伤组织的表面或内部。胚性愈伤组织细胞较小,接近圆形,排列紧密,胞质浓厚,核大,核仁明显。非胚性细胞相对较大,形状不规则,排列疏松或紧密,胞质稀薄,大液泡,核小,偏向细胞一侧。体细胞胚经球型胚、心型胚、鱼雷型胚、子叶型胚最后发育为再生植株。鱼雷期以后维管束呈明显“丫”字形,与母体组织无联系。两极明显。
黄剑[4]2004年在《水曲柳离体再生系统的建立与完善》文中研究表明取水曲柳成熟种子的胚轴作为外植体，对其组织培养进行了系统的研究，获得了不定芽增生和植株再生。 初步试验结果显示：对于不定芽的诱导，TDZ比BA更为有效。以MS作为基本培养基添加1～2mg/L的TDZ进行初代培养，2周后不定芽增生达到最大值。继代培养后极小部分的不定芽伸长，转移到生根培养基后可诱导生根成为完整植株。然而存在着两大问题：1)外植体大量死亡；2)不定芽难以伸长。 由此，在初步实验结果的基础上，我们对不定芽死亡率高和不定芽难伸长的问题进行了进一步的研究，寻求解决途径。结果表明，高盐浓度的MS培养基对不定芽的诱导有促进作用，但不定芽死亡率高；低盐浓度的WPM培养基尽管对不定芽诱导没有优势，但可维持再生不定芽的正常生长。TDZ与BA配合使用对不定芽诱导的促进效果，比单独使用其中的任何一种激素的效果都要大。而且，这两种细胞分裂素的配合使用，对降低外植体的死亡率有很大的作用。最佳的诱导培养基为MS+2mg/L TDZ+0.01mg/LBA，诱导率可达83.3％。WPM，以其低盐浓度、“温和”的特性，被用于进行不定芽的继代培养。BA与IBA配合使用，对不定芽的伸长生长有很好的促进效果。最佳的配比为2mg/L BA+0.01mg／L IBA。 综合研究结果，我们认为，培养基、细胞分裂素和生长素的“协同作用”对水曲柳胚轴外植体的不定芽诱导以及再生不定芽的伸长生长起着至关重要的作用，尤其是激素之间的平衡互作是一个很重要的影响因素。
孙桂君[5]2009年在《水曲柳体细胞胚成熟及萌发促进研究》文中研究表明水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)属木犀科白蜡树属,是我国东北地区重要的珍贵阔叶树种。水曲柳体细胞胚发生及植株再生的研究对水曲柳优良无性系的大量快繁具有重要的意义。许多研究者提出,在再生系统中体细胞胚的成熟是十分重要的一环,在本研究组前期研究中发现,在诱导出的体胚发育到子叶形体胚时,体胚大多数是畸形的(如多子叶胚、单子叶胚、联体胚等),并伴随继代时间的延长而逐渐褐化死亡。因此,体细胞胚的质量和形态的好坏直接影响到体细胞胚的萌发和植株再生。本文针对水曲柳体细胞胚低萌发率和低成苗率的现象,通过对体胚分化阶段到成熟发育这阶段及体胚后期萌发发育阶段的关键影响因素进行调控来提高体胚的成活率和萌发率,同时采用扫描电镜和透射电镜观察方法来跟踪观察水曲柳体胚发生过程的细胞变化,通过研究外植体细胞表面及内部物质变化,给今后为建立水曲柳体胚发生及植株再生系统提供可靠的理论依据。(1)以分化阶段体胚期体胚(球形、心形、鱼雷形)为材料,选择MS1/2+1.5mg·L~(-1) NAA+0.5 mg·L~(-1)6-BA+400 mg·L~(-1)水解酪蛋白+70 g·L~(-1)蔗糖+6 g·L~(-1)琼脂为对照,在添加不同渗透剂对体胚进行成熟培养(此阶段包括分化阶段和成熟培养)中,结果表明添加蔗糖70 g·L~(-1)、活性炭2 g·L~(-1)和PEG 30 g·L~(-1),对体胚成熟明显具有促进作用,其中PEG30 g·L~(-1)处理后的体胚虽然成熟率不如添加其它渗透剂成熟率高,但都为正常的成熟胚。(2)在分化阶段在培养基中添加ABA、NAA和6-BA,添加低浓度的细胞分裂素更有利于体胚成熟。在GA_3其中添加5.0 mg·L~(-1)的赤霉素中有70%体胚向成熟方向发育。(3)在电镜观察过程中,发现接种外植体表面有单细胞突起,随之出现了早期的体细胞胚同时细胞组成细胞团,组成细胞团的细胞之间结合紧密,而细胞团与细胞团之间结合疏松,中间具有一定的空隙。进一步进行内部观察,在外植体培养阶段细胞发生一系列的变化。这些都可以说明胚性细胞处于十分活跃的状态为进一步分裂储备了丰富的能量和物质,这也为下一步进行研究提供了依据。(4)选择子叶形体胚进行萌发试验,以MS1/2+0.01 mg·L~(-1)NAA+20 g·L~(-1)蔗糖+200mg·L~(-1)水解酪蛋白+6.5 g·L~(-1)琼脂培养基为对照,在研究发现活性炭能有明显的促进体胚的萌发(达到83.3%)的作用,其真叶发育正常且部分长出胚根,以单独添加0.2 mg·L~(-1)6-BA的培养基对体胚的萌发效果最好,萌发率达到了63.3%,以添加高浓度(5.0mg·L~(-1))GA_3也能促进体胚萌发。总结以上分析可以得出结论,通过人为控制培养基成分可以掌握体胚成熟和萌发的条件。
张宇[6]2007年在《水曲柳体细胞胚胎发生的同步化调控》文中认为充分利用植物体细胞胚的前提是要有一个高频同步的体细胞胚发生体系，这也是自动控制其进程和研究其生理生化特性和分子生物学等问题所必须的。本研究利用未成熟的水曲柳合子胚为外植体诱导体细胞胚发生，探讨了渗透压、冷冻和ABA等处理对子叶形体细胞胚同步化发生的影响，及干燥和冷冻处理对体细胞胚萌发、体胚苗生根及后期生长的影响。通过研究得出如下主要结论：手工选择法、过筛法、饥饿法和后期液体培养法均不适合于水曲柳体细胞胚同步化的调控。渗透压调节法、冷冻法和ABA调节法均可提高水曲柳子叶形胚的同步化率。其中利用蔗糖来调节培养基的渗透压的方法所得到的子叶胚同步化率最高，然而在体细胞胚发育过程中存在明显的败育现象，其中以前期诱导培养15 d，蔗糖浓度降为50 g·L~(-1)时水曲柳体细胞胚的同步化率最高为81.0％。ABA调节法中体细胞胚同步化率略低于渗透压调节法，且无明显的败育现象，但畸形胚发生率明显升高，在此方法中以前期诱导30 d，ABA浓度为1 mg·L~(-1)的处理最适合于水曲柳体细胞胚的同步化调控。冷冻处理后子叶胚的质量好，且大小均一，但其同步化率明显低于其他两种处理，其中前期诱导15 d、在低温条件下冷冻7 d的处理最有利于水曲柳体细胞胚的同步化。从研究结果中可以看出，仅靠单一因素来调节体细胞胚的发育，很难获得高质量、同步化的水曲柳体细胞胚，因此几种方法结合使用将更有利于水曲柳体细胞胚的同步化调控。同时，研究中还发现，前期诱导培养时间过长不利于水曲柳体细胞胚的同步化控制，综合各种处理方法后我们认为前期诱导培养15 d时最有利于水曲柳体细胞胚的同步化。在体胚苗萌发培养中，冷冻处理不利于水曲柳体细胞胚生根和后期生长，而将体细胞胚快速干燥10 min后转移到萌发培养基中可明显促进水曲柳成熟胚的萌发、生根和后期生长。
黄剑[7]2010年在《水曲柳（Fraxinus mandshurica Rupr.）不定芽发生体系与发育机理的研究》文中进行了进一步梳理水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)是我国东北地区重要的珍贵阔叶树种,其材质优良,树形优美,且抗性较强,具有较高的经济价值和景观价值。本文以水曲柳的下胚轴作为外植体,对其不定芽和植株再生进行了系统的研究,并利用植物显微、HPLC及差异显示PCR等技术对水曲柳不定芽再生过程中的组织化学变化、生理生化动态、内源激素动态及基因差异表达进行了研究,分析和探讨了水曲柳不定芽发育的机理。主要研究结论如下：通过成熟种子的下胚轴建立了水曲柳不定芽快速繁殖系统。在MS和WPM两种培养基上均能够诱导出不定芽分别为(83.3%和80.0%),但在MS培养基上外植体死亡现象极为严重,而WPM培养基上外植体死亡率低。在MS培养基上,TDZ比BA更能促进不定芽的诱导；而在WPM培养基上BA则优于TDZ。最佳诱导培养基为WPM+10μMBA；继代伸长培养基为WPM+10μBA+0.05μM IBA；低盐和添加少量的IBA有利于不定芽生根,生根培养基为WPM+0.5μMIBA,幼苗的生根率为81.6%,生根幼苗在温室中驯化成活。通过石蜡制片法,观察组织培养过程中不定芽的形态发生。培养3d时发现,胚轴切口处和韧皮部薄壁细胞分裂已启动；培养第6d时,细胞处于分裂非常旺盛的状态,与顶端分生组织的细胞相似,是典型的分生细胞,排列紧密,细胞质浓、核大、壁薄；9d时,芽原基形成,其细胞排列紧密,染色较深,细胞核明显。通过生理生化指标的研究发现,在水曲柳不定芽再生过程中可溶性糖含量、SOD、CAT.POD.可溶性蛋白、总酚含量、PPO以及核酸呈有规律的变化动态。这些物质含量和组分的变化与细胞的旺盛分裂、不定芽再生的启动以及外植体褐化过程密切相关。可溶性糖、蛋白质含量在不定芽启动过程中呈上升趋势,是不定芽发生的物质基础和能量基础。POD、总酚含量和PPO含量在褐化的外植体中含量最高,表明这些物质的含量与植物细胞在外植体褐化状态下的逆境反应有关。不定芽启动及形成过程中,ZT含量保持着较高的水平。ZT的峰值出现在培养开始后的第6 d。ZT/IAA的比值在不定芽的诱导中起着关键作用。褐化程度越高,ABA含量越高。内源激素水平和外源激素间的平衡对水曲柳的不定芽形成及发育起着重要的调节作用,尤其是激素之间的平衡互作是一个很重要的影响因素。水曲柳不定芽再生过程中DDRT-PCR的适宜反应体系为：5'随机引物数为1个,退火温度为40℃,dNTP浓度100μmol/L。mRNA差异显示结果表明,在水曲柳不定芽发育过程中基因表达有着很大的差异,表现为时序表达,转录水平上的明显差异主要发生不定芽诱导的初期。
王红梅[8]2005年在《水曲柳离体根培养体系的建立》文中指出本项研究首次对适合水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)实生苗根尖的消毒和无菌苗根尖离体培养的各种条件进行筛选。 在水曲柳实生苗根尖的初代培养中,选用15种不同的消毒剂对水曲柳实生苗根尖进行消毒处理。结果表明:采用4%NaClO消毒4min然后再用0.1%HgCl_2消毒10min的二次消毒法,对水曲柳根尖表面消毒效果最好,污染率降低到30.47%。根尖经消毒后,在无污染的培养基中添加0～100mg/L浓度范围内的不同种类的抗生素,认为可采用60～80mg/L的庆大霉素、四环素、氯霉素中的任意一种抗生素,污染率都有所降低。在已污染的培养基中添加同样的抗生素,没有起到任何的抑菌效果。 以水曲柳成熟种胚为外植体进行离体培养试验,以获得无菌苗的胚根。通过对培养基、蔗糖浓度、激素浓度等各种条件的筛选,结果表明:种胚在附加2%蔗糖和0.3mg/L NAA的1/2MS培养基中胚根长势最好。 以水曲柳无菌苗根尖为外植体,研究了不同的培养基、培养方式、琼脂浓度、糖的种类和浓度、激素浓度等对离体培养的水曲柳根尖生长的影响,结果表明:1/2MS、MS、White、B_5、WPM、DKW这六种培养基,White培养基对于根尖的生长和诱导是最好的;暗培养明显有利于根尖的生长;不添加琼脂的液体培养基对根尖的生长较添加琼脂的固体培养基和固-液培养基好;蔗糖作为碳源的效果较果糖和麦芽糖好,其中以3%的蔗糖对离体根尖的生长效果最好;最佳的激素组合和浓度为0.5mg/L BA+1.0mg/L NAA。 以水曲柳无菌苗根尖为外植体诱导愈伤组织的实验中,1/2MS、MS、White、B_5、WPM、DKW这六种培养基,1/2MS培养基对根尖具有最高的愈伤组织诱导率;NAA相对IBA和2,4-D来说,诱导愈伤组织的效果是最好的,在0.5mg/L NAA+1.0mg/L BA培养基中,愈伤组织的最高诱导率达到了40.3%。增殖培养基为附加20g/L蔗糖,7g/L琼脂,2.0mg/L NAA+1mg/L BA的MS培养基。
王晶[9]2015年在《水曲柳体胚发生技术优化及H_2O_2和NO作用分析》文中提出水曲柳(F. mandshurica Rupr.)属木犀科白蜡树属,是东北3大硬阔叶树种之一。本文以水曲柳成熟合子胚为外植体,通过研究外源H202和NO对水曲柳体胚发生的影响及对细胞内总死亡量、细胞内H2O2含量和细胞内NO含量的影响,分析其在水曲柳体胚发生和外植体细胞死亡中的作用,探究其在信号网络中的位置；同时筛选进行水曲柳体胚增殖和萌发培养的材料,然后以胚性愈伤组织为继代材料研究成功诱导体胚以后继代次数对体胚增殖和植株再生的影响,分析水曲柳体胚继代过程中的胚性保持能力和植株再生能力,为进行水曲柳种质资源保存提供保障。主要研究结果如下：1.H202和NO在水曲柳体胚发生中均起着重要的作用。适当增加外植体细胞内H202含量促进体胚发生；清除外植体细胞中H202不利于体胚发生和后期发育。增加外植体细胞内NO含量有利于体胚发生和发育,提高体胚质量；减少外植体细胞中NO含量不利于水曲柳体胚发生和发育,降低体胚质量。2.水曲柳体胚增殖培养过程中,4 mm未变绿体胚的直接增殖效果最好。相比直接增殖材料,进行继代增殖培养的最佳材料为愈伤组织。水曲柳体胚增殖系数随增殖继代次数的增加而增加。3.水曲柳体胚萌发培养过程中,4-8mm未变绿体胚的萌发效果最佳。随着增殖继代次数的增加,水曲柳次生体胚的体胚萌发率逐渐降低；随着萌发培养时间的延长,体胚均出现大量的褐化死亡现象。随着增殖继代次数的增加,水曲柳次生体胚的体胚生根率呈现先升高后降低的趋势。4.H2O2和NO作为信号因子共同参与了高浓度蔗糖胁迫诱导的水曲柳体胚发生过程中的外植体细胞死亡过程,NO在信号网络中作为H202的上游信号。H202处理抑制细胞总死亡量,促进细胞内H202含量的生成,促进细胞内NO含量的生成；CAT处理抑制细胞总死亡量,抑制细胞内H202含量的生成,抑制细胞内NO的生成。5.SNP处理抑制水曲柳外植体细胞死亡,抑制细胞内H202的产生,促进细胞内NO的产生；PTIO抑制细胞死亡,抑制细胞内H202的产生,抑制细胞内NO的产生。
刘艳[10]2011年在《不同取材时期水曲柳合子胚DNA甲基化及体胚发生状态》文中研究指明水曲柳Fraxinus mandshurica)是我国东北地区珍贵的叁大硬阔树种之一,是重要的用材树种。本研究通过对不同取材时期的水曲柳合子胚子叶进行诱导体胚；并通过在培养基中添加5-氮胞苷诱导水曲柳体胚发生；同时使用MSAP技术测定不同取材时期的水曲柳合子胚子叶以及外植体的基因组DNA甲基化状态来研究其与水曲柳体胚发生的关系。为深入解析水曲柳体细胞胚胎发生与外植体基因组DNA甲基化状态的关系奠定基础,为水曲柳体细胞胚胎发生发育的精细调控提供科学依据。研究结果如下：(1)以不同取材时期水曲柳合子胚子叶为外植体诱导体胚发生,在7月下旬的体胚诱导率最高；而愈伤组织诱导率的最高值出现在7月中、下旬,并与其他时期相比差异显着(p<0.05)。因此,确定7月下旬为水曲柳体胚发生的最佳时期。(2)通过MSAP技术,建立了水曲柳合子胚子叶基因组DNA甲基化的检测体系。通过检测不同取材时期水曲柳合子胚基因组在CCGG位点的胞嘧啶甲基化水平,每个时期基因组DNA分别获得933～939条清晰可辨的PAGE谱带。在7月下旬甲基化条带最少,各个时期的甲基化差异不显着。在7月下旬,DNA甲基化水平最低,而其体胚诱导率确实最高。(3)培养基中添加5-氮胞苷对水曲柳体胚发生的外植体状态的比率有影响,但不影响外植体状态的种类。不同浓度的5-氮胞苷对水曲柳体胚发生数影响差异不显着,对畸形胚发生数影响差异显着。其中,20.0μmol/L的5-氮胞苷明显促进畸形胚发生数的增加。5-氮胞苷会明显抑制水曲柳外植体的褐化、愈伤组织的诱导以及体胚发生,不同浓度的5-氮胞苷的抑制效果不同,但都与对照差异显着(p<0.05)。其中,0.5μmol/L的5-氮胞苷的抑制强度最大。(4)不同培养时间添加20.0μmol/L的5-氮胞苷,在第1 d加入促进水曲柳体胚发生数及畸形胚发生数的增加,且与其他处理差异显着(p<0.05)；且抑制水曲柳外植体褐化；显着提高水曲柳愈伤组织诱导率,在其他培养时间加入20.0μmol/L的5-氮胞苷,对外植体的褐化及愈伤组织诱导率都没有显着影响。在第15-21 d加入20.0μmol/L的5-氮胞苷,显着提高水曲柳体胚发生率(p<0.05)。(5)添加5-氮胞苷对外植体褐化的作用趋势与对体胚发生的影响趋势几乎相同,再-次证明了“水曲柳体胚发生必然伴随着外植体褐化”的发现。但是培养基中添加5-氮胞苷对外植体DNA甲基化水平影响效果不明显。
参考文献：
[1]. 水曲柳组织培养外植体的筛选及植株再生的途径[D]. 谭燕双. 东北林业大学. 2003
[2]. 取材时期对水曲柳合子胚外植体体细胞胚胎发生的影响[D]. 张丽杰. 东北林业大学. 2006
[3]. 外植体的母树来源对水曲柳体细胞胚胎发生的影响[D]. 冯丹丹. 东北林业大学. 2006
[4]. 水曲柳离体再生系统的建立与完善[D]. 黄剑. 东北林业大学. 2004
[5]. 水曲柳体细胞胚成熟及萌发促进研究[D]. 孙桂君. 东北林业大学. 2009
[6]. 水曲柳体细胞胚胎发生的同步化调控[D]. 张宇. 东北林业大学. 2007
[7]. 水曲柳（Fraxinus mandshurica Rupr.）不定芽发生体系与发育机理的研究[D]. 黄剑. 东北林业大学. 2010
[8]. 水曲柳离体根培养体系的建立[D]. 王红梅. 东北林业大学. 2005
[9]. 水曲柳体胚发生技术优化及H_2O_2和NO作用分析[D]. 王晶. 东北林业大学. 2015
[10]. 不同取材时期水曲柳合子胚DNA甲基化及体胚发生状态[D]. 刘艳. 东北林业大学. 2011