陈隈陟[1]2004年在《中子和γ射线照射小鼠骨髓损伤的病理特点及调控机制研究》文中提出骨髓对中子辐射高度敏感，于较小剂量的中子辐射即可引起严重的骨髓损伤。迄今，尚未见采用现代分子病理技术对其病变规律进行动态观察与研究，其调控机制未明。为此，本实验拟利用小鼠复制中子和γ射线辐射骨髓损伤的动物模型，采用光镜、电镜、免疫组化、DNA凝胶电泳、原位末端标记、流式细胞术等技术，比较研究骨髓造血组织经中子和γ射线照射后的病变特点及Caspase-3和c-kit在其中的作用。结果表明：中、重度骨髓型放射病骨髓经历造血细胞死亡、残留、再生恢复和基本恢复的过程；极重度骨髓型和肠型放射病则经历造血细胞死亡、残留和空虚。中子照射后小鼠骨髓中坏死和凋亡的细胞均明显增多，随照射剂量的增加坏死的细胞增加，5． 5Gy组以坏死为主；γ射线照射后骨髓造血细胞以凋亡为主，随照射剂量的增加凋亡的细胞增加。中子和γ射线照射后6h，c-kit蛋白于造血细胞浆内表达明显增多，γ射线照射组强于中子照射组；照后10d，γ射线照射组c-kit蛋白于造血细胞膜阳性，而中子照射组于照后14 d呈强阳性。各剂量组动物骨髓于照后6h造血细胞中Caspase-3蛋白明显增多，且呈一定的剂量效应关系，即中子照射组随照射剂量的增加而减少，而γ射线随照射剂量的增加而增多。结论：5． 5Gy γ射线照射引起中度骨髓型放射病，2． 5Gy中子照射引起重度骨髓型放射病，而4． 0，5． 5Gy中子及12Gy γ射线照射引起肠型放射病；中子和γ射线照射后骨髓造血细胞死亡方式不同：中子照射见凋亡与坏死并存，5． 5Gy组以坏死为主，而γ射线照射则以凋亡为主；c-kit和caspase-3基因表达参与了辐射诱导的骨髓细胞损伤和修复的过程。
莫琳芳[2]2012年在《低剂量率~(60)Coγ/中子辐射的生物效应研究》文中研究说明【目的】观察低剂量率中子、~(60)Co γ及~(60)Co γ/中子混合辐射对大鼠的生物效应，并探讨其可能对脂代谢相关基因的影响，为低剂量率辐射损伤的医学评估及防治提供理论依据。【方法】将120只雄性SD大鼠按照射方式分为4个组：空白对照组、中子照射组、~(60)Coγ照射组及中子/~(60)Co γ混合照射组，每个照射组按照射时间，再分为3组：分别照射14、28和45天，共计12组，每组10只。单纯中子照射采用252Cf中子源（吸收剂量率为0.085mGy/h），每天照射21h，连续照射14、28和45天累积剂量分别为24.990mGy、49.980mGy和80.325mGy；单纯γ照射采用~(60)Co γ源（吸收剂量率为0.09Gy/h），每天照射2h，连续照射14、28和45天累积剂量分别为2.52Gy、5.04Gy和8.10Gy；中子/~(60)Co γ混合照射组接受中子和γ双重照射，照射方式和时间同单纯照射组。以上各组大鼠照射完成后，称体重，通过腹主静脉取血后脱颈处死，并解剖取出肝脏、脾脏、胸腺、睾丸、附睾、肠道（胃幽门至盲肠段）及右侧股骨。测定以下指标：1.称量体重、肝脏、脾脏、胸腺、双侧睾丸及附睾重量，测量肠道长度，计算脏器指数；2.采用显微计数法测定精子相对数量；3.采用血细胞分析仪测定外周血细胞计数：白细胞计数、红细胞计数和血小板计数；4.采用比色法测定骨髓DNA含量；5.采用MTT法测定ConA诱导的脾淋巴细胞转化率；6.采用鲎试剂比色法测定血清内毒素（LPS）含量；7.采用化学比色法测定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性及血清丙二醛（MDA）含量；8.采用实时荧光定量PCR检测大鼠肝脏CYP7A1、FABP1及PPARα基因表达。【结果】1.各累积剂量中子照射组与空白对照组比较均出现不同程度损伤。(1)低剂量率中子辐射对大鼠体重的影响：累积照射28天及以上时，大鼠体重显着降低（P<0.05）。(2)低剂量率中子辐射对大鼠消化系统的影响：与空白对照组比较，各照射组大鼠肠道长度均显着缩短（P<0.05或P<0.01）；血清LPS含量均有升高趋势，但无统计学意义（P＞0.05）；累积照射28天及以上时，肝脏指数显着升高（P<0.05）。(3)低剂量率中子辐射对大鼠骨髓和血液系统的影响：累积照射14天及45天时，大鼠骨髓DNA含量显着降低（P<0.01）；累积照射28天及以上时，外周血细胞计数WBC非常显着性下降（P<0.01）；各照射组RBC均非常显着降低（P<0.01）；累积照射45天时，PLT显着下降（P<0.05）。(4)低剂量率中子辐射对大鼠免疫系统的影响：累积照射45天时，胸腺指数及脾脏均非常显着性降低（P<0.01）；累积照射14天及28天时，ConA诱导的脾淋巴细胞转化率OD值呈非常显着性下降（P<0.01），累积照射45天时显着下降（P<0.05）。(5)低剂量率中子辐射对大鼠生殖系统的影响：照后大鼠睾丸指数均呈下降趋势，但无统计学意义（P＞0.05）；累积照射14天时，附睾指数显着下降（P<0.05）；累积照射45天时，精子相对计数显着降低（P<0.05）。(6)低剂量率中子辐射对大鼠抗氧化系统的影响：照后大鼠血清SOD活力均呈降低趋势，但无统计学意义（P＞0.05）；累积照射28天及以上时，血清MDA含量升高（P<0.05或P<0.01）。(7)低剂量率中子辐射对大鼠脂代谢的影响：大鼠肝脏胆固醇代谢通路中胆固醇分解代谢的限速酶CYP7A1mRNA表达在各剂量点均显着下调，且有剂量依赖关系，提示低剂量率中子辐射对胆固醇代谢有扰动作用。照射后FABP1基因则未见显着差异表达。累积照射45天后PPARα基因相对表达是空白对照组的2.701倍。提示当中子累积剂量达到一定程度时，对PPARα基因表达可能有一定影响。2.各累积剂量~(60)Co γ照射组与空白对照组比较均出现不同程度损伤。(1)低剂量率~(60)Co γ射线对大鼠体重的影响：累积照射28天及以上时，大鼠体重与空白对照组比较显着降低（P<0.01或P<0.05）。(2)低剂量率~(60)Co γ射线对大鼠消化系统的影响：累计照射28天时，大鼠肠道长度显着缩短（P<0.01）；累积照射45天时，大鼠肠道长度反而延长，但无统计学差异（P＞0.05）；累积照射45天时，血清LPS含量显着升高（P<0.01）；累积照射28天及以上时，肝脏指数显着升高（P<0.01或P<0.05）。(3)低剂量率~(60)Co γ射线对大鼠骨髓和血液系统的影响：照射后各组大鼠骨髓DNA含量降低（P<0.05或P<0.01）；累积照射28天及以上时，外周血细胞计数WBC、RBC、PLT均显着或非常显着性下降（P<0.05或P<0.01）。(4)低剂量率~(60)Co γ射线对大鼠免疫系统的影响：辐射后各组大鼠ConA诱导的脾淋巴细胞转化率均非常显着降低（P<0.01）；累积照射28天及以上时，胸腺指数及脾脏指数均显着降低（P<0.05或P<0.01）(5)低剂量率~(60)Co γ射线对大鼠生殖系统的影响：累积照射45天，睾丸指数非常显着性下降（P<0.01）；累积照射14天及45天时，附睾指数均显着下降（P<0.05）；累积照射14天及45天时，精子相对计数显着降低（P<0.05或P<0.01）。(6)低剂量率~(60)Co γ射线对大鼠抗氧化系统的影响：照射后大鼠血清SOD活力呈降低趋势，但无统计学意义（P＞0.05）；累积照射28天及以上时，血清MDA含量均显着升高（P<0.01）。(7)低剂量率~(60)Co γ射线对大鼠脂代谢的影响：利用实时荧光定量PCR检测发现照射组CYP7A1基因表达下调，且随累积剂量的增大，基因表达下调程度增加。~(60)Coγ射线累积照射14天时，照射组CYP7A1基因表达是空白对照组的0.396倍；累积照射28天时，照射组CYP7A1基因表达是空白对照组的0.228倍；累积照射45天时，CYP7A1基因表达是空白对照组的0.140倍。照射后，PPARα和FABP1基因则未见显着差异表达。3.各累积剂量~(60)Co γ/中子混合组与空白对照组比较均出现不同程度损伤。(1)低剂量率混合辐射对大鼠体重的影响：各照射组大鼠体重显着降低（P<0.05或P<0.01）。(2)低剂量率混合辐射对大鼠消化系统的影响：累计照射14天及28天时，大鼠肠道长度显着缩短（P<0.05或P<0.01）；累积照射45天时肠道长度反而显着延长（P<0.05）；累积照射45天时，血清LPS含量显着升高（P<0.01）；各照射组肝脏指数均显着升高（P<0.01或P<0.05）。(3)低剂量率混合辐射对大鼠骨髓和血液系统的影响：各照射组大鼠骨髓DNA含量均显着或非常显着性降低（P<0.05或P<0.01）；外周血细胞计数WBC、RBC、PLT均非常显着下降（P<0.01）。(4)低剂量率混合辐射对大鼠免疫系统的影响：各照射组大鼠胸腺指数及脾脏指数均显着或非常显着性降低（P<0.05或P<0.01）；各照射组大鼠ConA诱导的脾淋巴细胞转化率OD值均非常显着性下降（P<0.01）。(5)低剂量率混合辐射对大鼠生殖系统的影响：累积照射28天及以上时，睾丸指数显着下降（P<0.05或P<0.01）；各照射组附睾指数及精子相对计数均显着或非常显着性下降（P<0.05或P<0.01）。(6)低剂量率混合辐射对大鼠抗氧化系统的影响：各照射组大鼠血清SOD活力显着降低（P<0.05或P<0.01）；累积照射28天及以上时，血清MDA含量均显着升高（P<0.01）。(7)低剂量率混合辐射对大鼠脂代谢的影响：利用实时荧光定量PCR检测发现照射组CYP7A1基因表达下调，且随累积剂量的增大，基因表达下调程度增加。混合照射14天、28天、45天后，CYP7A1基因表达分别是空白对照组的0.300倍、0.181倍和0.128倍。照射后，PPARα和FABP1基因则未见显着差异表达。【结论】本实验通过低剂量率中子、~(60)Co γ及中子/~(60)Co γ混合辐射照射大鼠，证实单一及混合辐射对照射动物胃肠道系统、骨髓血液系统、免疫系统、生殖系统、抗氧化系统损伤均有不同程度损伤作用，且随着时间的增加，累积剂量的增大，照射种类的联合，损伤的程度加重。此外通过实时荧光定量PCR检测肝脏脂代谢相关基因，观察到低剂量率电离辐射对肝脏胆固醇代谢有一定影响。
常公民[3]2011年在《NF-κB信号通路在中子辐射致肠上皮细胞损伤中的调控机制研究》文中提出中子辐射较γ射线损伤重,肠道是中子辐射高度敏感的靶器官,中子辐射肠道损伤重、难恢复。目前中子辐射肠道损伤的病理特点已基本明确,然而其损伤机制仍未完全阐明,尚缺乏有效的治疗措施。为此,本课题在既往研究的基础上,复制中子照射肠上皮细胞损伤整体和离体模型,以NF-κB信号通路在中子辐射肠道损伤中的作用为切入点,开展NF-κB信号通路在中子辐射致肠上皮细胞损伤中的调控作用研究,为阐明中子辐射肠上皮细胞损伤的分子机制、寻找新的防治措施和发现新的治疗靶点提供依据。材料与方法一、实验动物分组与模型制作方法选取二级雄性BALB/c小鼠120只,随机分为对照组(C组,n=30)、3Gy中子照射组(N组,n=60)和3Gy中子照射+姜黄素组(Cur组,n=30);采用3Gy中子全身均匀照射N组和Cur组小鼠;照射后即刻给予Cur组小鼠腹腔注射姜黄素混悬液1次,剂量为200 mg·kg-1·d-1,此后连续给药5d(1次/d),N组和C组小鼠腹腔注射同体积的生理盐水。二、小鼠整体行为和空肠组织结构光镜和电镜观察照射后每天观察并记录动物整体行为、体重变化、腹泻及死亡情况;分别于照射后6h、1d、3d和5d活杀C组和N组动物,Cur组于照射后3d和5d活杀,留取各组各时间点小鼠空肠组织;通过光镜和电镜观察3Gy中子照射及应用Cur后小鼠空肠组织结构以及超微结构的变化。叁、小鼠空肠上皮细胞增殖与死亡的检测采用AgNOR和Feulgen染色方法检测中子照射及应用姜黄素后小鼠空肠上皮细胞的嗜银蛋白及DNA含量变化;采用TUNEL方法检测小鼠空肠上皮细胞凋亡改变。四、小鼠空肠组织NF-κB通路中信号分子检测通过IHC和EMSA方法检测中子照射及应用姜黄素后小鼠空肠上皮细胞NF-κB的表达及活性变化;采用WB检测小鼠空肠上皮细胞NF-κB、IKKβ、IκBα、PI3K和Akt的表达变化;通过Co-IP技术检测小鼠空肠组织中Akt和IKKβ相互作用;通过Real-time PCR方法检测IKKβmRNA的变化。五、IEC-6细胞培养、分组、照射及处理IEC-6细胞传代培养后,随机分为5组:对照组(C)、4Gy中子照射组(N)、4Gy+LY294002组(LY)、10Gyγ射线照射组(R)和10Gyγ射线+LY294002组(LY2);分别采用4Gy中子和10Gyγ射线对IEC-6细胞进行均匀照射;LY294002处理方法:于中子和γ射线照射前24h,LY组和LY2组细胞更换为含LY294002终浓度为10μmol/L的培养液。六、IEC-6细胞增殖与死亡检测于中子和γ射线照射后6h和24h,通过IPCM观察IEC-6细胞的形态变化;于中子照射后6h和24h收集细胞留取样品,γ射线照射后15min、30min、1h、6h和24h收集细胞留取样品;分别采用MTT方法和FCM检测IEC-6细胞的增殖活力以及凋亡与坏死率改变。七、IEC-6细胞NF-κB通路中信号分子检测通过WB方法检测中子和γ射线照射后IEC-6细胞中NF-κB、IKKα/β和IκBα的表达及其磷酸化水平改变。八、图像分析和定量方法(一)小鼠空肠细胞AgNOR、DNA含量及NF-κB免疫组化结果,采用CMIAS-Ⅱ系列多功能真彩色病理图像分析系统,在光镜10×40倍视野下,每组切片采集10个视野,检测其MOD和IOD。(二)WB结果采用Image Pro 5.0软件进行图像分析,测定电泳条带的IOD,将各目的蛋白条带与相应内参GAPDH的IOD比值进行定量分析。(叁)IKKβ和相应GAPDH mRNA应用7300 system SDS软件进行定量分析。(四)Co-IP结果采用CMIAS-Ⅱ图像分析系统进行IOD测定和定量分析。九、统计学处理文中数据以均数和标准差(?X±s)表示;采用SPSS 13.0统计软件进行一元方差分析Excel软件作图;vs对照组,*示P<0.05,**示P<0.01;vs照射组,#示P<0.05,##示P<0.01。实验结果一、小鼠整体行为、空肠组织学及超微结构改变(一)小鼠整体行为的改变:3Gy中子照射及应用姜黄素后,小鼠精神状态逐渐变差,不进食水,体重进行性下降,并出现严重腹泻症状;于照射后3~5d内全部死亡,出现了肠型放射病典型的“叁天半效应”。(二)小鼠空肠组织学改变:3Gy中子照射后,光镜下可见肠黏膜大面积坏死脱落,绒毛上皮细胞稀疏、排列较乱,细胞肿胀,隐窝细胞见核固缩、碎裂,其数量进行性减少;照射后3~5d可见隐窝细胞再生,但隐窝中细胞数目较少;姜黄素组在治疗3d和5d时隐窝细胞再生较明显,且可见丰富的绒毛深入肠腔。(叁)小鼠空肠超微结构改变:3Gy中子照射后3d,电镜下,小鼠空肠隐窝细胞减少,可见胞核碎裂,核染色质浓缩边移,隐窝细胞呈空泡状,出现坏死和凋亡的细胞,以坏死为主,照射后5d可见小肠绒毛有轻度增生;Cur组于3Gy中子照射后3~5d,空肠组织中可见有新生微绒毛及隐窝,隐窝内细胞数目较照射组略有增加。二、小鼠空肠上皮细胞嗜银蛋白及凋亡改变(一)小鼠空肠上皮细胞嗜银蛋白和DNA含量:3Gy中子照射照射后6h~5d,N组和Cur组小鼠空肠上皮细胞嗜银蛋白和DNA含量进行性下降(P<0.01),照射后3~5d,Cur组小鼠空肠上皮细胞嗜银蛋白和DNA含量均较照射组增加(P<0.05)。(二)小鼠空肠上皮细胞凋亡TUNEL检测结果:3Gy中子照射照射后6h~1d,N组小鼠空肠上皮可见大量凋亡细胞;照射后3d,N组和Cur组小鼠空肠上皮细胞偶见凋亡细胞。叁、小鼠空肠上皮细胞NF-κB及通路中信号分子的变化(一)小鼠空肠上皮细胞NF-κB的表达变化:NF-κB在正常肠绒毛及隐窝上皮细胞胞浆内呈弱阳性,3Gy中子照射后6h~5d,NF-κB于上皮细胞核呈阳性,并于照射后5d达到高峰(P<0.01),Cur组在照射后3d和5d,NF-κB在绒毛及隐窝上皮细胞核及浆内表达呈阳性,强度弱于照射组(P<0.05)。(二)小鼠空肠组织NF-κB的DNA结合活性变化:3Gy中子照射后6h~3d,N组小鼠空肠组织中NF-κB与DNA结合活性明显增强;Cur组在照射后3d,小鼠空肠组织中NF-κB与DNA结合活性较N组明显降低。(叁)小鼠空肠组织NF-κB通路中信号分子的变化:(1)小鼠空肠组织NF-κB和IKKβ蛋白于3Gy中子照射后6h和1d表达上调(P<0.05),照射后3d和5d表达明显上调(P<0.01);Cur组在照射后3d和5d,NF-κB和IKKβ表达下调(P<0.05)。(2)小鼠空肠组织IκBα蛋白于3Gy中子照射后6h和1d表达下调(P<0.05),照射后3d和5d表达明显下调(P<0.01);Cur组在照射后3d和5d,IκBα表达上调(P<0.05)。(3)3Gy中子照射后6h小鼠空肠组织IKKβmRNA表达增加(P<0.05),至照射后24h表达明显增加(P<0.01);Cur组在照射后6h和24h,IKKβmRNA表达水平较N组明显降低(P<0.05)。四、小鼠空肠上皮细胞PI3K、Akt的表达及Akt和IKKβ相互作用变化(一)小鼠空肠组织PI3K和Akt的表达变化:小鼠空肠组织PI3K和Akt蛋白于3Gy中子照射后6h和1d表达上调(P<0.05),照射后3d和5d表达明显上调(P<0.01);Cur组在照射后3d和5d,PI3K和Akt表达下调(P<0.05)。(二)小鼠空肠组织Akt和IKKβ的相互作用:3Gy中子照射后6h和1d,小鼠空肠组织中Akt和IKKβ相互作用明显增强(P<0.01),照射后3d和5d,Akt和IKKβ的相互作用减弱(P<0.05);Cur组在照射后3d和5d,Akt和IKKβ相互作用较照射组减弱(P<0.05)。五、IEC-6细胞形态、增殖活力、凋亡及坏死率改变(一)IEC-6细胞形态的变化:4Gy中子和10Gyγ射线照射后6h和24h,细胞肿胀,形态变圆,折光性增强;应用LY294002处理后,培养液漂浮大量死细胞。(二)IEC-6细胞增殖活力、凋亡及坏死率改变:4Gy中子和10Gyγ射线照射后,细胞增殖活力较对照组明显下降(P<0.01),细胞凋亡与坏死率均显着增加(P<0.01),辐射后6h凋亡达高峰,24h以坏死为主;应用LY294002处理后,细胞的增殖活力较照射组明显降低(P<0.05),凋亡和坏死率增加(P<0.05)。六、IEC-6细胞NF-κB通路中信号分子变化及蛋白磷酸化改变(一)IEC-6细胞NF-κB通路中信号分子变化:(1)IEC-6细胞内NF-κB、IKKα和IKKβ蛋白于4Gy中子照射后6h表达上调(P<0.05),24h表达明显上调(P<0.01);应用LY294002处理组,于照射后6h和24h,上述蛋白表达均下调(P<0.05)。(2)IκBα于4Gy中子照射后6h表达下调(P<0.05),24h表达明显下调(P<0.01);应用LY294002处理组,于照射后6h和24h,IκBα表达上调(P<0.05)。(二)IEC-6细胞NF-κB信号通路中蛋白磷酸化改变:(1)10Gyγ射线照射后15~30min,IEC-6细胞内磷酸化NF-κB和磷酸化IKKα/β蛋白表达上调(P<0.05),照射后1h表达明显上调(P<0.01);应用LY294002处理组,叁种磷酸化蛋白的表达均下调(P<0.05)。(2)IEC-6细胞内磷酸化IκBα蛋白在10Gyγ射线照射后15~30min未见表达,1h见明显表达(P<0.01);应用LY294002处理组,于照射后1h磷酸化IκBα的表达较照射组明显上调(P<0.01)。结论一、3Gy中子照射可引起小鼠轻度肠型放射病,肠上皮严重损伤,上皮细胞凋亡与坏死并存,细胞增殖能力降低;表明3Gy中子照射成功建立了中子辐射小鼠空肠损伤的动物模型。二、姜黄素治疗可减轻中子辐射肠道损伤的程度,促进空肠粘膜上皮再生修复,对中子辐射肠上皮损伤具有保护作用。叁、3Gy中子照射可使小鼠空肠NF-κB信号通路活化,通路中关键信号分子IKKβ表达上调,NF-κB表达上调且发生核转位,进而可能通过调控多种参与炎症反应的靶基因,促进炎症因子的表达,导致中子照射后肠道炎症发生。四、姜黄素可抑制中子照射后小鼠空肠NF-κB信号通路活化,下调NF-κB和IKKβ的表达水平,这可能是其发挥保护作用的机制之一。五、3Gy中子照射后,小鼠空肠Akt和NF-κB信号通路中关键激酶IKKβ存在相互作用,表明中子照射后NF-κB信号通路受到PI3K/Akt信号通路的调控。六、4Gy中子和10Gyγ射线照射均可使IEC-6细胞增殖活力降低,凋亡与坏死率增加,应用LY294002可以进一步降低照射后IEC-6细胞增殖活力,增加凋亡和坏死率。七、4Gy中子和10Gyγ射线照射均可使IEC-6细胞NF-κB信号通路活化,应用PI3K的抑制剂LY294002可相应抑制NF-κB信号通路的活化,表明NF-κB信号通路活化可对IEC-6细胞损伤发挥保护作用。
韩瑞刚[4]2006年在《IL-11对中子辐射后小鼠骨髓损伤的防治作用及其机制研究》文中指出目的：骨髓对中子辐射高度敏感，中子辐射可造成比γ射线更严重的损伤。目前大剂量中子辐射骨髓损伤尚缺乏有效的防治措施。IL-11是一种多能细胞因子，其对γ射线辐射后骨髓造血功能损伤具有明显治疗作用。研究IL-11对中子辐射后骨髓功能和结构的影响及其机制，对中子急性放射病的防治具有重要意义。 方法：二级雄性BALB／c小鼠156只，采用清华大学核能技术研究院核反应堆裂变中子源进行2.5及4.0Gy 90％中子全身照射，建立中子辐射诱导的骨髓型急性放射病小鼠模型。两给药组分别于4.0Gy照前3d及照后即刻给予600gg／kg／d的rhIL-11，每日1次，连续给药3d，应用特殊染色、免疫组化、原位杂交、DNA凝胶电泳、流式细胞术以及原位末端标记等技术，研究IL-11对中子辐射致骨髓损伤的防治作用及其机制。 结果：2.5及4.0Gy中子辐射后小鼠：(1) 外周血细胞减少，骨髓有核细胞数量减少；照前及照后给予IL-11，外周血细胞及骨髓有核细胞计数均高于单纯照射组；(2) 骨髓组织结构明显损伤，表现为造血细胞凋亡与坏死，数量减少；血管扩张、出血。照前、照后给予IL-11可见骨髓细胞凋亡率下降，造血细胞减少缓解，骨髓腔出血减轻。照前给予IL-11还可降低骨髓细胞坏死率；(3) 骨髓细胞中DNA含量、AgNOR含量减少。照前、照后给予IL-11，二者含量均高于单纯照射组；(4) 骨髓细胞中IL-11及其受体表达减少。照前、照后给予IL-11，骨髓细胞中IL-11及其受体蛋白表达均高于单纯照射组，而IL-1lRa mRNA则未见差异。 结论：(1) 2.5、4.0Gy中子辐射可引起骨髓组织结构、造血功能的损伤，造血细胞发生凋亡和坏死的形态改变；(2) 给予IL-11可减少造血细胞凋亡，促进骨髓细胞增殖，从而减轻中子辐射引起的骨髓组织结构和造血功能损伤；(3) IL-11可能通过翻译水平调节，增强IL-11受体表达，发挥其抑制凋亡、促进增殖的作用，从而减轻中子对骨髓造血的损伤。
李明[5]2010年在《重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）对中子重度骨髓型急性放射病比格犬的实验治疗研究》文中进行了进一步梳理当前,世界各有核国家继续坚持核威慑的核心思想,认为核武器是维护国家安全和利益的重要保障,无核国家也正在极力发展核武器,我国受周边国家核武器的威胁逐渐增加。其次,当前恐怖活动猖獗,恐怖分子使用简易爆炸装置破坏核设施的可能性也随时存在。此外,核能和核技术应用过程中因操作失误等导致的临界事故也时有发生。不论是核武器爆炸还是重大核辐射事故均可导致大量人群受到不同比例中子和γ射线混合照射。研究表明,中子比例越高损伤效应越重。为做好核辐射突发事件医学应急准备,开展高比例中子-γ射线混合照射所致急性放射病(acute radiation sickness, ARS)的实验治疗研究具有重大的军事和社会意义。众所周知,造血损伤是骨髓型ARS的基本损伤。目前,利用基因工程重组技术制备的重组造血生长因子已成为促进ARS造血功能恢复治疗中的首选药物。其中重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有促进骨髓造血细胞增殖分化形成粒细胞集落、诱导中性粒细胞终末分化和增强中性粒细胞功能等作用,用于γ射线所致骨髓型ARS具有良好的治疗效果,成为国际公认的ARS治疗药物之一。但关于rhG-CSF对中子重度以上骨髓型ARS的治疗效果尚未见文献报道。此外,在rhG-CSF的应用时机及用药剂量和方法等方面仍存在许多值得探讨的问题。针对以上问题我们进行了两方面的探索。首先,给予比格犬2.3Gy 90%中子照射以制造中子重度骨髓型ARS动物模型,结果显示照射对照组动物75%死亡,死亡动物平均存活10.8d;照射后出现呕吐、腹泻、血水便等十分严重的胃肠道症状、体温明显升高、全血细胞急剧减少、骨髓造血细胞空虚,从以上情况分析,该照射条件可致中子重度骨髓型ARS。与等效剂量的γ射线照射犬比较,2.3Gy中子照射动物的早期死亡(7d内)发生率增加,死亡时间提前;早期胃肠道症状、感染及临床出血发生时间更早,程度更重;皮肤损伤重;外周血白细胞数下降更为迅速,但白细胞最低值相当。此外,还发现比格犬受到2.3Gy中子照射后,其凝血系统在初期处于高凝状态,极期时处于低凝状态,照射后15d最为明显;凝血功能改变以内源性凝血途径为主,在病程的初期至极期纤维蛋白原含量均明显增高;血小板数量和聚集功能同时下降。照射后早期的高凝状态及毛细血管脆性和通透性增加可能是2.3Gy中子照射动物早期死亡的主要原因之一。模型制备完成后,一组动物在照射后1h内开始给予rhG-CSF 10μg/kg皮下注射,连续给药21d,结果显示小剂量rhG-CSF连续给药联合对症支持治疗可改善照射动物的生存质量,提高外周血白细胞和中性粒细胞数最低值,有效控制中子照射所致的感染症状,使中子重度骨髓型ARS比格犬全部存活(与照射对照组比较,P<0.05);此外,还发现小剂量rhG-CSF连续给药可纠正2.3Gy中子照射初期的高凝状态,缩短极期时凝血活酶生成时间,加快血凝块形成的速度,改善内源性凝血功能紊乱,下调纤维蛋白原的异常增高,改善血小板聚集功能,从而改善受照射动物初期和极期的凝血功能紊乱,这为ARS早期和极期出血的防治提供了重要线索。另一组动物在照射后0.5和24h各一次给予rhG-CSF 200μg/kg皮下注射治疗,结果发现大剂量rhG-CSF早期干预联合对症支持治疗同样可提高2.3Gy中子照射比格犬外周血白细胞和中性粒细胞最低值,促进其恢复,使中子重度骨髓型ARS比格犬全部存活(与照射对照组比较,P<0.05);还可减少外周血细胞凋亡,提高2.3Gy中子照射早期外周血有核细胞集落形成能力。此外,还发现大剂量rhG-CSF早期干预不但能减轻免疫器官的损伤,而且还可增强脾脏的免疫功能,表现为脾脏白髓数量明显增加;更重要的是,能够完全有效地促进骨髓造血功能恢复,使骨髓造血细胞的数量和密度保持在正常水平。这提示尽早将骨髓造血细胞动员入外周血可能会减轻造血细胞凋亡和坏死后对骨髓造血微环境的影响,进而有利于骨髓造血功能的恢复。最后,针对中子辐射损伤效应重的特点,本研究还系统观察了2.3Gy中子照射对比格犬非造血器官的病理组织学及功能改变,2.3Gy中子照射后动物的胃肠损伤主要为功能紊乱,结构损伤较轻。免疫系统的早期改变为细胞数量减少、脾脏和淋巴结萎缩、结构消失、免疫球蛋白生成受抑。rhG-CSF治疗可促进免疫组织的恢复,尤其是大剂量rhG-CSF治疗不但能减轻中子辐射对免疫器官的损伤,而且还可增强脾脏的免疫功能。中子-γ射线混合照射引起的肺部损伤较单纯的γ射线更为严重,但病变过程与γ射线照射基本一致。2.3Gy中子照射所致的生殖系统和肾脏损伤基本上可自行恢复。但引起的大脑皮质内细小血管周围不同程度水肿则难以恢复。2.3Gy中子照射仅在照射后早期引起心肌功能受损,未见明显病理组织学改变。综上所述,不论是小剂量rhG-CSF连续给药还是大剂量rhG-CSF早期干预均对2.3Gy中子-γ射线混合照射所致重度骨髓型ARS比格犬有明显的治疗作用,可以促进照射犬体内残留造血干/祖细胞的增殖、分化和成熟,从而加速造血功能的重建,表现为中子ARS比格犬极期外周血白细胞和中性粒细胞数最低值的升高,明显降低因白细胞数严重低下而导致的感染并发症的发生率和/或减轻其程度,提高中子ARS比格犬的活存率。
彭瑞云[6]2015年在《放射损伤的毒性病理学研究及其对诊断和防治的启示》文中研究指明【目的】放射损伤可见于临床恶性肿瘤放疗、骨髓移植放射预处理、核反应堆事故以及核辐射等,主要包括X线、γ线和中子等放射损伤,且中子放射可造成比X线和γ线更为严重的损伤。然迄今,放射损伤的敏感生物标志物和防治靶点仍未解决,其关键是放射损伤的毒性作用的分子病理机制未明。因此,开展放射损伤的毒性病理学研究对急性放射病的诊断和防治具有重要的指导意义。【材料与方法】综合运用常规病理、特殊染色病理、超微病理、免疫病理、定量病理、分子病理及分子生物学等技术,包括光镜、电镜、免疫组化、原位杂交、原位PCR、原位末端标记、基因芯片、RT-PCR、免疫印迹、免疫共沉淀、EMSA、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪和图像分析仪等,系统研究γ射线及中子照后小鼠造血、肠道和大鼠肝脏等损伤的病理特点和分子病理机制,并探讨其对急性放射性造血、肠道毒性损伤以及慢性肝纤维化的诊断和防治的启示。【结果】(1)放射性造血损伤的分子病理特点:2.5~7Gyγ射线照射后小鼠骨髓出现了明显损伤及损伤后重建现象,且在此剂量范围内,剂量越大,损伤越重,出现时间越早且恢复越慢。其基本病理改变为照后早期发生凋亡的造血细胞数目增多,而造血细胞总数减少,血管扩张,充血及出血,于后期则见骨髓造血细胞再生及恢复。其病理过程呈现造血细胞凋亡、骨髓残留、再生修复及基本恢复的病理过程。(2)放射性肠道损伤的分子病理特点:肠粘膜隐窝细胞和肠内淋巴组织中淋巴细胞凋亡、坏死,核染色质浓缩,见核碎片形成。上皮细胞脱落,粘膜剥脱;血管扩张、淤血,并见出血。其病理过程经历隐窝细胞死亡、粘膜上皮剥脱、再生恢复、基本恢复的病理过程。肠道淋巴组织病理过程经历淋巴细胞死亡、残留、再生恢复、基本恢复的病理过程。(3)放射性肝脏损伤的分子病理特点:其病理过程分为急性放射性肝炎期、肝纤维化前期、肝纤维化期及肝硬化期四个阶段。(4)中子与γ线照射后效应细胞死亡方式不同:中子照射见凋亡与坏死并存,且以坏死为主,而γ线照射则以凋亡为主。(5)骨髓和肠道放射损伤后差异表达基因涉及细胞周期调控和细胞因子合成等。(6)通过对IL-3,IL-11,GM-CSF,bFGF,TGF-β3,TNF-α,IL-2等细胞因子的研究,发现IL-11是关键性细胞因子,且通过激活IL-11R/gp130/JAK/STAT信号通路,促进放射损伤后肠上皮细胞增殖。【结论】中子与γ线照射后效应细胞不同死亡方式是中子辐射损伤难以防治的物质基础;放射性骨髓和肠道损伤后差异表达的基因可望作为放射损伤的敏感基因和防治靶标;IL-11是治疗重度以下放射病的最佳细胞因子。该研究为放射损伤的诊断和防治提供新思路和防治靶点,对放射病的诊治具有重要理论和现实意义。
王欣茹[7]2004年在《重组人白介素-11治疗中子急性放射病的实验研究》文中研究说明中子辐射可对人体造成比γ射线更为严重的出血、感染和胃肠道损伤。重组人白细胞介素-11(rhIL-11)是一种多效应细胞因子，对造血功能损伤具有明显的治疗效果，对肠道损伤也有一定的治疗作用，与其它造血因子联用对造血功能的恢复作用更显着。为了研究rhIL-11在中子急性放射病中的治疗效果，我们在国内外研究的基础上，应用骨髓细胞集落培养和流式细胞术探讨了rhIL-11对120只中子骨髓型急性放射病小鼠造血系统的刺激作用和对小肠上皮的保护作用。通过F820测定外周血象、流式细胞术测定骨髓CD34~+细胞比例、外周血CD4~+／CD8~+比值的变化、骨髓细胞CFU-GM集落培养及组织病理学方法，观察了rhIL-11与重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对180中子急性放射病小鼠和24只比格狗的治疗作用，以期为制订中子急性放射病治疗方案提供理论和实验依据，为打赢未来高科技的局部战争及处理反核恐怖事件做好医学应急准备。本课题是全军“十五”指令性课题(01L019)“中子损伤医学防护措施研究”的主要内容。 结果表明，3.5Gy中子照射小鼠照后30天rhIL-11预防组的CFU-GM、CFU-E集落数及照后35天rhIL-11治疗组各系祖细胞的集落数量均高于照射对照组，rhIL-11治疗和预防可以明显促进小鼠骨髓细胞从静止期进入细胞周期，促进造血细胞增殖；缩短了小肠细胞的增殖周期，促使小肠上皮细胞增殖加快，有利于小肠粘膜结构和功能的迅速恢复。rhIL-11预防和治疗给药能提高3.0Gy中子照射小鼠照后24hr内白细胞数、照后12d骨髓CD34~+细胞比例和照后1和33d骨髓CFU-GM的数量，明显增加30天存活率。与rhG-CSF联用有加强作用。rhIL-11可明显增加2.0Gy中子照射比格狗骨髓CD34~+细胞比例、CD4~+／CD8~+比值和CFU-GM集落数，外周血白细胞数明显升高，与rhG-CSF联合应用作用更加明显。组织病理学观察结果表明，rhIL-11与rhG-CSF联合应用明显促进骨髓造血细胞增生和脾脏免疫功能的恢复。照射对照组动物死亡3／7，死亡狗平均活存时间为15.0天，治疗组动物照射后30天全部活存。 本课题研究结果表明，rhIL-11加rhG-CSF联合适当的综合对症措施不失为目前治疗中子急性放射病的有效方法。
曹毅[8]2009年在《微波和γ射线联合照射对造血和神经系统的影响》文中研究说明目的:在细胞和机体水平研究不同剂量微波和γ射线联合照射对神经系统和造血系统的生物学效应以及低剂量微波辐射对γ射线引起的造血损伤的防护效应及机理,初步分析微波辐射对人群神经行为的影响,为探讨微波和γ射线联合作用的分子机制、微波通讯对神经系统的健康影响及低剂量微波对其他有害因素的防护效应提供基础资料。方法:原代培养的骨髓细胞分别接受单独的微波辐射、单独γ射线辐射以及微波和γ射线的联合照射,分析细胞增殖活性变化、细胞周期的变化。昆明种小鼠分别接受单独的微波辐射、单独γ射线辐射以及微波和Υ射线的联合照射,根据动物存活率、存活时间、外周血计数等客观指标的变化,建立能够有效减轻电离辐射危害的微波辐射的动物模型;采用骨髓有核细胞计数、造血干/祖细胞数量和增殖能力检测、骨髓组织病理变化观察,分析微波对电离辐射造血损伤的拮抗效应及其规律。神经胶质瘤细胞分为对照组、单独微波组、单独γ射线组以及联合暴露组。对照组不接受任何照射,单独微波组接受2mW/cm2、4mW/cm2和6mW/cm2微波辐射,联合组在微波照射后再接受5Gyγ射线照射,单独电离组只接受5Gyγ射线照射。分析不同组别细胞的生长增殖情况、细胞周期和凋亡的改变、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,分析各组细胞HSP70的mRNA和蛋白质表达情况。以原代培养的大鼠神经胶质细胞为研究对象,测定不同处理后细胞的增殖情况、凋亡情况以及ATP酶的表达。昆明种小鼠分别接受1.5mW/cm2、3mW/cm2、6 mW/cm2和9mW/cm2的900MHz微波辐射,开放场实验和避暗实验测定小鼠学习记忆功能,测定海马组织中HSP70的mRNA表达水平。选择苏州市区内某移动通讯基站周围长期定居人群作为观察组人群,对照组为非移动基站周围定居人群。对基站周围辐射水平进行测量,收集研究对象的基本情况,采用神经行为测试评价系统对基站周围人群及对照人群进行测试。结果:原代骨髓细胞实验结果:12μW/cm2的900MHz微波辐射能显着提高原代骨髓细胞的增殖活性,影响细胞周期,使G1期细胞比例明显减少(p<0.05),增殖期(S+G2/M)细胞比例显着升高。微波与γ射线联合照射对小鼠造血系统影响的动物实验结果:60Coγ射线照射前给予120μW/cm2的900MHz微波辐射能显着提高受照射小鼠的存活率(p<0.05),促进外周血白细胞恢复,提高受照射小鼠的脾脏和胸腺系数,增强γ射线照射后小鼠骨髓有核细胞(bone marrow nucleated cells,BMNCs)增殖活性,促进CFU-GM集落形成,并刺激造血生长因子GM-CSF、IL-3的表达。单独γ射线与复合照射均可导致骨髓组织经历典型的凋亡坏死、空虚、再生修复和恢复4个阶段的病理改变,但复合组的病变轻于电离组,恢复也更快。脾脏系数结果显示,照后9d、12d复合组脾脏系数显着高于电离组(p<0.05)。脾脏病理显示,脾损伤病变过程与骨髓造血组织基本相似,即早期以淋巴细胞凋亡为主,伴随脾小体不同程度的萎缩,中晚期淋巴细胞开始增生、间质纤维组织增生修复;复合组病变轻于电离组。神经细胞体外实验结果(1)4mW/cm2和6mW/cm2微波辐射组细胞增殖活性显着下降。6mW/cm2微波辐射增强电离辐射引起的细胞增殖活性下降的程度。单独微波组细胞的克隆形成率下降。4mW/cm2和6mW/cm2微波辐射增强电离辐射引起的细胞克隆形成率下降的程度。(2)单独微波辐射后,细胞凋亡率随着微波强度的增加有上升的趋势且呈直线相关,但各组间无统计学差异。4mW/cm2和6mW/cm2微波辐射增强电离辐射诱导的细胞凋亡率。微波与γ射线对细胞凋亡率存在协同促进作用。(3)各单独微波组SOD活性有上升趋势,但各组间没有统计学差异。单独微波组中,6mW/cm2微波辐射组的MDA含量上升。微波辐射能增强电离辐射引起的MDA含量上升,6mW/cm2微波辐射增强电离辐射引起的SOD活性下降。微波与γ射线对MDA含量有协同促进作用,对SOD活性的抑制有加强作用。(4)单独微波照射后,HSP70的表达有上升的趋势,但各组间无统计学差异。γ射线照射后HSP70表达显着下降。微波和γ射线对细胞HSP70的表达无交互作用。(5)大鼠原代神经胶质细胞的增殖活性经微波、γ射线和联合照射处理后,与对照组相比均没有统计学差异,仅γ射线组和联合组有下降的趋势。各处理组均无明显凋亡发生。γ射线使ATP酶的活性显着升高。电磁辐射对神经行为影响的动物实验结果:(1)与对照组相比,1.5 mW/cm2组、6 mW/cm2组、12 mW/cm2组小鼠活动的总路程和活动时间增加,休息时间缩短,潜伏期明显缩短,错误次数增加(p<0.05)。但是3 mW/cm2组小鼠各指标没有显着变化。(2)各照射剂量微波辐射均未引起小鼠海马组织出现病理性改变。(3)与对照组相比,1.5 mW/cm2组、6 mW/cm2组、12 mW/cm2组小鼠海马组织中Hsp70 mRNA表达增加(p<0.05),但是S3组小鼠海马组织Hsp70 mRNA表达没有显着差异。人群调查结果:(1)基站周围电磁辐射强度未超过国家标准规定的一级标准。(2)调查结果显示,观察组和对照组人群在神经衰弱症状方面无显着性差异,未观察到移动基站微波辐射引起神经衰弱症候群发病率的增高。但随着暴露时间(居住年限)的延长,头痛、头晕、记忆力减退这叁项指标的异常率有所增高(p<0.05),说明移动基站微波辐射对人体的健康危害与暴露时间仍有一定的关联。(3)观察组情感状态测试中紧张-焦虑、忧郁-沮丧、愤怒-敌意、疲惫-惰性和半结构投射实验中思、怒、惊得分显着高于对照组(p<0.05),心算、记忆扫描、连续识别、数字检索、曲线吻合等项目得分显着低于对照组(p<0.05),其中记忆扫描、连续识别、数字检索、目标追踪与居住年限呈负相关(p<0.05)。结论:1.低剂量的微波辐射可在一定程度上减轻γ射线对小鼠造血系统的急性损伤。低剂量微波预处理可刺激造血因子表达,促进骨髓造血细胞(尤其是粒系细胞)增殖,减轻γ射线对造血细胞的增殖抑制作用,同时降低损伤细胞的凋亡率,从而促进造血重建。2.在细胞水平上,微波和γ射线对人神经胶质瘤细胞的增殖抑制和氧化损伤有协同作用。联合照射对大鼠原代神经胶质细胞的增殖和凋亡无明显影响,仅可使ATP酶活性增高。在动物整体水平上,微波辐射可引起小鼠学习记忆能力下降和神经行为改变,并导致海马组织热休克反应。3.人群调查发现,基站微波辐射可影响附近居民的情感状况、智力、记忆学习、感知和心理运动神经行为的能力,导致负性情绪增加;随着时间的延长,神经衰弱相关症状的异常率有所增高。提示微波辐射对居民健康的影响不容忽视。
李宁[9]2008年在《骨髓间充质干细胞对肠辐射损伤的修复作用》文中进行了进一步梳理骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是从骨髓细胞分离出来的一种骨髓基质非造血干细胞,具有很强的自我更新和多向分化的潜能,可以分化为多种间充质组织,并可促进间充质组织的再生。它容易分离获得,可在体外大量扩增且仍保持增殖与分化潜能。此外,MSCs还具有归巢的特性,炎症对其有趋化作用,容易归巢到炎症、损伤部位。因此,MSCs被认为是修复组织损伤的理想种子细胞。辐射损伤发生在临床肿瘤患者的放疗及核恐怖、核事故中,人体中细胞更新、代谢快的组织对辐射尤为敏感,如造血组织、肠道组织。目前直接针对辐射所致的肠道组织损伤尚缺乏有效的治疗方法。辐射导致肠道组织的严重损伤,使消化道的物理屏障和免疫屏障功能丧失,以致肠腔内毒性物质和细菌进入血循环和组织,引起感染,最后甚至导致多器官功能衰竭、死亡,在患者死亡中起决定性作用。已有研究表明MSCs可修复心肌、肌肉、神经等多种组织的损伤,但对修复肠辐射损伤方面的报道还较少。有学者观察到,将绿色荧光蛋白标记的MSCs移植到全身照射的动物模型中可在损伤的肠道等组织检测到,说明MSCs能够迁移定居到损伤的肠道组织。基于以上研究结果我们设计了本课题,首先制备一个肠辐射损伤的模型,通过移植体外扩增、培养的骨髓MSCs,观察MSCs对肠辐射损伤的修复作用。目的:通过建立小鼠肠辐射损伤模型,观察小鼠骨髓来源的间充质干细胞在小鼠肠道辐射损伤修复中的作用。方法:1.SPF级6-8周龄C57 BL/6小鼠,本实验中,辐射损伤模型制备为雌性C57BL/6小鼠,体外细胞培养、移植观察全部用雄性C57 BL/6小鼠。2.利用MSCs体外贴壁生长的特性,体外培养C57 BL/6雄性小鼠的骨髓MSCs获得较纯的骨髓MSCs,通过诱导其向脂肪细胞、成骨细胞分化的方法进行鉴定。3.将受鼠C57 BL/6雌性小鼠随机分成照射对照组(组Ⅰ)、骨髓单个核细胞组(组Ⅱ)和骨髓MSCs+骨髓单个核细胞组(组Ⅲ),给予13.5Gy~(60)Coγ射线全身致死量照射建立肠辐射损伤模型,组Ⅰ不做处理,组Ⅱ2h内通过尾静脉移植C57 BL/6雄性小鼠的骨髓单个核细胞10~6/ml,组Ⅲ2h内通过尾静脉移植骨髓MSCs10~6/ml和骨髓单个核细胞10~6/ml。观察各组小鼠生存时间、4周的生存率、病理切片等指标,并用PCR检测雌性受鼠体内Y染色体的sry基因,确定供体干细胞的植入情况。4.应用SPSS11.5软件分析数据,结果用均数±标准差((?)±SD)或百分率表示,样本均数间比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA),多重比较采用LSD(Lest-significant Difference)法。以Kaplan生存曲线描述各组小鼠生存时间。P≤0.05为差异有统计学意义。结果:1.予13.5Gy~(60)Coγ射线全身致死量照射后小鼠出现明显的脱毛,弓背,消瘦,活动明显减少,对刺激反应减弱。取其小肠组织作病理切片,大体观察见其肠壁明显变薄,肠系膜充血、淤血,肠粘膜充血。HE染色后光镜下可见大片小肠黏膜上皮细胞坏死崩解,胞核肿胀淡染,上皮广泛坏死剥脱,绒毛萎缩短秃,大量炎症细胞侵润,未见新生的腺窝细胞,符合肠损伤标准。2.小鼠骨髓MSCs原代细胞培养48h后,首次换液,去除悬浮细胞,倒置显微镜下课件细胞贴壁,多呈圆形,培养至7-8d时,细胞呈梭形,可见大小不一的细胞克隆,呈漩涡状生长,培养至10-11d时,细胞融合成单层,排列具有方向性,待细胞达80%融合时,即可传代,传代后细胞增迅速,杂质细胞也进一步被清除。在成脂诱导液加入后72h,细胞中开始出现小脂滴,主要集中于细胞核周围,随着诱导时间延长,脂滴逐渐聚集成大的脂泡,油红0染色可见脂滴呈深橙红色。在成骨培养基中维持培养25d左右,出现明显高于周围细胞表面的骨结节样结构,茜素红染色显示出明显的红色钙结节。3.组Ⅰ的10只小鼠均于照射后7d死亡,平均生存时间为4.20天(4.20±0.79),生存率0/10。组Ⅱ的10只小鼠除2只于移植后7d死亡,其余均于移植后2周内死亡,平均生存时间为11.00天(11.00±2.31),生存率0/10。组Ⅲ的10只小鼠中只有2只于28d内死亡,其余存活时间超过了28d(视为长期存活),平均生存时间为27.20天(27.20±1.75),生存率8/10。采用单向方差分析比较各组间平均生存时间,差异有统计学意义(F=464.232,P＜0.001),采用LSD法分别比较组Ⅲ、组Ⅱ、组Ⅰ的生存时间,差异有统计学意义(P＜0.001)。病理切片显示组Ⅱ小鼠肠道黏膜损伤严重,与组Ⅰ比较无明显修复现象,而组Ⅲ小鼠肠道黏膜结果基本正常,损伤有明显修复现象。PCR检测组Ⅲ小鼠小肠细胞内有Y染色体特异性序列的存在,而检测组Ⅱ各小鼠的此基因片段均为阴性,证实雄性小鼠骨髓MSCs参与了受体小鼠的肠道修复。结论:1.给予C57 BL/6小鼠13.5Gy~(60)Coγ射线全身致死量照射后可制备出可靠的肠损伤动物模型。2.应用密度梯度离心、贴壁培养法相结合的方法可以获得较纯的骨髓MSCs。3.骨髓单个核细胞移植仅能恢复造血损伤,加用骨髓MSCs除可修复造血损伤外还可修复肠道辐射损伤,为骨髓MSCs用于修复肠道辐射损伤提供了实验依据。
张永芹[10]2011年在《耐辐射菌PprI蛋白的制备及其对小鼠急性辐射损伤作用的研究》文中认为目的:耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)(简称DR)是一种对电离辐射,紫外线,强氧化剂和化学诱变剂具有超强耐受力的极端微生物,是迄今为止地球上发现的抗辐射能力最强的生物之一。最近研究表明,负责这一抗性的开关基因—pprI基因在DNA损伤修复中起着极为重要的作用。pprI基因可作为一个保护开关基因诱导DNA修复基因如recA和pprA的表达,在提高细胞抗氧化能力方面,也可能通过调控过氧化氢酶的表达活性来提高抗H2O2的能力。我们近年的研究表明,pprI基因转染对哺乳动物中子和γ射线急性放射损伤具有显著的防治作用。然而,基因转染用于放射损伤的防治存在一定的困难和局限性。因此,本课题进一步研究pprI基因原核表达系统的构建、PprI蛋白的表达及其纯化,并将其注入受照小鼠体内,研究PprI蛋白对小鼠γ射线急性放射损伤的防治作用。耐辐射球菌pprI基因表达的PprI原核蛋白对真核生物的抗放作用,迄今尚未见国内外文献报道。材料与方法:以我们已获得国家发明专利的pCMV-HA-pprI质粒为模板,构建重组原核表达质粒pET-28a-His-pprI,并转化入E. coli BL21(DE3)RP。IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。然后采用His-Bind树脂和分子筛两步法进行蛋白纯化,获得纯化的耐辐射球菌PprI融合蛋白。将PprI融合蛋白注射入ICR小鼠体内,并对PprI蛋白注射组与生理盐水注射组分别用γ射线进行照射,观察急性放射损伤小鼠的血细胞数目和淋巴细胞百分比,应用流式细胞仪检测骨髓细胞、胸腺及脾脏淋巴细胞的凋亡率,采用CCK8检测骨髓细胞、胸腺及脾脏淋巴细胞的增殖率,以期探讨PprI蛋白对γ射线辐射损伤小鼠的抗放作用。结果:本课题成功构建了pET-28a-His-pprI原核表达载体,SDS-PAGE和Western blot证实表达产物确为6×His-PprI融合蛋白,相对分子质量约为37KD。纯化后获得了耐辐射球菌PprI融合蛋白。PprI蛋白于小鼠γ射线照射前1天、照射当天和照射后3天以100μg/kg的剂量肌肉注射入小鼠体内。在小鼠照后28天的观察期间内,由外周血象观察可见,PprI蛋白注射组小鼠外周血血小板总数在照后第7天为482.75×109/L,显着高于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);外周血淋巴细胞百分比在照后第1天为41.00%,第7天为47.25%,均显着高于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);由细胞凋亡检测可见,PprI蛋白注射组脾细胞凋亡率在第1天为13.43%,第14天为24.85%,均显着低于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);胸腺细胞凋亡率在第14天为8.86%,第28天为6.21%,均显着低于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);骨髓细胞凋亡率在第1天为10.70%,第14天为18.74%,第28天为5.31%,均显着低于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);由细胞增殖检测可见,PprI蛋白注射组脾细胞A450值在第14天为0.647,第28天为1.827,均显着高于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);胸腺细胞A450值在第7天为0.340,显着高于生理盐水注射组小鼠(P<0.05);骨髓细胞A450值在第14天为0.539,显着高于生理盐水注射组小鼠(P<0.05)。结论:1.成功构建了耐辐射菌pprI基因的原核表达质粒pET-28a-His-pprI,并在E. coli中有效表达PprI融合蛋白,经纯化定量获得较大量蛋白质。2.初步探索出较合适的PprI蛋白剂量及给药方法:100μg/kg,肌肉注射。3. PprI蛋白注射可显着减轻γ射线急性损伤小鼠血小板和淋巴细胞的下降程度。4. PprI蛋白注射可显着降低γ射线急性损伤小鼠骨髓细胞、胸腺和脾脏淋巴细胞的凋亡率。5. PprI蛋白注射可显着提高γ射线急性损伤小鼠骨髓细胞、胸腺和脾脏淋巴细胞的增殖率。6.本文研究结果提示,PprI原核蛋白注射对哺乳动物急性放射损伤具有较好的防治作用,为进一步用于各种核突发事件大剂量电离辐射引起的急性辐射损伤的防治提供了有价值的实验资料。
参考文献：
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[4]. IL-11对中子辐射后小鼠骨髓损伤的防治作用及其机制研究[D]. 韩瑞刚. 中国人民解放军军事医学科学院. 2006
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[8]. 微波和γ射线联合照射对造血和神经系统的影响[D]. 曹毅. 苏州大学. 2009
[9]. 骨髓间充质干细胞对肠辐射损伤的修复作用[D]. 李宁. 南方医科大学. 2008
[10]. 耐辐射菌PprI蛋白的制备及其对小鼠急性辐射损伤作用的研究[D]. 张永芹. 苏州大学. 2011