中国葫芦科作物病毒的分布、多样性及进化研究

论文摘要

葫芦科作物是我国重要的经济作物。在中国28种以上病毒侵染为害葫芦科作物,每年可造成高达300亿元人民币的损失。随着全球气候变暖,国际贸易交流频繁,种植地域的扩张以及种植模式的多样化,侵染葫芦科作物的病毒病种类发生报道也逐年增加。本研究调查全国西瓜和甜瓜的主要产区的病毒病的发生情况并采集疑似病毒样本应用二代测序技术（next-generation sequencing,NGS）结合常规检测方法鉴定和检测病毒种类;鉴定了2种葫芦科作物上新发生的马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒;鉴定了1种侵染西葫芦的马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）新病毒;对4种常见的病毒进行系统进化和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）分析,本文取得如下主要结果:（1）明确了中国葫芦科作物病毒种类与分布。调查了华南沿海冬季产区,长江以南丘陵产区,华中平原优势产区,西南坡地和山区种植区以及西北旱地优势产区为代表的9个省份,31个区县,52块种植地块的以西瓜和甜瓜为主的葫芦科作物上病毒病发生情况。共采集了288份疑似病毒样本,其中西瓜109份,甜瓜95份,南瓜57份,其他葫芦作物共27份。初步比较了小RNA测序（Small RNA sequencing,sRNA-seq）和去核糖体RNA测序（Ribo-minus RNA sequencing,rmRNA-seq）技术应用于鉴定和检测病毒的差异。应用NGS测序技术和常规检测技术检测到12个属22种病毒,其中已知病毒种21个,新病毒种1种。以病毒核酸类型分类比较,正单链RNA病毒（Positive-sense single-stranded RNA virus,+ssRNA virus）占优;以病毒属分类比较:马铃薯Y病毒属占优;以病毒种分类比较:小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus）占优;以田间传播类型分类比较:以蚜虫传播方式占优;以侵染单个样本的病毒数量分类;单个病毒侵染样本数量占优。比较分析了不同葫芦科作物中检出病毒的种类与分布差异。比较分析了不同种植地区病毒发生与分布情况,其中明显差异是华南地区以蓟马传播病毒种类占优,而其他地区均是以蚜虫传播方式占优。（2）明确了小西葫芦虎纹花叶病毒和番木瓜畸形花叶病毒的生物学特性和基因组信息。在NGS和RT-PCR鉴定的基础上,测定了小西葫芦虎纹花叶病毒（zucchini tigre mosaic virus）和番木瓜畸形花叶病毒（papaya leaf distortion mosaic virus）的全基因组序列,分析了其基因组特性。ZTMV是一种重组病毒;PLDMV与目前报道的番木瓜株系基因组水平差异较大。通过重组融合方法成功构建了ZTMV和PLDMV侵染性克隆,从多种病毒复合侵染样本中获得2种病毒3个分离物纯化病毒材料并验证了其侵染性和传毒能力。测定了2种病毒4个分离物的寄主范围以及在不同葫芦科作物上的症状表现。（3）发现和鉴定一株马铃薯卷叶病毒属新病毒。我们鉴定了新疆维吾尔族自治区阜康市西葫芦上的一株马铃薯卷叶病毒属新病毒命名为小西葫芦蚜传黄化病毒（zucchini aphid-borne yellows virus）。测定该病毒的全长基因组序列5792nt并分析其基因组符合马铃薯卷叶病毒属病毒基因组特性。通过多重比对,系统进化和重组分析明确该病毒由同属的鹰嘴豆褪绿丛矮病毒（chickpea chlorotic stunt virus）与芜菁黄化病毒（turnip yellow virus）,芸苔黄化病毒（brassica yellows virus）进化关系较近的未知病毒重组而来的新病毒。（4）明确了4种常见葫芦科作物病毒的进化特征,发现了一些新类群。基于NGS测序数据获得病毒的近似全长基因组序列用于4种主要病毒系统进化分析。来自本研究的黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus）全基因组序列遗传多样性不高都属于ⅠB亚组,检测到可能的重配现象;ZYMV的遗传多样性丰富,发现一个区别已报道所有ZYMV分离物的新组,提出ZYMV系统进化可能与地理位置相关性的假设;基于西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus）全基因组序列系统进化关系重新规划了病毒群体的系统进化关系;基于番木瓜花叶病毒（papaya ring spot virus）全基因组序列系统进化分析,定义1个PRSV新组,讨论了PRSV系统进化与寄主和地理位置的相关性。基于NGS数据结合生物信息学方法对4种主要病毒基因组的SNP分析。本论文研究通过大量采集以西瓜甜瓜为主的葫芦科病毒病害样本,通过NGS,结合常规检测方法,明确了中国葫芦科作物病毒发生的种类与分布,建立了中国葫芦科病毒组;鉴定了2种新发生病毒、1种病毒新种;分析了4种常见病毒的进化特征,发现了一些类群。这些研究结果,丰富了对中国乃至世界葫芦科病毒发生与分布的认识,有利于病毒病害的防控。

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Abstract

缩略语表

第一章文献综述

1.1 引言

1.2 侵染葫芦科作物的病毒种类

1.3 中国葫芦科作物发生现状

1.3.1 布尼亚病毒目

1.3.2 小RNA病毒目

1.3.3 芜菁黄花叶病毒目

1.3.4 混合病毒科

1.3.5 雀麦花叶病毒科

1.3.6 长线型病毒科

1.3.7 内生病毒科

1.3.8 双生病毒科

1.3.9 黄症病毒科

1.3.10 双分病毒科

1.3.11 马铃薯Y病毒科

1.3.12 番茄丛矮病毒科

1.3.13 植物杆状病毒科

1.4 主要葫芦科作物病毒的遗传多样性研究

1.4.1 番茄斑萎病毒属遗传多样性

1.4.2 黄瓜花叶病毒遗传多样性

1.4.3 马铃薯卷叶病毒属遗传多样性

1.4.4 马铃薯Y病毒属遗传多样性

1.4.5 甜瓜坏死斑点病毒遗传多样性

1.5 应用高通量测序技术鉴定植物病毒及遗传变异的研究进展

1.5.1 应用NGS于植物病毒鉴定的测序方法

1.5.2 植物病毒组数据分析

1.5.3 NGS测序应用园艺作物病毒检测和鉴定

1.6 技术路线与研究目的和意义

第二章中国葫芦作物病毒种类与地理分布特点

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 病毒样本采集

2.2.2 研究方法

2.3 结果与分析

2.3.1 中国葫芦科作物病毒田间样品采集

2.3.2 两种不同NGS测序方法的鉴定植物病毒初步比较

2.3.3 中国葫芦科作物病毒发生种类

2.3.4 中国主要产区间病毒种类和传毒方式比较

2.4 讨论

第三章小西葫芦虎纹花叶病毒和番木瓜叶畸形花叶病毒侵染性克隆的构建和生物学特性研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 研究材料

3.2.2 研究方法

3.3 结果与分析

3.3.1 ZTMV和 PLDMV田间症状以及VirusDetect组装contig结果

3.3.2 ZTMV和 PLDMV全基因组特性及系统进化分析

3.3.3 ZTMV和 PLDMV侵染性克隆构建与生物学鉴定

3.4 讨论

第四章 1种侵染西葫芦的马铃薯卷叶病毒属病毒的发现鉴定

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 病毒材料来源

4.2.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.3.1 血清学和RT-PCR检测

4.3.2 NGS测序结果分析

4.3.3 ZABYV基因组特性

4.3.4 ZABYV基因组的系统进化和重组分析

4.4 讨论

第五章中国主要葫芦科作物病毒的系统进化与SNP变异初步分析

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 NGS数据中获取病毒全基因组序列

5.2.2 系统进化分析

5.3 结果与分析

5.3.1 CMV系统进化分析

5.3.2 ZYMV的系统进化分析

5.3.3 WMV的系统进化分析

5.3.4 PRSV系统进化分析

5.3.5 CMV,ZYMV,WMV和 PRSV的 SNP分析

5.4 讨论

第六章全文结论及展望

6.1 全文结论

6.2 下一步研究展望

参考文献

附录 Ⅰ 葫芦科作物病毒名录

附录 Ⅱ 本研究用于RT-PCR检测于鉴定的引物

附录 Ⅲ 采样地理信息表

附录 Ⅳ 病毒样本信息以及检测结果

附录 Ⅴ 作者简介

附录 Ⅵ 研究生期间已发表论文

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 彭斌

导师: 古勤生,洪霓

关键词: 葫芦科作物,病毒病,分布,多样性,系统进化

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,植物保护

单位: 华中农业大学

基金: 国家西甜瓜产业技术体系(CARS-26-13),中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ASTIP-2017-ZFRI),河南省基础与前沿项目(152300410138)

分类号: S432.41

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000070

总页数: 154

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