导读:本文包含了蛋白质磷酸酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:低分子量蛋白质酪氨酸磷酸酶,天然产物,薄荷,应激反应
蛋白质磷酸酶论文文献综述
周琳[1]（2019）在《应用线虫模型研究低分子量蛋白质酪氨酸磷酸酶在应激反应中的作用机制及抗应激天然产物的筛选》一文中研究指出低分子量蛋白质酪氨酸磷酸酶(low molecular weight protein tyrosine phosphatase,LMW-PTP)是一种结构不典型的蛋白质酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTPs),在PTPs家族中被单独分成一类,进化上高度保守,广泛表达于多种生物中,包括植物、原核生物和古细菌等。天然产物在自然界中含量丰富,是重要的药物宝库,在药物开发领域得到了广泛的研究。秀丽线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)是一种优秀的模式生物,具有繁殖能力强、生命周期短、虫体小易操作、通体透明便于观察、可在液氮中长期冻存、细胞谱系已完全确定等优点。同时,线虫有许多在进化上高度保守的信号通路,与人类基因同源性达60%~80%。线虫lmwptp基因与人类acp1基因同源,经计算机结构模拟得知两者蛋白质叁级结构极为相似,因此推测两者生物学功能及作用机制具有相似之处。应激反应是生物体对抗外界刺激所发生反应的总称,随着自然环境的恶化及生活节奏的加快,人们受到体内外刺激的种类和频率逐渐增多,这些刺激会破坏机体氧化和抗氧化系统之间的平衡,影响生物体的日常行为和健康,导致多种疾病的发生,因此生物抗应激的预防及治疗日益受到重视。本文应用线虫模型研究了LMW-PTP在应激反应中的作用机制,并对抗应激天然产物进行了筛选。首先,本文成功构建了用于线虫lmwptp RNAi的pPD129.36-lmwptp质粒并诱导表达,通过免疫家兔成功制备出线虫LMW-PTP多克隆抗体,通过qPCR和Western Blot两种方法证明了lmwptp RNAi的有效性。其次,本文检测了lmwptp RNAi对线虫一般生理指标的影响,发现lmwptp RNAi不影响线虫的寿命、产卵数、吞咽频率、体长,但lmwptp RNAi后第7天的线虫出现了一种特殊运动状态,线虫除了在培养基平面上做正弦曲线运动外,还在垂直方向“抬头”和/或“翘尾”;lmwptp RNAi后线虫体内脂肪含量明显增多,这一现象的产生与lmwptp RNAi后降低一些脂肪分解基因如acdh-1、acs-2的表达量和升高一些脂肪合成基因如fat-6、mdt-15、pod-2、elo-5的表达量有关;并且lmwptp RNAi明显提高了线虫的应激抵抗性,包括热应激、紫外辐射应激和氧化应激抵抗性。然后,本文进一步探究了LMW-PTP在热应激反应中的作用机制,发现lmwptp RNAi可降低线虫体内活性氧簇(reactive oxygen specie,ROS)水平,提高线虫体内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,减少线虫体内脂褐素累积量,LMW-PTP负调控线虫应激抵抗性的作用与类胰岛素信号通路有关,LMW-PTP可能作用于DAF-2,进而改变类胰岛素信号通路下游转录因子DAF-16和HSF-1的细胞核转位及两者下游靶基因的表达量。接下来,本文应用线虫模型对50种天然产物的抗紫外辐射功能进行了筛选,由于薄荷水提物抗紫外辐射的作用效果稳定,因此本文进一步探究了薄荷水提物提高线虫紫外辐射抵抗性的原因,发现薄荷水提物可以降低紫外辐射后线虫体内ROS含量和提高SOD活性,并且这种作用与类胰岛素信号通路有关,薄荷水提物可以促进DAF-16细胞核转位并增加其下游靶基因sod-3、hsp-12.6、hsp-16.1、hsp-16.49的表达量。最后,本文探究了薄荷中的水溶性成分香蜂草苷在线虫抵抗紫外辐射应激过程中的作用和机制,发现了0.1 mM香蜂草苷可以延长线虫寿命,提高线虫抵抗紫外辐射应激、35°C热应激、胡桃醌氧化应激的能力,并且可以降低紫外辐射后线虫体内ROS水平并且提高SOD活性,其提高线虫紫外辐射应激抵抗性的作用与类胰岛素信号通路有关,香蜂草苷可能作用于该通路上游的DAF-2来发挥作用,进而促进DAF-16的细胞核转位,增加下游基因sod-3和hsp-16.2的表达量。综上所述,本文应用线虫模型研究了低分子量蛋白质酪氨酸磷酸酶的生物学功能,着重研究了其在应激反应中的作用机制,并对50种天然产物水提物的抗紫外辐射功能进行了筛选,着重研究了薄荷水提物及其水溶性成分香蜂草苷提高线虫紫外辐射抵抗性的作用机制。本文不仅发现了PTPs家族的新功能,还为抗应激药物的设计和开发提供了理论依据,具有一定的市场前景和社会意义。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-06-01）
王露[2]（2019）在《线虫蛋白质酪氨酸磷酸酶PRL在胰岛素信号传导通路中作用机制的研究》一文中研究指出PRL(The phosphatase of regenerative liver)是一种双特异性酪氨酸磷酸酶,可与酪氨酸残基和丝氨酸/苏氨酸残基相互作用使其脱去磷酸基团,PRL家族成员都携带保守的蛋白质酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatases,PTPs)催化基序,发挥去磷酸化作用。越来越多的证据表明,与早期癌症或相关的健康组织相比,PRLs在转移病灶和晚期肿瘤中表达较高,PRLs表达水平过高通常与患者预后不良相关,另外还发现PRLs在肿瘤血管生成和内皮细胞迁移中可能也起到关键性作用,但PRLs的致病机制至今尚不清楚。人体有叁种PRL,而秀丽隐杆线虫体内只有一种,这为PRL的RNAi实验操作提供了方便。之前的研究发现cPRL(Caenorhabditis elegans’PRL)在线虫L2和L3时期表达较多,cPRL RNAi后线虫的寿命明显延长,针对这一显着特征,本文以秀丽隐杆线虫为模式生物,利用RNAi技术,通过喂养表达cPRL dsRNA的E.coli HT115的方法,敲低秀丽隐杆线虫体内PRL的表达,来探究PRL调控秀丽隐杆线虫寿命的作用机制。已知线虫寿命的调控方式主要有叁种,一是抑制胰岛素信号的传递,二是激活SIR-2.1,这两条通路相互独立,通过不同的方式激活DAF-16并延长寿命,第叁种方式是通过饮食限制。已经报道cPRL RNAi之后,线虫的吞咽频率不受影响,所以接下来的研究主要从前两个方面进行。首先,cPRL在线虫L2和L3时期表达较多,可能调控线虫的发育。本文分别从孵化时期和成虫时期开始进行cPRL基因干扰,结果显示在这两种处理方式下秀丽隐杆线虫的寿命均延长,而且延长率相差不大,说明cPRL对秀丽隐杆线虫寿命的调控作用很有可能发生在成虫之后。接着,本文选用了胰岛素信号转导通路所涉及的基因daf-2、age-1、akt-1、akt-2和daf-16的突变体以及基因sir-2.1的突变体进行cPRL干扰,发现除了daf-16以外,daf-2、age-1、akt-1、akt-2和sir-2.1基因功能分别缺失的条件下,cPRL活性降低,对应突变体的寿命均可延长,而且延长率都在10%以上,因此,本文认为cPRL活性水平降低影响线虫寿命的作用与DAF-16的活性有关。针对上述情况,本研究对秀丽隐杆线虫体内DAF-16的定位情况进行观测,发现成虫后,随着时间的推移,实验组线虫体内的DAF-16进入细胞核的比例逐渐增加。因此本研究猜测,当cPRL活性减弱时,细胞质中调控DAF-16活性的通路被激活,从而引起DAF-16转移到细胞核,引发长寿相关基因的表达。细胞核内DAF-16调控的基因有很多,其中包括抗应激相关的基因。于是本文首先选用野生型秀丽隐杆线虫的幼虫和成虫分别进行热应激实验,发现cPRL基因干扰的幼虫不具有抗热应激的能力,而成虫具有抗热应激的能力。随后,紫外辐射实验发现,cPRL活性减弱不能增强成虫抵抗紫外辐射的能力。本论文通过RNAi的方式进一步探究了秀丽隐杆线虫PRL的作用机制,初步确定cPRL活性减弱延长线虫的寿命是通过调控DAF-16从细胞质转移到细胞核的方式,并且cPRL基因沉默的成虫具有抵抗热应激的能力,为进一步明确PRL在人类相关疾病中的致病机理奠定理论基础,为治疗相关的疾病提供新的药物靶点,同时也表明秀丽隐杆线虫可以作为进行PRL基础研究及其靶向药物研究的优秀生物模型。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-05-01）
孙明轩[3]（2019）在《应用小鼠模型研究蛋白质酪氨酸磷酸酶PTP1B突变体的功能》一文中研究指出随着时代的进步,人类生活的条件得到了极大的改善,食物的充足和工作的智能化使人类的生存压力几乎可以忽视,大量高热量食品的摄入和低运动量的生活状态伴随而来的就是威胁人类健康的糖尿病(Diabetes mellitus)和肥胖(Obesity)问题。糖尿病患者患病初期都伴有不同程度的肥胖,肥胖人群患糖尿病的几率也大比例超过正常体重的人群。糖尿病和肥胖患者同时也是心血管疾病的高危人群,也会出现其他脏器组织的慢性损伤,例如慢性肾病、关节炎、眼部疾病等,久病不治会直接威胁生命。如何预防和治疗糖尿病以及科学控制体重的方式成为全球性的热门研究课题。糖尿病和肥胖主要影响因素是饮食习惯、器官病变造成的能量代谢失衡,主要表现为持续的高血糖症。生理功能正常的肥胖患者可以通过控制饮食,减少热量摄入和增加运动量的简单方式来减轻体重。生理功能异常导致的肥胖和糖尿病的病理机制将是我们的研究重点。蛋白质酪氨酰磷酸化是维持许多细胞功能的基础,包括基因表达、细胞生长、分化、迁移、粘附和凋亡。细胞中蛋白酪氨酰磷残基的酸化净水平通过蛋白酪氨酸激酶(PTK)的磷酸化作用和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的去磷酸化作用共同调节达到一种稳态的平衡。保持细胞酪氨酰磷酸化的稳态控制是极其重要的,这些过程的失调通常导致各种病理生理状况的发展,包括癌症,代谢,神经元和免疫疾病。在PTP家族中PTP1B是大家公认的Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)和肥胖症的治疗相关的关键治疗靶标。本文研究的重点就是应用基因突变小鼠模型,研究PTP1B催化活性位点失活在生理上对小鼠血糖水平的影响及作用机制,以期进一步解释PTP1B的生理功能。我们应用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别获得PTP1B活性位点突变的两种基因修饰小鼠,通过观察小鼠的表型,体重分析,葡萄糖耐受型实验,胰岛素敏感性实验,及观察组织切片,蛋白质免疫印迹实验,证明了PTP1B对胰岛素信号通路的负调节作用,PTP1B活性位点的突变将导致小鼠细胞中胰岛素敏感性增强。经过长期的观察并未发现C215S和D181A这两个点突变对小鼠带来任何负面影响,包括表观形态和内脏器官组织等。突变体小鼠可以正常生长繁殖,生活状态与野生型并无差异。经过长期监测模型小鼠的体重发现突变体小鼠具有降低肥胖风险的优点。当模型小鼠受到外界刺激,例如腹腔注射葡萄糖或胰岛素,突变体小鼠比野生型小鼠具有更高的胰岛素敏感性,更加直接的说明了PTP1B在降血糖过程中起到负调节作用。虽然表观性状和脏器组织没有表现出不良或好的差异性,但是PTP1B在胰岛素信号通路和瘦素信号通路中的重要作用是毋庸置疑的,我们需要密切关注突变体小鼠的各项指标,期待新的发现。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-05-01）
肖林,饶晓花,郑晶琼,顾衍[4]（2018）在《pH值域和亮氨酸丰富重复蛋白质磷酸酶蛋白1与喉鳞癌转移的相关性及作用机制研究》一文中研究指出目的观察PHLPP1与喉鳞癌的相互作用,为寻找新的诊治靶点提供数据支撑。方法以80例喉鳞癌患者为研究对象,包括转移组30例和未转移组50例,采用免疫蛋白印记(WB)实验检测PHLPP1蛋白表达水平。并通过RNA干扰实验构建PHLPP1过表达和干扰重组慢病毒载体,分别转染至HEP-2细胞共培养,观察细胞生长、迁移与侵袭能力,采用荧光定量PCR实验和WB实验测定细胞PHLPP1和P-AKT/AKT表达水平。结果转移组PHLPP1蛋白表达水平低于未转移组,未转移组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。PHLPP1过表达组细胞生长速率、迁移和侵袭数目低于对照组,而PHLPP1沉默组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。PHLPP1过表达组P-AKT/AKT mRNA与蛋白表达水平低于对照组,而PHLPP1沉默组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PHLPP1与喉鳞癌的发生与转移密切相关,可抑制喉鳞癌细胞的增殖与侵袭能力,且其作用可能与阻碍AKT磷酸化激活有关。(本文来源于《中国卫生检验杂志》期刊2018年14期）
刘少伟,姜欢,王晓龙,李梦红,陈玉[5]（2018）在《兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用》一文中研究指出目的:采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP-oc)多克隆抗体并鉴定其性能。方法:将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21(DE3)中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果:成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32 000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论:成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。(本文来源于《吉林大学学报(医学版)》期刊2018年03期）
胡威严[6]（2018）在《蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTPs)对PD-1和PZR的ITIM/ITSM结构域去磷酸化的研究》一文中研究指出蛋白质酪氨酸的磷酸化调节是生物体中蛋白质发挥功能和进行信号转导的基本方式,该过程受蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)和蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTPs)共同调控。蛋白质酪氨酸磷酸酶在细胞信号传导通路中发挥重要作用,是信号酶的一个大家族,它的功能是从靶蛋白的磷酸化酪氨酸残基上除去磷酸基团从而改变靶蛋白的功能。髓鞘P_0蛋白相关蛋白(PZR)是一个跨膜型的免疫球蛋白超家族的成员,是酪氨酸磷酸酶SHP-2的特异性结合蛋白和底物。PZR胞内含有两个具有酪氨酸磷酸化位点的免疫抑制基序(ITIM),通过招募SHP-2完成下游的信号传导,在调控细胞的周期和迁移等方面发挥重要作用。程序性死亡受体1(PD-1)也是一个跨膜型免疫球蛋白,胞内区含有1个ITIM和1个免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM),其中被认为是关键功能区的ITSM中的酪氨酸残基可被磷酸化并招募胞内的磷酸酶,引发抗原抗体复合物的去磷酸化。研究表明,配体PD-L1与PD-1结合后,SHP-2通过PD-1胞内的ITIM/ITSM被募集到细胞膜上,负调控下游信号传导通路,进而导致免疫相关疾病的发生。虽然目前对ITIM/ITSM招募磷酸酶的过程有了一定的了解,但是,我们对ITIM/ITSM本身的磷酸化调控机制还知之甚少。研究发现,Src激酶家族可催化ITIM/ITSM中酪氨酸残基的磷酸化,进而募集SHP-2并引起下游蛋白激酶的去磷酸化,抑制下游AKT、ERK等信号通路的活化。然而,ITIM/ITSM的去磷酸化过程仍然未知。因此,阐明ITIM/ITSM的去磷酸化调节过程,对揭示与之相关疾病的发病机制具有深远的意义。现阶段最常用的体外检测蛋白质磷酸调控的方法依旧是抗体检测,但其有一定的局限性,无法对蛋白质去磷酸化的方式、程度以及状态进行精确研究。在本文中,我们首先表达、纯化了几种常见的非受体型PTPs,同时合成了含有PD-1和PZR的ITIM/ITSM结构域的磷酸化肽段,通过MALDI-TOF基质辅助激光解吸飞行时间质谱的方式,在体外考察了PTPs对磷酸化ITIM/ITSM的去磷酸化过程。实验结果表明,PTPs对磷酸化的ITIM/ITSM的去磷酸化作用具有选择性,揭示了PTPs的底物特异性,这对于阐明含有ITIM/ITSM结构域的信号分子的磷酸化调控机制以及以其为靶点的靶向药物开发都有重大的理论意义。与传统实验方法相比,我们使用的质谱方法能更加快速、更有效、更直观地认识ITIM/ITSM去磷酸化过程,丰富了研究PTPs酶活性和生物学功能的手段。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-05-01）
张桐[7]（2018）在《蛋白质酪氨酸磷酸酶MEG1催化结构域的克隆、可溶性表达及酶学性质的研究》一文中研究指出蛋白质酪氨酸磷酸化作用是一种可逆的蛋白质翻译后修饰,受蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)和蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTPs)的共同调控,在细胞信号转导过程中发挥着极为重要的作用,它几乎调节着生物体生命活动的所有过程。人体中有38种经典的PTPs,每种PTP都具有特定的功能。PTPN4基因所编码的蛋白质为PTP-MEG1,它是PTPs家族的重要成员,主要存在于细胞膜和细胞骨架上。研究表明,在真核细胞中过量表达的PTP-MEG1通过对底物酪氨酸残基的去磷酸化进而发挥负调控作用,能够抑制细胞的增殖,减少细胞的富集程度。尽管近年来对PTP-MEG1的研究取得了一定的进展,但是我们对它的生物学功能还知之甚少,这其中一个主要的障碍就是PTP-MEG1不能在原核表达系统中可溶表达。为了解决上述问题,本文构建了含有His标签的PTP-MEG1催化结构域(△PTP-MEG1)的表达载体(pETDuet-His6-△PTP-MEG1),并在该载体中创新性地引入了一种表达产物具有肽基脯氨酰基顺反异构酶活性的FKBP-C基因序列,它有助于目的蛋白在大肠杆菌中正确折迭并增加其溶解度。同时,我们选用具有高效表达毒性蛋白能力的大肠杆菌C43(DE3)菌株作为表达宿主。实验结果表明,该表达系统极大地增加了△PTP-MEG1的可溶表达率。菌体破碎液经过Ni柱的亲和层析后,我们纯化出了高纯度的目的蛋白△PTP-MEG1。为了考查目的蛋白是否具有PTPs的性质,我们对△PTP-MEG1进行了一系列酶学表征,测定了最适温度、最适pH、最适离子强度及Km值,结果显示ΔPTP-MEG1具有与其它非受体型PTPs相似的酶学性质,这为进一步研究PTP-MEG1的生理功能奠定了基础,同时,我们还提供了一个可以提高目的蛋白可溶表达率的原核表达系统。此外,我们还应用该表达系统对蛋白质酪氨酸激酶cKIT进行了诱导表达,虽然没能正确表达出目的蛋白,但这仍是一次有意义的尝试,我们会继续改进这个原核表达系统,同时使用该系统尝试表达其它蛋白质酪氨酸激酶,以期为提高真核生物蛋白质在原核表达系统的可溶表达率做出更大的贡献。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-05-01）
刘少伟[8]（2018）在《兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备与应用》一文中研究指出在临床正畸矫治过程中,正畸牙牙槽骨在正畸矫治力的作用下发生了适应性改建,从而使正畸牙发生移动,但是在受压力侧牙周组织中会产生白细胞介素,肿瘤坏死因子α等多种因子,在一系列信号因子转导的作用下,受压侧牙根表面发生不同程度的吸收。目前,正畸学界对于牙根吸收的发生与发展机制尚未完全明了,而如何避免和减轻牙根吸收的程度是每一位正畸医生在正畸治疗过程中都应该时刻引起重视的问题。蛋白质酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatases,PTPs)是细胞内的一种调节因子,参与了许多细胞信号转导过程,其对破骨细胞的调节作用在近年来逐渐被人们所发现,在破骨细胞的分化、增殖、活化以及成熟等的过程中均有PTPs的参与。近年来,大量的研究显示破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶(Osteoclastic protein-tyrosine phosphatase,PTP-oc)在破骨细胞的分化、形成以及其活性的调节过程中均有显着的调控作用,也是生物体内骨代谢活动的重要调控因子。因此深入研究PTP-oc的功能,将会为今后在正畸牙根吸收的预防和治疗方面提供实验依据。为此本研究通过免疫家兔首次制备出了PTP-oc的兔抗多克隆抗体,为后续研究PTP-oc的功能和作用机制奠定了实验基础。本研究利用构建的p ET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至E.coliBL21(DE3)中,经鉴定后扩增转化成功的细菌,应用IPTG在16℃、24h条件下诱导重组蛋白表达,表达产物经过Q柱阴离子交换和Ni-NTA镍离子柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,并用SDS-PAGE鉴定纯化的PTP-oc重组蛋白。将纯化后的重组蛋白作为抗原和弗氏佐剂混合后免疫家兔。采用间接ELISA法检测第4次免疫后抗血清的效价,结果显示抗血清效价大于1:32 000,用Protein A琼脂糖纯化抗血清获得纯化抗体,采用Western blotting法检测经RANKL诱导第5天的RAW264.7细胞中PTP-oc的表达,检测结果显示所得抗血清可以识别诱导第5天的RAW264.7细胞中的PTP-oc蛋白,抗体有较高的特异性。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-04-01）
葛琳[9]（2017）在《蛋白质酪氨酸磷酸酶家族不可逆苯并咪唑噻唑衍生物抑制剂的发现》一文中研究指出研究背景蛋白质酪氨酸磷酸化修饰是真核细胞内信号转导的一种重要调控,动态可逆的蛋白质酪氨酸磷酸化程度由蛋白质酪氨酸激酶(PTK)和蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)协同调控。PTP在许多生理过程中发挥关键作用,调控细胞的增殖分化、迁移、细胞内代谢、免疫应答和神经活动等。异常的PTP活力可能引发多种人类疾病,如癌症或者糖尿病。PTP1B在胰岛素信号通路中起负调控作用,其活性异常与糖尿病发生有关。YopH是耶尔森菌逃避宿主先天免疫应答的重要因子;纹状体富集蛋白质酪氨酸磷酸酶(Striatal enriched tyrosine phosphatases,STEP)作为一种中枢神经系统特有的磷酸酶,对突触的可塑性、神经元的生存等具有重要调节作用。STEP功能失调有可能导致包括阿尔兹海默症在内的多种神经系统退行性性疾病。目前,PTP作为潜在的药物靶标日益引起关注。特异性调控PTP的小分子化合物不仅是应用于开发临床药物的希望所在,也可作为特定的活性探针来研究并阐明PTP在细胞内信号转导中发挥的重要作用。因此发展高效的小分子探针并深入研究其作用机制具有重要意义。研究目的通过获得纯化的STEP、LYP、PTP1B、YopH和MEG2蛋白质酪氨酸磷酸酶进行酶学分析及小分子抑制剂活性筛选的研究。材料与方法将STEP、LYP、PTP1B、YopH和MEG2蛋白磷酸酶野生型序列亚克隆到pET-15b、pET-28a和pET-22b等表达载体上,随后转化至E.coli BL21工程菌中表达,通过亲和层析和凝胶阻滞层析等技术,获得纯化的STEP、LYP等磷酸酶,并以pNPP为底物对其进行体外酶活测定,并运用连续读数法、IC50半抑制效率测定法、抑制剂酶动力学测定进行抑制剂筛选,随后通过测定抑制剂对其他磷酸酶PPM家族的选择性揭示化合物是否具.有特异性,确定化合物的作用。结果实验结果表明STEP、YopH、MEG2等磷酸酶蛋白表达成功,并可经纯化活动纯度超过90%的酶用于体外酶学实验。纯化后的STEP、YopH、MEG2等磷酸酶SDS-PAGE电泳表观分子量分别为35kDa、33kDa、38kDa等。随后,根据对STEP等磷酸酶基本酶活分析,又从化合物库中筛选出1种具明显抑制作用且结构新颖的抑制剂,小分子化合物E4以时间和浓度依赖性的方式抑制了 STEP蛋白活性。进一步研究表明,化合物E4以时间依赖性方式抑制一系列PTP,而其较少抑制或没有抑制金属依赖性蛋白磷酸酶。结论在这里,我们将化合物E4表征为一类新的PTP活性探针。通过活性依赖方式共价标记在PTP的活性位点的化学探针可以极大的促进对PTP功能研究。总的来说,这种新鉴定的PTP的共价抑制剂可以被用来作为PTP活性位点Cys的定向探针来研究PTP在细胞信号传导中的作用。(本文来源于《山东大学》期刊2017-05-24）
郁凯文,戚琳璐,刘小云[10]（2016）在《磷酸化蛋白质组学揭示沙门氏菌效应蛋白SptP磷酸酶底物及与宿主相互作用机制》一文中研究指出肠道沙门氏菌致病的一个重要机制是利用其叁型分泌系统分泌一系列毒力因子(又称效应蛋白),进而调控宿主细胞关键的信号通路。其中一些效应蛋白特异性激活宿主Rho GTPases(如Rac1),从而介导细胞骨架重排以促进沙门氏菌的入侵。而病原菌进入宿主后另一效应蛋白SptP则主要使细胞骨架恢复稳态,以降低由此产生的细胞毒性。SptP包含两个结构域,其中GAP(GTPase Activating Protein)结构域可灭活Rac1,进而阻断下游细胞骨架重排的信号转导。而SptP酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatase,PTP)结构域的作用机制(及底物蛋白)仍然不清楚。我们通过大规模磷酸化蛋白质组学分析发现PTP主要作用于Rac1下游的WAVE2复合体。因此,我们的研究首次发现了SptP两个完全不同的结构域在感染中协同作用于Rac 1-WAVE2信号通路的转导,揭示了沙门氏菌能够迅速恢复细胞骨架状态的分子机理。(本文来源于《中国化学会第30届学术年会摘要集-第四十叁分会：质谱分析》期刊2016-07-01）
蛋白质磷酸酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
PRL(The phosphatase of regenerative liver)是一种双特异性酪氨酸磷酸酶,可与酪氨酸残基和丝氨酸/苏氨酸残基相互作用使其脱去磷酸基团,PRL家族成员都携带保守的蛋白质酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatases,PTPs)催化基序,发挥去磷酸化作用。越来越多的证据表明,与早期癌症或相关的健康组织相比,PRLs在转移病灶和晚期肿瘤中表达较高,PRLs表达水平过高通常与患者预后不良相关,另外还发现PRLs在肿瘤血管生成和内皮细胞迁移中可能也起到关键性作用,但PRLs的致病机制至今尚不清楚。人体有叁种PRL,而秀丽隐杆线虫体内只有一种,这为PRL的RNAi实验操作提供了方便。之前的研究发现cPRL(Caenorhabditis elegans’PRL)在线虫L2和L3时期表达较多,cPRL RNAi后线虫的寿命明显延长,针对这一显着特征,本文以秀丽隐杆线虫为模式生物,利用RNAi技术,通过喂养表达cPRL dsRNA的E.coli HT115的方法,敲低秀丽隐杆线虫体内PRL的表达,来探究PRL调控秀丽隐杆线虫寿命的作用机制。已知线虫寿命的调控方式主要有叁种,一是抑制胰岛素信号的传递,二是激活SIR-2.1,这两条通路相互独立,通过不同的方式激活DAF-16并延长寿命,第叁种方式是通过饮食限制。已经报道cPRL RNAi之后,线虫的吞咽频率不受影响,所以接下来的研究主要从前两个方面进行。首先,cPRL在线虫L2和L3时期表达较多,可能调控线虫的发育。本文分别从孵化时期和成虫时期开始进行cPRL基因干扰,结果显示在这两种处理方式下秀丽隐杆线虫的寿命均延长,而且延长率相差不大,说明cPRL对秀丽隐杆线虫寿命的调控作用很有可能发生在成虫之后。接着,本文选用了胰岛素信号转导通路所涉及的基因daf-2、age-1、akt-1、akt-2和daf-16的突变体以及基因sir-2.1的突变体进行cPRL干扰,发现除了daf-16以外,daf-2、age-1、akt-1、akt-2和sir-2.1基因功能分别缺失的条件下,cPRL活性降低,对应突变体的寿命均可延长,而且延长率都在10%以上,因此,本文认为cPRL活性水平降低影响线虫寿命的作用与DAF-16的活性有关。针对上述情况,本研究对秀丽隐杆线虫体内DAF-16的定位情况进行观测,发现成虫后,随着时间的推移,实验组线虫体内的DAF-16进入细胞核的比例逐渐增加。因此本研究猜测,当cPRL活性减弱时,细胞质中调控DAF-16活性的通路被激活,从而引起DAF-16转移到细胞核,引发长寿相关基因的表达。细胞核内DAF-16调控的基因有很多,其中包括抗应激相关的基因。于是本文首先选用野生型秀丽隐杆线虫的幼虫和成虫分别进行热应激实验,发现cPRL基因干扰的幼虫不具有抗热应激的能力,而成虫具有抗热应激的能力。随后,紫外辐射实验发现,cPRL活性减弱不能增强成虫抵抗紫外辐射的能力。本论文通过RNAi的方式进一步探究了秀丽隐杆线虫PRL的作用机制,初步确定cPRL活性减弱延长线虫的寿命是通过调控DAF-16从细胞质转移到细胞核的方式,并且cPRL基因沉默的成虫具有抵抗热应激的能力,为进一步明确PRL在人类相关疾病中的致病机理奠定理论基础,为治疗相关的疾病提供新的药物靶点,同时也表明秀丽隐杆线虫可以作为进行PRL基础研究及其靶向药物研究的优秀生物模型。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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