细菌双组分信号转导系统中组氨酸激酶HK853的功能及其抑制剂机制研究

论文摘要

双组分信号转导系统（Two-Component Signal Transduction System,TCS）是一类主要存在于细菌中的用于感知外界信号刺激并作出应答的系统。目前已经发现总共200-300种不同的TCS,而一个细菌中包含约20种TCS。TCS蛋白的结构和功能相对保守,对于细菌的生长、繁殖和耐药等生命活动至关重要,但同时却并不存在于人类及哺乳动物细胞中,因此TCS被认为是一种潜在的新型抗菌药物靶点。常规的一个TCS由一对蛋白质组成,分别为组氨酸激酶（Histine kinase,HK）和应答调节蛋白（Response Regulator,RR）。TCS系统通过磷酸传递发挥其生物学功能,即HK蛋白感知外界信号刺激后与ATP反应并完成自磷酸化,自磷酸化完成后的HK蛋白可以将下游RR蛋白磷酸化,被磷酸化的RR蛋白会与对应的基因相结合,并调控其表达。HK蛋白不仅可以使RR蛋白磷酸化,其同时具有将磷酸化的RR蛋白去磷酸化的功能,HK蛋白通过磷酸激酶和磷酸酶的双功能,精准调控磷酸化RR的量,以完成对信号刺激的准确应答。HK蛋白作为一种多功能的酶类,针对其功能的抑制剂研究相对于RR较多,但同时由于其复杂的生物学功能,难以获得的跨膜结构,目前对于其抑制剂的详细机制研究和HK蛋白本身磷酸传递功能的研究还远远不足。因此,本文以HK853蛋白的胞内全长（HK853cp）以及CA结构域（HK853CA）作为主要研究对象,以核磁共振波谱仪为主要分析仪器,建立了用31P谱研究HK853催化ATP、ADP以及AMP相互转化的分析方法。对于反应中产生的含磷物质ATP、ADP、AMP和自由磷进行了信号归属,通过不断采集31P谱观察HK853催化ATP和ADP相互转化的速度,并以此作为HK853多功能酶活性的分析指标。同时本文对HK853CA的15N-1H HSQC谱进行了主链以及部分侧链的归属,15N-1H HSQC谱作为蛋白质的“指纹图谱”,可以帮助我们详细分析酶促反应过程中蛋白质各个氨基酸残基的变化以及整体构象的变化。通过上述实验,本文验证了黄酮类小分子木犀草素对于HK853cp自磷酸化活性的抑制,并进一步通过ITC实验定量分析了HK853cp与木犀草素的结合比例及解离常数。通过ADP和木犀草素分别滴定HK853CA的15N-1H HSQC谱图,分析了抑制剂木犀草素和ADP与HK853CA的结合对其造成的不同影响,并进一步探究了其产生抑制作用的原因。采用分子模拟获得木犀草素与11HK853CA结合的具体空间位置、结合位点及作用力,并将分子模拟结果与15N-1H HSQC滴定结果作为对比,验证了结果的可信性。最终结果表明,木犀草素通过10个氢键作用力以及一个π-π共轭作用力与HK853的CA结构域相结合,并占用了ADP与蛋白质结合的空间位置,影响了蛋白质酶活关键性区域及部分位点,同时该结合对于蛋白质的构象造成了一定的影响。基于上述原因,木犀草素可以在一定程度上抑制HK853的自磷酸化活性。本文同时通过抑菌实验,验证了木犀草素具有一定的抑菌作用。本文还应用31P NMR和ITC实验相结合的方法,通过对HK853 ATP Lid的整体突变及Y437位点的单点突变,研究了该区域及该位点对于HK853自磷酸化活性的影响。结果表明,ATP Lid对于HK853的自磷酸化活性有一定的影响,其中437位点的带电性,可能是影响HK853自磷酸化活性的重要因素之一。最后,本文发现了HK蛋白的新的酶活功能,即将ADP转变为ATP和AMP的酶活性。我们采用31P NMR与15N-1H HSQC相结合的实验方法,对于该酶活功能的关键性区域及位点进行了搜寻,对该新功能的生物学意义进行了初步的研究,并且依据实验最终推测了HK853催化ADP生成ATP和AMP的酶促反应机制。结果表明,HK853的R430、N376和K383位点对于酶促反应速率有重要的作用;DHp domain和ATP Lid对于反应速率具有一定的调控作用;降低ATP与HK853亲和力的N380A突变可以一定程度上提高酶促反应速率;而可以接收磷酸基团的H260位点的突变对于反应速率没有显著的影响。同时我们发现HK853催化ADP生成ATP反应迅速,且在仅有ADP存在情况下可以最终完成HK853→RR468的磷酸基团传递,因此,我们推测该ATP合成活性可能在细菌面对极端条件下发挥作用。最终,本文推测HK蛋白催化的反应为2ADP→ATP+AMP,其中一分子ADP断裂高能磷酸键,释放能量和磷酸基团变为AMP,另一分子ADP接收磷酸基团并合成高能磷酸键而生成ATP。综上所述,本文对于HK853自磷酸化抑制剂木犀草素的抑制机制进行了细致的研究,并且对HK853的自磷酸化功能及新功能—ATP合成功能进行了初步研究。本文研究结果对于后续针对HK蛋白的抑制剂开发提供了一定的实验基础,也对今后针对HK蛋白本身的功能研究,尤其是HK蛋白的ATP合成功能研究提供了一个很好的开端和方向。

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摘要

Abstract

缩略语表

第1章绪论

1.1 双组分信号转导系统介绍

1.1.1 双组分信号转导系统功能机制

1.1.2 HK蛋白的结构与功能

1.1.2.1 Sensor domain及transmembrane domain的结构与功能

1.1.2.2 Linker domain的结构与功能

1.1.2.3 DHp domain及CA domain的结构与功能

1.1.3 RR蛋白的结构与功能

1.1.3.1 Receiver domain的结构特点

1.1.3.2 Effector domain的结构特点

1.1.4 针对TCS的抑菌剂研究进展

1.2 木犀草素介绍

1.2.1 木犀草素的抗氧化作用

1.2.2 木犀草素的抗菌及消除耐药作用

1.2.3 木犀草素的抗炎作用

1.2.4 木犀草素的抗肿瘤作用

1.2.5 木犀草素的其他药理作用

1.3 ATP合成酶介绍

1F_O-ATP合成酶的结构和功能'> 1.3.1 F₁F_O-ATP合成酶的结构和功能

1F_O-ATP合成酶的结构和功能'> 1.3.2 F₁F_O-ATP合成酶的结构和功能

1V_O-ATP合成酶的结构和功能'> 1.3.3 V₁V_O-ATP合成酶的结构和功能

1.3.4 ATP合成酶特点总结

1.4 核磁共振介绍

1.4.1 核磁共振波谱仪的介绍

1.4.2 常见的核磁共振观测参数

1.4.3 常见的核磁共振实验

1.4.4 常用的核磁共振基本参数

1.5 等温滴定量热实验介绍

1.6 主要研究内容

cp、HK853^CA等蛋白质及突变体的表达'>第2章组氨酸激酶HK853^cp、HK853^CA等蛋白质及突变体的表达

2.1 前言

2.2 试剂与仪器

2.2.1 实验试剂

2.2.2 实验仪器

cp、HK853^CA及其突变体蛋白质表达前准备'> 2.3 HK853^cp、HK853^CA及其突变体蛋白质表达前准备

cp、HK853^CA及其突变体的重组质粒构建'> 2.3.1 HK853^cp、HK853^CA及其突变体的重组质粒构建

2.3.2 不同突变体的引物设计

2.3.3 PCR扩增目的片段

2.3.4 酶切、质粒提取及转化

cp、HK853^CA及其突变体的表达'> 2.4 HK853^cp、HK853^CA及其突变体的表达

2.4.1 非标蛋白的表达

15N/¹³C单标/双标蛋白的表达'> 2.4.2¹⁵N/¹³C单标/双标蛋白的表达

cp、HK853^CA以及其突变体的纯化'> 2.5 HK853^cp、HK853^CA以及其突变体的纯化

cp及其突变体的纯化'> 2.5.1 HK853^cp及其突变体的纯化

CA及其突变体的纯化'> 2.5.2 HK853^CA及其突变体的纯化

2.6 RR468的表达及纯化

2.6.1 RR468蛋白的表达

2.6.2 RR468蛋白的纯化

cp的纯化及表达'> 2.7 EnvZ^cp的纯化及表达

cp蛋白的表达'> 2.7.1 EnvZ^cp蛋白的表达

cp蛋白的纯化'> 2.7.2 EnvZ^cp蛋白的纯化

2.8 结果与讨论

cp蛋白表达纯化结果'> 2.8.1 HK853^cp蛋白表达纯化结果

CA蛋白表达纯化结果'> 2.8.2 HK853^CA蛋白表达纯化结果

2.9 结论

CA的主链及侧链归属'>第3章组氨酸激酶HK853^CA的主链及侧链归属

3.1 前言

3.2 试剂与仪器

3.2.1 实验试剂

3.2.2 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 反应条件

3.3.2 NMR实验

CA的主链及侧链归属'> 3.3.3 HK853^CA的主链及侧链归属

3.4 结果与讨论

3.5 结论

第4章木犀草素对HK853自磷酸化活性抑制作用机制研究

4.1 前言

4.2 试剂与仪器

4.2.1 实验试剂

4.2.2 实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 NMR实验方法

4.3.2 ITC实验方法

4.3.3 分子模拟方法

4.3.4 抑菌试验方法

4.4 结果与讨论

31P NMR实验结果'> 4.4.1³¹P NMR实验结果

31P NMR分析方法的可行性分析'> 4.4.1.1³¹P NMR分析方法的可行性分析

31P NMR分析Lut的抑制活性'> 4.4.1.2³¹P NMR分析Lut的抑制活性

4.4.2 ITC定量分析木犀草素与HK853的亲和力

15N-¹H HSQC滴定分析木犀草素对HK853^CA的影响'> 4.4.3¹⁵N-¹H HSQC滴定分析木犀草素对HK853^CA的影响

4.4.4 分子模拟结果

4.4.5 结构类似黄酮类物质功能验证

4.4.6 木犀草素等物质的抑菌作用分析

4.5 结论

第5章 HK853 ATP Lid对自磷酸化活性影响的研究

5.1 前言

5.2 试剂与仪器

5.2.1 实验试剂

5.2.2 实验仪器

5.3 实验方法

15N-¹H HSQC实验方法'> 5.3.1¹⁵N-¹H HSQC实验方法

5.3.2 ITC实验方法

31P谱实验方法'> 5.3.3³¹P谱实验方法

5.4 结果与讨论

15N-¹H HSQC实验结果'> 5.4.1¹⁵N-¹H HSQC实验结果

5.4.2 ITC定量分析突变对亲和力的影响

31p NMR分析突变对HK853自磷酸化活性的影响'> 5.4.3³¹p NMR分析突变对HK853自磷酸化活性的影响

5.5 结论

第6章 HK853的ATP合成功能的研究

6.1 前言

6.2 试剂与仪器

6.2.1 实验试剂

6.2.2 实验仪器

6.3 实验方法

31P谱实验方法'> 6.3.1³¹P谱实验方法

15N-¹H HSQC实验方法'> 6.3.2¹⁵N-¹H HSQC实验方法

6.4 结果与讨论

CA反应³¹P NMR实验结果'> 6.4.1 ADP与HK853^CA反应³¹P NMR实验结果

15N-¹H HSQC实验观察ADP与HK853^CA的反应'> 6.4.2¹⁵N-¹H HSQC实验观察ADP与HK853^CA的反应

CA和HK853^cp与ADP反应速率对比'> 6.4.3 HK853^CA和HK853^cp与ADP反应速率对比

H260A和HK853^cp与ADP反应速率对比'> 6.4.4 HK853^H260A和HK853^cp与ADP反应速率对比

6.4.5 HK853 ATP Lid突变对HK853与ADP反应的影响

CA四种突变体（已知影响激酶功能）与ADP反应结果'> 6.4.6 HK853^CA四种突变体（已知影响激酶功能）与ADP反应结果

6.4.7 HK853自磷酸化活性与ATP合成活性对比

6.4.8 基于ADP的HK853→RR468磷酸传递实验结果

6.4.9 HK家族其他蛋白质与ADP反应结果

6.4.10 HK蛋白是否是一种无差别的“磷酸键加工厂”?

6.4.11 HK蛋白合成ATP机制推测

6.5 结论

第7章总结和展望

7.1 总结

7.2 展望

参考文献

附录A 氨基酸中英文对照表

附录B 常用培养基配方及配制过程

附录C 电泳实验中所用到的配方及配制过程

致谢

作者简历及攻读博士学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 周元

导师: 姜凌

关键词: 双组分信号转导系统,核磁共振,抑制剂,木犀草素,自磷酸化,合成

来源: 中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所)

分类号: Q936

总页数: 127

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细菌双组分信号转导系统中组氨酸激酶HK853的功能及其抑制剂机制研究

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