新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶挖掘及其生物转化应用

论文摘要

α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase,E.C.3.2.1.40）是一类糖苷水解酶,可通过专一性水解黄酮类化合物末端的α-L-鼠李糖基从而提高其生物利用率及生物学活性。α-L-鼠李糖苷酶作为一类生物催化剂,有广泛的应用前景。目前已表征的细菌源GH78家族α-L-鼠李糖苷酶仅有19个,有关其在生物催化应用方面的报道主要集中在真菌,因此,新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶资源的挖掘及其对天然黄酮糖苷的生物转化研究具有重要意义。本研究首先利用基因组信息挖掘新酶发现策略,从解肝磷脂土地杆菌基因组中得到三个α-L-鼠李糖苷酶基因PhRha78D、PhRha78E和PhRha78G,通过传统的双酶切连接法构建于表达载体pET-28a,转入大肠杆菌BL21（DE3）进行异源表达,SDS-PAGE及酶活检测结果表明,PhRha78D、PhRha78E、PhRha78G大部分以催化活性包涵体形式异源表达。PhRha78D酶活力较低,仅对PhRha78E和PhRha78G进行了酶学特性研究,二者的最适pH分别为6.5和7.0,但最适反应温度却相差很大,分别为60oC和40oC;动力学常数KM分别为0.55和0.4 mM,kcat分别为0.18 s-1和0.12 s-1;PhRha78E的T50为51℃,在40-50℃孵育30 min后还有59%以上的活性,而PhRha78G的T50为36℃,20-36℃热失活30 min仍有50%以上的残余活力;有机溶剂耐受性显示,二者均可耐受1%低浓度的有机溶剂。第一种策略获得新酶的催化活性不可预测,可溶性表达不可控。基于此引入第二种策略—宏基因组高通量测序结合催化关键基序虚拟筛选的新酶发现策略,利用该策略从人粪便宏基因组中获得三个目标候选酶基因HFM-RhaA、HFM-RhaB和HFM-RhaC,密码子优化与全基因合成后,利用新颖的无缝克隆技术构建重组质粒。在大肠杆菌中异源表达后,SDS-PAGE表明,三者大部分以可溶性形式表达于上清中,利用镍柱亲和纯化后进行了酶学性质表征,三个酶的最适pH分别为6.0、6.0、5.7,最适温度分别为40 oC、60oC、40oC;HFM-RhaA和HFM-RhaC的KM均很小,分别为1.59 mM和0.053 mM,最大反应速率分别为57.6μmol min-1mg-1和37.6μmol min-1mg-1,kcat分别为92.8 s-1和62.9 s-1;HFM-RhaA和HFM-RhaC的T50分别为35℃和28℃;HFM-RhaA对5%甚至10%的醇类有机溶剂有很好的耐受性,而HFM-RhaC仅对5%的醇类有机溶剂有较好的耐受性。对酶学性质有一定的了解后,进一步探究了HFM-Rha对芦丁和柚皮苷的生物转化情况。HFM-RhaA可以高效水解芦丁和柚皮苷,但水解柚皮苷的效率更高效,30μg/mL的HFM-RhaA催化水解柚皮苷时,88.6%的底物转化为樱桃苷,而120μg/mL的HFM-RhaA水解芦丁时,转化率达80.8%。200μg/mL HFM-RhaB水解柚皮苷120min,转化率达58.8%,但对芦丁几乎没有活性。HFM-RhaC对芦丁和柚皮苷的催化活性较好,180μg/mL的HFM-RhaC水解芦丁和柚皮苷120 min时,转化率分别为66.1%和49.2%。本研究提供了获得高概率活性的新酶资源挖掘策略,获得了具有自主知识产权的新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶资源,并对黄酮类化合物进行了生物转化研究,对下一步酶法或全细胞法生物转化天然来源的黄酮类化合物具有指导作用。

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ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 α-L-鼠李糖苷酶

1.1.1 α-L-鼠李糖苷酶简介

1.1.2 α-L-鼠李糖苷酶生物转化应用

1.2 土壤细菌与肠道细菌

1.2.1 土壤细菌

1.2.2 肠道细菌

1.3 新型酶资源挖掘策略

1.3.1 基因组信息挖掘新酶发现策略

1.3.2 基于宏基因组高通量测序技术挖掘新酶资源

1.4 本研究的目的和意义

第二章基因组信息挖掘新酶发现策略

2.1 实验材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 培养基

2.1.3 工具酶、试剂盒和试剂

2.1.4 仪器

2.2 实验方法

2.2.1 基因组信息挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶

2.2.2 新型α-L-鼠李糖苷酶的基因克隆

2.2.3 新型α-L-鼠李糖苷酶的异源表达与催化活性检测

2.2.4 新型α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质表征

2.3 实验结果与分析

2.3.1 基因组信息挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶

2.3.2 新型α-L-鼠李糖苷酶的基因克隆

2.3.3 新型α-L-鼠李糖苷酶的异源表达与催化活性检测

2.3.4 新型α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质表征

2.4 实验小结与讨论

第三章宏基因组高通量测序结合催化关键基序虚拟筛选的新酶发现策略

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 宏基因组高通量测序结合催化关键基序虚拟筛选的新酶发现策略挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶

3.2.2 新型α-L-鼠李糖苷酶的基因克隆

3.2.3 新型α-L-鼠李糖苷酶的异源表达与亲和纯化

3.2.4 新型α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质表征

3.3 实验结果与分析

3.3.1 宏基因组高通量测序结合催化关键基序虚拟筛选的新酶发现策略挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶

3.3.2 新型α-L-鼠李糖苷酶的基因克隆

3.3.3 新型α-L-鼠李糖苷酶的异源表达与亲和纯化

3.3.4 新型α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质表征

3.4 实验小结与讨论

第四章 HFM-Rha对天然黄酮糖苷的生物转化研究

4.1 实验材料

4.1.1 标准品

4.1.2 试剂

4.1.3 仪器

4.2 实验方法

4.2.1 α-L-鼠李糖苷酶生物转化天然黄酮糖苷测定方法

4.2.2 α-L-鼠李糖苷酶生物转化芦丁

4.2.3 α-L-鼠李糖苷酶生物转化柚皮苷

4.3 实验结果与分析

4.3.1 α-L-鼠李糖苷酶生物转化芦丁

4.3.2 α-L-鼠李糖苷酶生物转化柚皮苷

4.4 实验小结与讨论

总结与展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简况及联系方式

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张甜

导师: 李彬春

关键词: 鼠李糖苷酶,家族,基因组挖掘,催化关键基序,黄酮糖苷的生物转化

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山西大学

分类号: Q55

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000135

总页数: 101

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